Eksamen i emnet KJ 2053; KROMATOGRAFI

Transkript

1 NTNU NORGES TEKNISK- NATURVITENSKAPELIGE UNIVERSITET INSTITUTT FOR KJEMI Kandidat-nr.:... Antall sider vedlagt i tillegg :... Faglig kontakt under eksamen: Institutt for kjemi; F.-Aman. Rudolf Schmid Tel , (evt. M.: ) Eksamen i emnet KJ 2053; KROMATOGRAFI Fredag 2. juni 2017, kl (4 timer) Bokmål Med rettelser Med Svarideer Skriftlig svar på oppgavene 1 7 skal gis på oppgavearkene bak som skal innleveres (bruk ekstra ark om nødvendig) Hjelpemidler: D Ingen trykte eller håndskrevne hjelpemidler tillatt. Bestemt (godkjent) enkel kalkulator tillatt med tomt minne. Dette oppgavesett består av 15 - femten - sider : 2 forsider (s. 0-1), 13 sider med 7 oppgaver (s. 2-14). Vektingen av hver (del-)oppgave er oppgitt. Maks. poengtall er 103. Karakterskalaen (100%) tar utgangspunkt i 100 p. Det er tillatt å levere besvarelsen på vanlig svarark (med gjennomskriv-kopi). Det bør ikke svares med blyant på oppgavearkene, fordi du ikke kan ha med deg gjennomslag av svarene dine (ikke får din sikkerhetskopi). Denne oppgaveteksten vil bil tilgjengeliggjort (lastet opp på It s Learning) rett etter eksamen. Sign... Rudolf Schmid Eksamensansvarlig faglærer Oppgavesettet er kontrollert : Sign. Susana V. Gonzalez Sensor Sensurdato : Fredag,

2 Eksamen KJ 2053 / 2017 Vår bokmål ( ) Side 2 av 17 Oppgave 1. ( = 23 p.) 1.a) Skriv ned formelen til den forenklede "van Deemter-ligningen", (1+8p) (i) h = A + B/u + C u = A + B/u + CMF u + CsMF u + CSF u (= HE + HL + HMF + HCsMF + HSF ) el. evt. h = B/u + ( 1/A + 1/(C u) ) -1 (her oppfyller 3-ledds-versjonene minimalkravet) og benevn og forklar kort leddene i ligningen. (ii) A = Eddy Diff. Båndspredning pga ulike veivalg i kol.-pakningen (iii) =ca dp dp =Partikkeldiameter B/u = bidrag fra Longitudinal diffusjon = cb Dx,MF Spredn. pga vanlig diff. fra høy kons.-sone ut i MF/SF, lav kons. Dx,MF = Diff konst av (iv) eller oppdelt : CMF = bidrag fra masse-transfer/-transport i mobil fase = cmf dp 2 / DMF (v) CsMF = bidrag fra massetransfer i stillestående mobil fase = csmf dp 2 / DMF (vi) CSF = bidrag fra massetransfer i stasjonær fase = csf dp 2 / DSF Dx,MF = Diff.-konst. av analytt X I SF 1.b) (i) Gi fullt navn på de følgende parameterene, og gi en formel som viser (2 p.) sammenhengen dem imellom. k, t R og t 0. k = retensjonsfaktor, t R = justert retensjonstid, t 0 = MF-oppholdstid, el. t Rr av ikke- retardert stoff, el. «dødtid» ; t R = (t R -t 0 ) k = t R / t 0 t R = retensjonstid (ikke-justert).. N og R S? N = platetall, N = ( t R / σ ) 2 = = 16 ( t R / w b ) 2 = 5,54 ( t R / w h ) 2, Rs = Krom. Oppløsning, Rs = ( ΔtR / (0,5 (wb,1 + wb,2)) = 1/4 N 1/2 (k/(1+k)) ((α-1)/α) ( =1/4 Neff 1/2 ((α-1)/α) ) (ii) Gi fullt navn på parameterene, og hva som er minimumsverdiene, for R F og EOF. (1 p.) 0 < R F -.. < EOF Navn: RF-verdi, (retarderingsfaktor).. elektroosmotisk mobilitet.

3 Eksamen KJ 2053 / 2017 Vår bokmål ( ) Side 3 av 17 1.c) (i) (2 p.) Tegn en skisse av en "van Deemterkurve" (bruk som eksempel pakket kolonne gasskromatografi. og / eller kombin. med (vd.-enekelt-term-bidrag eller alternative gasstyper er ikke nødvendige) Y = h el. H Spesifiser hva x- og y- aksen representerer). van Deemter-kurve for GC X = u (el. evt. F) (ii) Hvis kurven du tegnet ovenfor (1.c)(i) ) skal representere en pakket GLC- (2 p) kolonne, hvordan ville en kurve for en WCOT- kolonne (kapillær-glc-kolonne) være? (Kryss av, og grunngi kort.) Omtrent den samme Eller ulik og. på y-aksen, høyere? lavere? X på x-aksen, mer til venstre mer til høyre? (x) Kurven er flatere X... er brattere? H deles opp og : A fosvinner, medfører senkng av kurven (y-lavere) B-bidrag er avhenigg av MF og retensjonstider (som justeres vanligivs innenfor omtrent samme tids-område) liten endring. C SF blir mindre p.g.a. jevnere tynnere SF-filmer stigning mot høyre blir flatere og minimum noe lavere (og littegrann til høyre (?)). C MF -termen endrer ikke seg stort (kanskje litt større (?), men C smf forsvinner). (2 p) (iii) Hvilke molekylære vekselvirkninger/interaksjoner er viktigst i følgende kromatografityper mellom en typisk analytt og nevnte fase? α β γ δ Type fase Ionebytterkromatografi-SF Hydrofilisk interaksjonskro.- (HILIC-)SF Omvendt-fase (RP-) væskekromatografi-sf Gasskromatografi- (GLC-) mobilfase (-MF). Viktigst(e ) vekselvirkning(er)/intermolekylær kraft Elektrostatisk vekselvirkning mellom ladningene (fast ion analyttion ) Normalfase væske-væske-fordeling mellom mer polar SFfilm og mindre polar MF «bulk»-væske: i SF: dipol-dipol-v.v. og hydrogenbindinger med vannet i HILIC-SF (i tillegg litt v.v.med paknings-materialet: elektrostatiske hvis ionisk/zwitterionisk bæremat., evt. litt adsorpsjon) «Hydrofobe v.v. (dispersjon, dipol-indusert-dipol v.v.). Fortrenging ut av polare MF (med sterke dipolare v.v. eleunetmolekylene imellom) Ingen: det forutsettes ideal-gass: ingen intermolek. v.v.

4 Eksamen KJ 2053 / 2017 Vår bokmål ( ) Side 4 av 17 Figur 1 : Et simulert kromatogram. 1.d) I Figur 1 ovenfor er det vist et simulert kromatogram (4 p.) (i) Når du antar at toppen ved 60 s (1 min, topp A) er et ikke-retardert stoff regn ut : oppgi formelen brukt Gi tallverdi α) platetallet til topp A (tr= 60s) og effektiv platetall til A, N = 16 (t R /w b ) 2 = 5,54 (t R /w h ) 2 = 5,5x(1 / 0,25) 2 =5,5x(60 / 15) 2 =5,5x(2/0,4) 2 (eller in mm) = 5,54(20 / 3,5) 2 Neff = 16 (t R /w b ) 2 t R = t 0 = t R = 0 Altrenativt: Neff= N (k/(1+k)) 2, og der led 2=0, fordi k = 0 (jfr. (iii)) = = 0 β) retensjonsfaktor topp B (tr= 150s) k = (t R -t 0 ) / t 0 = (150-60) / 60 = 1,5 og separasjonsfaktor for A og B, k1 = (t R,A -t 0 ) / t 0 = (t 0 - t 0 ) / t 0 = 0 α = k 2 / k 1 ; dividere med 0 γ) oppløsningen mellom toppene B R s = ( Δt R / (0,5 (w b,1 + w b,2)) og C, = 30 /0,5 (30+30) = ikkedef. = 1,0 δ) asymmetrien i topp D (tr=300s) A S =w 0,1,hale / w 0,1,front =b/a= 11/6,5(mm) = 1,7 & oppgi type asymmetri, og isoterm for topp D. type Asymmetri-type? Haledannelse / tailing Isoterm-type? konveks isoterm el. Langmuir-isoterm (ii) Det sies at effektivitet til kromatografisystemer blir bedre når partiklene til pakningsmaterialet blir mindre. (1 p.) Når du ser på topp A, den ikke-retarderte: hvilke(t) av ledd(ene) i van Deemter -likningen bidrar til dens sonespredning, og hvordan innvirker partikkelstørrelsen på de(t) aktuelle leddet/leddene? Alle spredningsprosesser som invovlerer retensjon og SF er ikke-aktuelle toppen er ikke retardert : CSF uaktuell. B: Longitud.Diff.:bidrar til spredning av ikke-retardert stoff; B er uavhengig av partikkelstørrelse. A : Eddy-diff.: bidrar til spredn.: A er avh.av partikkelstørrelse: mindre partikler - smalere topp. CMF : bidrar noe (!) selv uten retensjon (overganger til SF): foregår inne i MF diff. mellom raske og sakte områder i MF: mindre partikler kortere diff.-lengder - smalere topp (jfr. 1.a)). CsMF : bidrar også : - ditto : ditto. (Partikkelstørrelses-avhengighet: for A i teorien: toppbreddebidrag (i sec eller cm) minker omtrent med dp 1/2, for CMF og CsMF: bidraget minker omtrent med dp ; bidraget uttrykt som H hhv. med dp og dp 2 (dette er ikke krevd i svaret)).

5 Eksamen KJ 2053 / 2017 Vår bokmål ( ) Side 5 av 17 Oppgave 2. (5+4+7,5+ 1 Bonus = 16,5p.) 2.a) Figur 2: HPLC-separasjon av basiske analytter. Toppene 1, 3 og 4 i Figur 2 er de følgende 3 xanthin-forbindelsene: (i) Med informasjonen gitt i Figur 2, oppgi hvilken type kromatografi/ separasjonsmekanisme som er brukt her? (1 p.) Pakningsnavnet : Extend-C18 - tyder på oktadekylsilika som er standard-sf for RP-HPLC; MF sammensetningen også godt egnet for RP-LC. (2 p.) (ii) Tilordne de tre strukturene til toppene 1, 3 og 4, og forklar rekkefølgen du har valgt. Antatt det er RP-HPLC : Mest upolar stoff retarderes mest: Xantin-strukltur felles. Forskjellen er ulik grad (og sted) for metylerring, som fører til mer hydrofobe egenskaper av analytten.. trimetylert: kaffein (Caf) forventes mest retardert. Dimetylert: både Tpl og Tbr. Blant de mest polare gruppene i xantin-skjelletet er amid- og imid-gruppen (i 6-ringen), litt mer polar enn aminene (i 5-ringen). Da har Tpl metylert både amid og imid i 6-ringen, og Tbr har imid-gruppen usubstituert, selv om amin-n i 5-ringen er metylert: Tbr er dermed mer polar. Forventet tilordning: Topp 1 : Tbr ; topp 3 : Tpl ; topp 4 : Caf ; Tilordning av 1 og 3 er litt mer vanskelig, top 4 er ganske klar) (Høyest uttelling for Caf =4,rel. lite trekk om feil 1&3; forsøk på rimelig (om enn feil) begrunnelser godskrives) (iii) Gi navnet til detektoren brukt her. Ved ca. 1,4 min opptrer et litt merkelig «signal». (2 p.) Hva betyr signalet, og hvordan oppstår denne typen signal (i denne detektoren)? Opplysningen i info: «Detector 254 nm» og der er en RP-HPLC-detektor: Dette indikerer en UV-detektor er i bruk. Med de kolonnediomnesjonene og den MF-strømmen er 1,4 min ca. ved «dødtiden» - så «signalet» kan evt. være markeringen av MF-oppholdstiden f.eks. gjennombruddet av prøve-løsningsmiddlet ( dens mest polare del). Signalet er negativ: betyr at detektoren detekterer MER lys enn når bare MF eluerer: det er to forklaringer (der en eller begge kan være aktuelle): - prøveløsningmiddel-sonen har lavere absorbanse enn MF en selv og slipper da forbigående mer lys gjennom cellen;

6 Eksamen KJ 2053 / 2017 Vår bokmål ( ) Side 6 av 17 - prøveløsningmiddel-sonen har en annen brytningsindeks enn MF og endrer derfor «lysfokuseringen» av lyset (som fokuseres fra monokromatoren via detektor-cellen) på lysdetektorern (lys-dioden). I dette tilfelle forbedrer åpenbart lysfokuseringen seg i cellen når prøve-løsningsmiddelet passerer den, og vi ser forbigående mer lys på detektoren (som ikke kan skille om intenstitets-endring skyldes endret absorbanse eller endret brytningsindeks/lysfokusering). (UV-det = 0,7, t0-indikator = 0,7 ; forklaring =0,6-) 2.b) Figur 3: HPLC-analyse av kommersiell vanillin-ekstrakt ( i 40% etanol). (2 p.) (i) Toppene 3 og 4 er vanillinsyre VS og vanillin, VA. Hvilken av toppene 3 og 4 i Figur 3 er hvilket stoff? Forklar kort. Pakningsnavnet : Acclaim 120-C18 : - tyder på oktadekylsilika som er standard-sf for RP-HPLC; MF sammensetningen også godt egnet for RP-LC. Forventet: Mest upolar stoff retarderes mest: De 2 strukturene er identiske, med unntak av aldehyd-gruppen i vanillin som blir til karboksylsyregruppe i vanillinsyre. Syregrupper er normalt mer polare enn aldehydgrupper. I fortynnet edikksyre (polar del av MF-blandingen) vil en aromatisk karboksylsyre bli overveiende (men kanskje ikke komplett) protonert (pka ca. 5-6 for bensosyre). Dermed forventes retensjonen en del (men ikke dramatisk) mindre for vanillinsyre enn for vanillin. topp 3 : VS ; topp 4 : VA. (ii) Hvis du ønsker å optimere HPLC-betingelsene for LC/ESI-MS*, og derfor gjennomfører analysen med ammoniumacetat-buffer (ph i vann 7) i stedet (1 p.) for fortynnet eddiksyre i MF, kommer retensjonstidene til å endre seg? Hvis ja, for hvilke(t) stoff, og i hvilken retning? RP-HPLC; vi går fra lav ph (kanskje ca. 3-4 «i vanndelen» av MF) til en vannfase bufret omkring nøytral, og ved denne ph vil en karboksylsyre bli for en betydelig del (om enn ikke komplett) bli deprotonert og få mye lavrere retensjon på i RP-LC enn ved lav ph. Den svakt sure phenolgruppen på (både) vanillinsyre og vanillin vil derimot trolig fortsatt være langt på vei protonert (pka for fenoler omkring 9-10) og vill ikke bidra til noen vesentlig endring av retensjonen. Dermed: VA (vanillin) : en lignende retensjon ved LC/MS-elueringsbetingelsers, VS (vanillinsyre) : klart redusert retensjon p.g.a. betydelig deprotonering og økt polaritet.. * LC/ESI-MS: Koblet væskekromatografi (LC) og massespektrometri (MS) med elektrospray-ionisering (ESI).

7 Eksamen KJ 2053 / 2017 Vår bokmål ( ) Side 7 av 17 (i) Det I Figur 3 er det utelatt noe informasjon om de brukte kolonnene i A og B (1 p.) som var med i originalfiguren. Hvilke(n)parameter(e ) om kolonnene, som er forandret endret fra kromatogram A til kromatogram B, er her fjernet/ klippet bort fra informasjonen i Figuren. Forklar hvordan denne endringen gir det viste resultat? Kromatogrammene har lignende toppmønster, lignende oppløsning/lignende effektivitet men tidforbruket er svært forskjellig - B mye raskere; Dermed er BEGGE kolonner RP-LCtype. A-kolonne er en ganske standard kolonne 15 cm lang, 5 um partikler 1 ml/min flow. B-kolonna har mindre flow men mye kortere retensjonstider Dermed må kolonne B være mye kortere eller/og en del tynnere for å få det til. For å oppretholde omtrent samme effektivitet ved 6 x kortere retensjonstider på A-kolonnepakningen må hastigheten økes 6 x som ville gitt veldig høyt trykk ved samme kol.-lengde, eller kolonnen kortes ned ved tydelig tap av platetall/oppløsning. Trolig blir det brukt mindre partikler i kortere (og litt trangere) kolonne her - muligens UHPLC partikkelstørrelse (eller core-shell-pakningsmaterial) for å kunne opprettholde god effektivitet ved høyere hastighet og en noe kortere kolonne. Fasit fra den fjernede delen av figuren: (Acclaim RSLC C18,) 2 m, 21, x 50 mm (tall for en relativt klassisk UHPLC-kolonne). 2.c) (i) Hva er den mest benyttede stasjonærfasen (SF) ved omvendt fase (RP) HPLC, (3 p.) angi spesifikt navn og representativ delstruktur. Navn: oktadekylsilika, C18-silika, (mindre bra: RP-18, silika-c18) enda mindre 'C18',.(0,5 p.). Struktur: Brukbart, (men ikke helt full pott, f.eks. 2,5?) Silika O Si(R ) 2 n-c 18 H 37 (R er oftest metyl) silika O R Si R eller (best, og med minst én uderivatisert OH, end-capping ikke påkrevd) H 3 C n-c O Si H O Si O Ikke : CH 3 O O H Si O H 3 C O CH 3 Si O Si O CH 3 O O Si O H O O Si CH 3 Si O O n-c 18 H 37 CH 3 O Si O O H Struktur-del: 2,5 p. Bare 1,5 p. (m. end-cap. 1,75) Ikke : Bare 0,7 p.

8 Eksamen KJ 2053 / 2017 Vår bokmål ( ) Side 8 av 17 (Feil-varienter i alkyl-si-binding bør straffes rimelig hårdt : dette er anonsert som eksamens-aktuell og forhånds-spurt i midtsemester-test). (men et lite problem her er at figuren(e ) i Lundanes &al. ikke er helt tilfredsstillende, jfr. feil-listen ) (ii) Skisser strukturen (og angi navn) til den stasjonære fasen vi brukte i våre gass- (2 p. ) kromatografi-forsøk på lab.-øvingene (og som er den mest vanlige SF i GLC). med m=95 % (dimetyl) / n=5% (difenyl) (i tilfeldig fordeling) i kjeden (mulige navn : metyl-silikon m. 5 % fenyl, PDMS m. 5 % fenyl evt. TR-5, Equity-5, DB-5, ) Hvis noen alternativt - nevner dimetylfenylen-alternativet (istendenfor difenylmonomeren) så bør det gi full uttelling. Nær slektning til en (ren) metyl-silikon: PDMS = PolyDiMetylSiloksan (også PolyDiMetylSilikon ) H CH 3 C O O 3 Si Si n Si CH 3 H 3 C CH3 H 3 C CH CH 3 3 (PDMS: litt trekk i forhold til helt korrekt - nesten akseptert som "godt nok for full pott: (1,5 p.?)) (OBS.1: Se Lundanes-bok, s. 38: feil (?!) i fenyl oligomer-delen: fenyl-holdige monomer er oppgitt som metylfenyl-silikon, og ikke, som i de GC-kolonne-katalogene jeg har sjekket, difenyl-silikon). Ikke oppdaget før nå - og ikke varslet om ennå - må godkjennes som korrekt i eksamenen denne gangen) (OBS.2: i nyere års eksamens-svarforventninger (f.eks. H 2016 & 2014) : i fenylsilikon-monomerenheten var en av fenyl-substituentene skrevet med formelen C5H3 (den andre var korrekt, med C6H5). Nye rettede og 2014-løsningsforslag er opplastet nå på ItsL. Om feil formel er brukt i besvarelsen i år blir svaret likevel godkjent! (iii) Hvilken stasjonær fase brukte vi ved TLC-lab.-forsøket, og hvilken klasse av separasjonsmekanisme benyttet vi oss av. (1,5 p.) I vårt TLC-lab.-forsøk ble silika (silikagel) brukt som SF, og organiske løsningsmidler som MF. av separasjonsmekanisme-«klassen» er derfor : NP-LSC - normal fase adsorpsjonskromatografi (væske-faststoff-kro.). (ii)(iv) BONUS : (1 p.) (1 p.) Hvilken stasjonærfase brukte vi ved kapillærelektroforese-lab.-forsøket? Forklar kort svaret ditt. I vårt CE-forsøk fantes ikke noe SF: elektroforese, inkludert CZE, er ikke kromatografi og har derfor hverken SF eller MF. (god elektroosmose-forklaring ga 0,3p)

9 Eksamen KJ 2053 / 2017 Vår bokmål ( ) Side 9 av 17 Oppgave 3. (6+3 = 9 p.) 3.a) (i) Hvilke ønskede egenskaper (nevn 3) bør en stasjonær fase for gass-væske- (2 p.) kromatografi, GLC, ha? - lite flyktig, lavt damptrykk (for å unngå blødning) - inert (ikke reagere med prøven, bæregass, pakningsmaterial; termisk, kjemisk stabil). - (rimelig) gode løselighetsegenskaper for analyttene (ii) Hva er fordeler og ulemper ved bruk av hhv. N2 og H2 som bæregass (og (2 p.) sammenlign de to)? N2 : fordeler: størst eff. ved optimum, -billigere, inert ulemper: bratt vd-kurve (H øker raskt v/endret flow), (uopt. N2 < uopt. H2) lengre anal.tider H2 : fordeler: flat vd-kurve ( --- lite ) ( ) kortere anal.tider ulemper: lavere eff., litt dyrere, brann/eksplosjonsfarlig (teoretisk reaktiv v- katalyse) (iii) Hvilken av de to gassene i spørsmålet ovenfor brukes helst som bæregass ved (1 p.) kapillær-gasskromatografi? Hvorfor? H2: høyere flow / raskere analyser, Kan evt. genereres fra vannelektrolyse «ad hoc» (sikkerhetsgevinst lite volum «på lager» og ikke på høyt trykk) (1 p) (iv) Hvilke egenskaper gjør at de nedenforstående gassene (nesten) aldri benyttes som bæregass i GC? - metan : konflikt med FID gir STORT bakgrunnsignal, brannfarlig. ikke spesiellt «rask») - oksygen : Oksyderende (særlig ved høye temperaturer) - ødelegger SF ene - xenon : Veldig dyr (edelgass, sjelden), 3.b) Beskriv kort (bruk en skisse) injektoren og injeksjonsteknikken (fremgangsmåten) for en splitløs-injeksjon. Brukes den for pakkede, for kapillær-kolonner eller for begge? (3 p.) (Bør spesifiseres som splittløs for kapillærlkolonner i spørsmålert) Splitløs-injeksjon: - GC-injektor, for kapillær-kolonner - Fordampnings-injektor (split-inj.-type), oppvarmet for rask fordampning av prøven... - som blir injisert v.h.a. sprøyte, 0,5-2 µl, inn i fordampmningskammerert (i lineren'). - Split-utgangen er stengt under selve injeksjonen/fordampningen, og - gasstrømmen inne i injektoren er derfor lav - bare kolnne-flow (unntatt septum-purge). - I kolonneinngangen (temp. holdes under lsm-kp.) kondenseres prøve og dens lsm. (som blir 'blåst' inn dit over rel. lang tid) - V.h.a. løsningsmiddel-effekten gjenoppkonsentreres prøvekomp. der. - Prøveoverføring fra inj. til kolonna tar typisk fra 0,5 til 2 min, så åpnes splitt'en, - Da sendes prøve- og lsm.-rester ut gj. splitutgangen ("split vent", raskt skylling av inj.- Lundanes & al kammeret.

10 Eksamen KJ 2053 / 2017 Vår bokmål ( ) Side 10 av 17 Splitløs-injeksjon: Kan brukes til veldig fortynnede prøver. Trenger temperaturprogram p.g.a. «kjølig» start-temperatur. Litt mindre diskriminering i injektoren enn split-injeksjon. Begrensest løsningsvolum som må/kan injiseres (vanligvis 0,7-2 ml : nok til å danne gjenoppkonsentrenerende væskefilm i kolonna, ikke større vol. enn at injektoren kan ta opp hele den fordampede prøven. Gjennomføring (s.o.): Kolonne(inngang) kjøles til under Lsm-kp. Split stenges prøven injiseres prøve overføres til kolonna (0,5-2 min) splitten åpnes (inj.skylles) kol.-temp.-program startes. Splitløs-injeksjon: Brukes altså bare i for kapillærkolonner. Dette fordi pakkede kolonner normalt tåler såpass mye mer analytt at det brukes direkte injeksjon, og fordi gasstrømmen inn i pakkede kolonna er såpass stor at overflyttingstiden av prøvedampen fra injeksjonskammeret til kolonna ikke blir uforholdsmessig lang (peakbradening in time), og dette i hvert fall ikke i forhold til de betydelig bredere pakket-kolonne-toppene som fås (ved typisk ganger lavere platetall) - peak-broadening in time «vises ikke». Løsningsmiddeleffekt trengs ikke. Oppgave 4. (3+2+4,5 = 9,5 p.) 4.a) Beskriv kort grunnprinsippene, fordeler og typiske anvendelsesområder for superkritisk fluid kromatografi, SFC. (3 p.) I SFC benyttes superkritisk fluid, oftest CO2 (noen ganger tilsatt modifikator) som MF. En typisk brukt superkritisk fluids (i) løselighetsegenskaper og (ii) tetthet er sammenlignbar med rel. upolare org. løsningsmidler (som eks. hexan) - løselighetsegenskaper øker med tettheten/trykket av SF en, f.eks. CO2. iii) Diff.koeff. er lavere enn gass, høyere enn væske, (tillater høyere MF-hastighet). iv) viskositet er lavere enn for væsker, (tillater lengre kolonner og/el. raskere MF). Fordeler er at både pakkede og kapillær kolonner («GLC og HPLC»), samt både GC- og HPLC-detektorer kan benyttes; anvendelsen overlapper og utfyller derfor GC og HPLC. Anvendes f.eks. til analyse av termisk ustabile forb. eller forb. med høy mol.vekt,, eks. polymere. I nyere tid også mer og mer brukt for NP-LSC, og for kirale separasjoner. Godt egnet til mikroprep. bruk fordi SF en er lett å skille ad (blir for CO2 ) til gass ved atm betingelser) 4.b) Hvordan er en superkritisk fluids egenskap sammenlignet med hhv. (2 p.) væske $ gass $ (i) (ii) (iii) (iv) Kromatografisk ooppløsningsevne (solvatisering (løselighet)) for analytter tetthet diffusjonskoeffisient viskositet omtrent lik (litt mindre) omtrent lik, litt mindre 1-5x (mye) større 10 2 x Mindre x $ lik, omtrent lik, større/mindre, (evt. med faktorer/tallverdier) mye større (null for ideal gass) mye større ~10 3 (mye) mindre x (litt) større, (ca. lik) 3-10 mye større/mye mindre (0,5 p.) (0,5 p.) (0,5p.) (0,5p.)

11 Eksamen KJ 2053 / 2017 Vår bokmål ( ) Side 11 av 17 4.c) (i) Hva gjør moderatoren når en deaktiverer stasjonærfasen ved normalfaseadsorpsjons-kromatografi (NP-LSC), hva er aktuell(e ) moderator(er) og hva er det ønskede resultatet av prosessen ved etterfølgende kromatografering. (2,5 p.) Moderatoren er et stoff som adsorberes sterkt til de sterkeste adsorpsjonssetene på LSC-stasjonærfasen / adorpsjonsmiddelet. Ved NP-LSC er det typisk et polart stoff - ofte vann: tilsatt/tilført på forhånd, eller kontinuerlig (som tilsats) i MF en. Ved siste versjon kan også små alkoholer så som MeOH i-proh brukes. Ved fjerning av de mest aktive ads.-setene, blir disse deaktiverte og de gjenværende ikke-deaktiverte setene mer like i sin styrke: dermed blir (i) ads.-isotermen mer lineær (mindre tailing på kro.-topper) og (ii) retensjonen av analyttene lavere (lavere tr, k, høyere RF ). Primært ønsket effekt: mindre tailing/haledannelse, o Evt også : mindre «agressivitet» av adsorbenten (mer skånsom for labile analytter) o evt. også ønskelig m. svakere retensjon. (ii) Når deaktiveringen i 4.c(i) overdrives kraftig, med alt for mye moderator, kan (2 p.) kromatografi-mekanismen endre seg til en annen: hvilken separasjonsmekanisme blir det da? Denne andre mekanismen gjennomføres i dag bevisst (med en annen praktisk gjennomføring): Gi navnet til denne nye varianten av over-deaktivert NP-LSC? Når moderatoren blir flere molekyl-lag tykk, kan den fungere som væske(-lignende) fase og LSC- går over til LLC-kro., fordelings-kro., væske-væske-kro. Et lignende resultat fås, når vannet foreligger i MF, i rel. «høy» høy konsentrasjon (10-50%) i et blandbart organisk løsningsmidde,l der vann-laget dannes og oppretholdes dynamisk, uten skarp fasegrense mellom van/vannrik SF og bulk MF. Det kalles HILIC: Hydrophilic Intreaction Chro. Oppgave 5. (4+4+2 = 10 p.) 5.a) (i) Definer elektroforese (kort). (2 p.) Forflytting av (ladede) partikler i en fluid (en elektrolyttløsning, som regel) under innflytelsen av et elektrisk felt. I (analytisk-kjemisk) praksis - forflytting av ioner ("atomare/molekylære" partikler, også høymolekylære) i elektrisk ledende væsker (elektrolytter, vanligvis vandige saltoppløsninger, "buffere"). Typisk brukt til analyse ((sub-)µg) (men også (mikro-) preparative muligheter)." (ii) Hvilke egenskaper av analytter må være forskjellige for at analyttene kan separeres ved vanlig elektroforese? (1 p.) Ioner som skal kunne separeres må ha enten ulik ladning og/eller ulik hydrodynamisk størrelse, som sammen gir ulik elektroforetisk mobilitet (hovedsakelig bestemt av ladnning/strørrelse-forholdet). (Ladningnen kan ofte justeres ved å endre ioniseringsgraden - for forbindelser som kan endre den (f.eks. syrer, baser, komplekserende forbindelser)). (1 p.) (iii) Det er noen «biprodukter» av elektroforeseprosessen/strømforbruket foruten forhåpentligvis separasjonen. Hva er de, og hvor oppstår de? - Joule-varme: varmeutvikling p.g.a. strømmen somm går gjennom elektroforesesystemet. Skyldes el. motstand i elektrolytten. - Gassutvikling på elektrodene som følge av elektrolsyse av vann ved gjennomstrømningen (konvertering av elektromstrøm (i metelllederne) til ionestrøm (i el.-foresebufferen) : Hydrogen (ved katoden) og oksygen (ved anoden), vanligvis rel små mengder - ph-endring ved elektrodene: surgjøring (H+-dannelse) ved anoden og basisk-gjøring ( OH - - dannelse) ved katoden. - Elektroosmose: forflytting a v elektroklytten p.g.a dannelsen av ladede grupper på/i bærematerialet. (Vurderer 1sstrekpunkt-var til 0,6 p, 2 stk, god nok for full score - 1p.)

12 Eksamen KJ 2053 / 2017 Vår bokmål ( ) Side 12 av 17 5.b) (i) For elektroforetiske analyser av DNA eller RNA benyttes omtrent utelukkende gel-elektroforese, både som klassisk elektroforese og som kapillær-elektroforese. Hva gjør at nukleinsyrer ikke separeres ved sone-elektroforese, men kan godt separeres ved gel-elektroforese? (2 p.) Ulike DNA elle RNA molkyler er bygget opp av lignende byggestener som alle har samme ladning. Øker størrelsen på molkylet øker ladningen tilsvarende: Dermed har alle ulike DNA-molekyler samme størrelse/ladning-forhold og kan derfor ikke separares bra etter mobilitet. Ved gel-elektroforese forsterker gelens steriske hindring av migrasjonen til (makro-)molekyl-ionene effekten av størresle på mobiliteten kraftig i forhold til bidraget fra ladningen. Dermed kan vi få separasjon som er bestemt av parameteren størrelse (i tilfelle nukleinsyrer: kjedelengde («base-tall»)). NB.: Tilsvarende fenomen sees i SDS-gelelektroforese av proteiner. RNA (ii) Hvilken elektroforesemetode kan brukes til å bestemme det isoelektriske punkt, pi, for peptider og proteiner (og separere slike stoffer når de har ulik pi-verdi). Nevn navnet og de viktigste karakteristika til metoden. (2 p) Isoelektrisk fokusering: Sone-elektroforetisk analyse av zwitter-ioniske stoffer (amfotere ioner) i en ph-gradient. Spesialbuffer lager jevn ph-gradient mellom elektrodene: zwitterionene migrerer ditt ph en er lik deres pi (isoelektriske punkt), der de er uten nettoladning (og uten mobilitet). Hvert stoff fokuseres ved «sin ph». Finnes i klassisk og kapillær-format. 5.c) ENTEN: Hvilke koblede kromatografi/spektrometri-metoder er mest vanlig i dag (nevn 3)? Nevn også de viktigste egenskapene for et kromatografi- (2p) koblet spektrometer? For GC: Massespektrometri (GC-MS); ellers litt GC-IR, GC-AES, Ny: GC-UV) For LC(/SFC): UV (DAD), MS (LC/MS); ellers litt LC-fluorescens, LC-NMR, LC-IR (TLC: UV, MS, IR/Raman ) Viktig egenskap av spektrometer-delen: må kunne ta opp spektra såpass raskt at flere spektra per kromatografitopp-kan tas - for kvantifisering (god def. Av topp-areal, -høyde) Og for kvalitativ bruk - spektra-gjenkjenning (ett helt spektrum ved omtrent konstant og høyt(nok) analytt-konsentrasjon nær/omkring toppmaksimum.) Og den skal ta kunne gode (nok) spektra uforstyrret (evt. hjulpet) av MF / MF-rester. ELLER: Det er 2 hovedgrunner for derivatisering av analytter til kromatografi: Nevn dem, forklar forskjellen, og gi ett eksempel for hver av dem. 1.) Kolonne-rettet derivatisering - skal forbedre kromatograferingen: justere retensjonstiden, lavt nok (eller høyt nok) for eluering; øke separasjonsfaktorer for nærtliggende topper; redusere tailing/bedre kvantifiserbarhet; øke kjemisk stabilitet/overlevelsen av analytten. Derivatisering skjer før analysen (seinest i injektoren) ved en 100%- kvantitativ omsetning. Eksempel : metylering av fettsyrer i GC, evt. trimetyl- silylering:frie fettsyrer er svært polare (tailing) med lav flyktighet: Derivatisering reduserer polaritet (og tailing) og øker flyktigheten. Flere og lengre fettsyrer kan analyseres bedre. Derivatisering for dannesle av diastereomere fra enatiomerer for kiral analyse på akiral kro.-kolonne.

13 Eksamen KJ 2053 / 2017 Vår bokmål ( ) Side 13 av 17 2.) Detektor-rettet derivatisering - skal muliggjøre/forbedre detekterbarheten: gjøre stoffer som ikke (godt nok) detekteres av en gitt detektor synlig i den: Derivatiseringen tilføyer/ danner en «molekyldel» som gjør analytten synlig har de nødvendige deteksjons-egenskapene. Derivatisering ved en 100%- kvantitativ omsetning. > Kan skje før analysen (seinest i injektoren) når derivatene kan separeres og reagens og biprodukter ikke forkludrer analysen. > Kan skje «post-kolonne», etter separasjonen i kolonna og før detektoren: Krever reagens-tilsetting og reaksjons-periode som ikke ødelegger separasjonen fra kolonna - derivatiserings-reaksjonen må være raskt nok for kromatograferingen. Reagenser må ikke ikke hindre/«slukke» detektorsignalet (fordi separasjon fra analyttene ikke er mulig) Eksempler:: Aminosyre.analyser: post-kolonne (ninhydrin-reagens) i de klassiske aminosyre-analysatorene (synlig lysdet.) og «pre-kolonne» : f.eks. OPA (orto-phtalic aldehyde) derivater for RP-HPLC, der aminosyrene derivatiseres på forhånd til å få en god kromofor, og så separeres og detekteres (UV det.). Også «påsetting» av fourescerende grupper er nyttig (høy følsomhet og selektivitet). ELLER: Fast-fase-ekstraksjon, SPE, brukes ofte i forkant av kromatografiske analyser. Hvilke 2 hovedhensikter kan dette ha? SPE blir beskrives gjerne som en form for kromatografi i seg selv. Diskuter kort denne påstanden. 1 Separasjon av analytter fra matrix/forstyrrende stoffer før analyse (prøveopprensking) 2 Oppkonsentrering av fortynned prøver (gjerne kombinert med punkt 1) SPE har SF og MF. MF er brukes i trinnvis gradient-eluering: valgt slik at analytten enten har full retensjon (ved sorpsjon av analytten) eller svært lite retensjon (ved eluering av analytten) - og gjerne motsatt egenskap av forurensingene. Det brukes små kolonner med lite platetall (separasjon skjer på stor separasjonsfaktor ikke på stor effektivitet. Og kolonnene er rel. billige - beregnet for engangsbruk (sterkt retarderte forurensinger trengs ikke å eluere, kolonnen trengs ikke å tilbakeføre til startbetingelser).

14 Eksamen KJ 2053 / 2017 Vår bokmål ( ) Side 14 av 17 Oppgave 6. (5+3+2 =10 p.) 6.a) (i) Hva er den nedre deteksjonsgrensen ((lower) Limit of Detection), (l)lod? (2 p.) Det er konsentrasjonen (eller mengden) av analytt som gir et signal (innen kro. - en topp) som med høy sannsynlighet er fra analytten, og ikke et tilfeldig utslag av litt mye støy. Som regel legges sannsynlighetsgrensen opp i over 90% regionen. Grenseverdien kan bestemmes på ulike måter: ut fra signal/støyforholdet i kromatogrammet eller ut fra presisjonen målt i nærheten av LOD. Alternativ 1: Det måles/detekteres standardløsninger (gjerne nær, men over, deteksjonsgrensen). Fra gjentatte målinger bestemmes standardavviket, σ (X), og fra blindprøven null-signal- verdien, y(0). Alternativ 2: den nedre deteksjonsgrensen er da: (l)lod = y(0) + 3 σ (X). Det måles støynivået i kromatogrammet N (for noise) og fra kalibreringen har vi sensitiviteten S (= responsfaktoren (eller stigningskoeff. fra ekst.standard-kalibr.). Da blir LOD (i konsentrasjons- eller massestrøm-enheter : D = 2 N / S Alternativ 3: (beslekted m. Alt. 2) Her grafisk grafisk fra kromatogram: mål støybåndets bredde legg bredden av ett støybånd oppå støybåndet. Det gir signalstørrelsen for en topp ved (l)lod. Bestemm kons. El. massestrøm vefor en topp veav denne størrelsen: Det forutsetter at y- aksen kan omregnes til konsentrasjonsenheter av analytt (er kalibrert, responsfaktor er kjent). (Fig. fra forelesg. ) (ii) Hva betyr det at en detektor er konsentrasjonsfølsom? (1 p.) Detektoren måler en egenskap av analytten som er avhengig av analyttkonsentrasjonen, og som ikke endrer seg gjennom måleprosessen men forblir konstant før, under og etter målingen (f.eks. absorbanse, brytningsindeks, varmeledningsevne). Da er detektorene konsentrasjons-følsom. (I motsetning til masse-følsom detektor, der detektorens måling medfører en forandring av analytten i måleprosessen.) (iii) Hvilke kalibreringsmetoder brukes ved kvantitativ analyse innen kromatografi (utenom standard-addisjons-metoden). (2 p.) - Normaliseringsmetoden - Ekstern standard-metoden - Intern Standard-metoden 6.b) Forklar og skissér hvordan en kvantitativ analyse utføres v.h.a. standard-addisjon; vis hvordan en kalibreringskurve for standardaddisjons-metoden ser ut. Når er det lurt/nødvendig å bruke denne metoden? (3p.) Standard-addisjons-metoden brukes typisk, når ikke ekstern standard er brukbar og når intern standard hadde vært bra men ikke er mulig: Når det ikke er tilgjengelig et eget Internstandard-stoff eller det ikke er "plass i kromatogrammet» til en Internstandard-topp. (eller plassen er på feil sted)../.. For analytten X skaffes autentisk, rent stoff.

15 Eksamen KJ 2053 / 2017 Vår bokmål ( ) Side 15 av 17 Til noen alikvoter (kjente del-volum) av prøven tilsettes kjente mengder av analytt X, gjerne flere prøver-alikvoter med ulike mengde X tilsatt. Den opprinnelige prøven og de "spikede" prøvene analyseres. Det lages en graf (el. en regresjon) med x = mengde tilsatt X og y = X-integral (toppstørrelse) Skjæringspunktet av grafen/funksjonen med x-aksen (absoluttall) er lik den opprinnelige mengden X i prøvealikvotene. (Dette omregnes til konsentrasjon). Metoden kan også forenklet brukes som "ett-punkts"-kalibrering (bare én "spiket" prøve - i tillegg til originalprøven). I en "1-punkts"-kalibrering kan mengden X i prøven ("opprinnelig"), m X(0), beregnes : m X(0) = X(0) m X(+) X(+) - X(0) 6.c) (i) Ved en kvantitativ analyse veies standardstoffet inn med en vekt som gir 4 sifre (0,5 p.) (e.g. 106,3 mg) og oppløst i en kolbe med 0,1 % volumetrisk nøyaktighet. Hvor mye (om noe (?)) avrunder du konsentrasjonen ved utregning av / kalibreringskurven responsfaktoren? Grunngi kort. 0,1% volumetrisk nøyaktighet er i samme størreslsesorden som målenøyaktighet av vekta, forutsatt at siste siffer er signifikant. Demed vil konsentrasjonsopplysningen oppgis med samme antall sifra som veieresultatet. Trolig bruke 4 sifre i kalibrering(kurve)-regning (ii) Elektroniksk integrering av toppene gir «ubegrenset antall sifre etter komma». Ved en integreringsprosess-kvalitet på 0,5-5% u-nøyaktighet (valg av integrasjons-start/stopp-punkt, overlappende topper, etc.) og manuell overføring av data hvor mange sifre tar du med for standardstoffetsens areal- (eller høyde-) verdien til videre utregning av kalibreringskurven/responsfaktoren? Og, hvor mange sifre tar du med for prøvetoppens areal- (eller høyde-)verdiern (0,5 p.) (fra gjentatte målinger) til videre utregning av analyttens mengde? Grunngi kort. Basert på estimert «unøyaktighet» på i beste tilfelle 0,5 % ville (3-)4 sifre være nok: Men, i og med at standardarealet ikke er slutt-resultatet av utregningene, så er det ikke nødvendig (ikke lurt) å avrunde til bare signifikante sifre på det stadiet, og en tar med seg (litt) flere enn minimumet til de videre regneoperasjonene (noe som computer-programmer gjør av seg selv) avrundingen foretas først på sluttresultatet. (iii) Computeren har levert sluttresultatet konsentrasjonen av din analytt «med ubegrenset antall sifre etter komma». Hvordan rapporterer du resultatet ditt antall sifre og annen informasjon - til (1 p.) din oppdragsgiver slik at kvantifiserings-kvaliteten blir riktig formidlet? Antatt unøyaktigehter fra (i) og (ii) berukes i dette delspørsmålet, så er konsentrasjon minsat like presis bestemt som integreringen (som er oppgitt med opptil 5 % usikkerhet). Hvis ikke kvalitetssikrings arbeid gir andre indikasjoner (usikkerhet i oprøvetaking-opparbeidelse-andre analytiske bidrag), vill det være naturlig med maksimum 3 signifikante sifre oppgitt basert på integrasjons-usikkerheten på opptil 5 %. (201,3641±5% = 201,3641±10,0682 = 200 (±10), evt. avrundet til 201 ±10 basert på at 5% er «worst case» og mange verdier (og standardavviket) kan noe bedre. (Anbefalt: Antall signif. sifre, men om det i svaret uspesifisert bare skrives om sifre etter komma forutsettes at det er tall i Scientific (Normalized) notation / Standard Form format: ( x,yzu 10 n, med 1 x >10 ).

16 Eksamen KJ 2053 / 2017 Vår bokmål ( ) Side 16 av 17 Oppgave 7. (25 p.) Gi /-svar pluss (nødvendig!) kort forklaring ("fordi "): (1 poeng pr. riktig og grunngitt svar : uten forklaring anses ja/nei som potensielt tipping og telles som følger : riktig svar gir + 0,2 poeng, feil svar gir -0,2 poeng (trekk!). Riktig ja/nei-svar med feil forklaring gir tilpasset poengreduksjon.) 1. Det er en generell regel at polare forbindelser eluerer ut etter upolare forbindelser på en upolar GLC kolonne. 2. Det er best separasjonsevne på en TLC-plate for flekker med RFverdier 0,2-0,5. 3. Silikagel-baserte materialer kan benyttes både i kolonner som stasjonær fase både i for ionebytter- og i for gelfiltrerings-kromatografi (SEC). 4. Flammeioniseringsdetektoren (FID) har dårlig linearitet av responsen. 5. Gradient-eluering i RP-LC skjer typisk ved lineær hastighetsøkning av MF-hastigheten. 6. SFC-MF må pumpes i væsketilstand fordi et superkritisk fluid er altfor kompressibel. 7. Topp A eluerer etter 1,0min, likt med t0= tmf og topp B ved 2,0min. Da er separasjonsfaktoren = 2,0 8. Ved CE kan ioner transporteres mot elektroden med lik ladning på tross av elektrostatisk frastøtning. 9. Papirkromatografi er adsorpsjonskromatografi, der analytten adsorberes på cellulosefibrillenes overflate. 10. I elektroforese er det elektroosmosen som er ansvarlig for separasjon av ionene. 11. I SEC-separasjoner av makromolekyler er det best å ha lav MF-hastighet. 12. Gir ionebytterkromatografi av en prøve med Ca 2+ og NH4 + ved ph 2 på en sterkt sur kationbytter en god separasjon? Enig/ uenig (/), fordi. Eluering omtrent etter kokepunkt på upolare GLC-kol., (Bare ekstremt polare stoffer kan elueres (rel. altfor) tidlig p.g.a. manglende løselighet / retensjon i den upolare SF ("mislykket GLC"). Høyere RF usikrer retesnsjon (ikke-mettet- tank, Lavere RF lite avstand av flekker i forhold til oppnådd vandringslengde-differeanser Derivatiseres dog: For SEC fjernes silanol for å unngå adsorpsjon (Typisk diol-grupper) For IEC: Aminopropyl (protonert) eller karboksyalkyl, eller alkylsulfonatagrupper Lineariteten til FID er ca en av de største blant GC-detektorene Gradienteluering skjer typisk ved økning i elueringsstyrke / f.eks. lineær eller trinnvis. Superkritiske fluider er kompressible, under økt trykk (i pumpen) minker volumet. Dermed kan fluidet ikke pumpes i konstant-volum-pumper. Som væske er samme stoff ikke (lite) kopmpressibel: pumpes derfor som kald væske, og oppvarmes før kol. til SFl-tilstand. Når A eluerer likt med MF er dens retensjonsfaktor, per definisjon null. Dermed blir (=k2/k1), udefinert,- ikke 0, når k1 = 0 (uansett verdi av k2). Elektroosmose-hastigheten mot den aktuelle elektroden kan være større enn elektroforese-hastigheten bort fra den for de frastøtede ionene. Papirkromatografi = LLC; SF er ikke cellulose-fibrillenes overflate. SF dannes i amorfe soner av cellulose: kjeder av cellulose holder igjen solvat-iserende (særlig polare) komponenter av eluenten som SF. Eletroosmosen gir bare samlet transport av elektrolytt - det er elektroforesen som skiller ionene gjennom forskjell i mobilitet. Makromolekyler diffunderer sakte (er store og trege ) derfor trengs litt tid for å få til massetransfer-trinnene. Ved ph 2 er en sterkt sur KB ionisert (IEC er mulig). Ved ph 2 er NH4 + protonert/kationisk og retarderes. Men Ca 2+ har dobbelt så stor ladning og forventes å retarderes klart sterkere. fortsetter på neste side

17 Eksamen KJ 2053 / 2017 Vår bokmål ( ) Side 17 av 17 (Oppgave 7 fortsetter) Gi /-svar pluss (nødvendig!) kort forklaring ("fordi "): (1 poeng pr. riktig og grunngitt svar : uten forklaring anses ja/nei som potensielt tipping og telles som følger : riktig svar gir + 0,2 poeng, feil svar gir -0,2 poeng (trekk!). Riktig ja/nei-svar med feil forklaring gir tilpasset poengreduksjon. 13. En viktig prosess ved typisk ionekromatografi er å fjerne MF-ioner fra eluenten før detektoren v.h.a.med en supperssor. 14. Analyse av en blanding av N2, CO2 og CH4 kan utføres på en GC-kolonne pakket med adsorpsjons materiale. 15. Ved HPLC bør det brukes eluenter med høy viskositet. 16. I selektivitetskurver av SEC-gelmaterialer øker Kav (el. KD) med økende molekylmasse av analyttene. 17. Eksklusjonskromatografi (SEC) med små molekyler kalles gelfiltrering, og med store molekyler kalles det gelpermeasjons-kromatografi. 18. En sterk basisk anionbytter er ikke basisk i det hele tatt. 19. Dersom t0= 0.75 min og forbindelse A eluerer ut med retensjonstid tr,a = 2,25 min, betyr det at ca. 67 % av stoffet foreligger i mobil fase (MF). 20. Den vanligste ioniseringsmetoden ved koblet GC/MS i dag er Elektronionisering (EI). 21. Analyser ved HPTLC separerer bedre på kortere tid og vandringslengder enn ved vanlig TLC 22. Hydrofobisk Interaksjonskromatografi, HIC, er en spesiell form for bioaffinintetskromatografi (BAC). 23. Carbowax er en gruppe GLC-SF'er, som består av polyetylenglykoler som er vurdert som polare i GLC. 24. Diastereomere derivater av enantiomere forbindelser må analyseres på en kiral GLC- eller HPLC-kolonne for å kunne separeres. 25. Ved Fastfase-ekstraksjon (SPE) brukes trinnvise MF-gradienter i separasjonen. Enig/ uenig (/), fordi. Suppressorens oppgave er å fjerne elektrolytt-(mf)-ioner før detektoren, for at bakgrunn-lednings evnen til MF er minst mulig under deteksjon (gir større siganl/støy-forhold, og større dynamisk område for selve analytt-ionene). GC av permanente gasser fungerer bare med GSC og ikke med GLC, fordi retensjonen i GLC er for svak for dem. Viskositeten skaper høyt mottrykk og er uønsket. Høy viskositet gir for de fleste analyser ingen fordel.. Omvendt: Kav (og KD ) er 0,0 for store analytter (eksludert fra SF), og ca. 1,0 for små molekyler. Geløfiltrering og permeasjon går ikke på størrelse am analyttene, men på polaritetee3n av amlyttene (og eluenten.: Gelfiltrering: polare - Gelpermeasjon: upolare En sterkt basisk anionbytter er et kvarternært ammoniumion. Det kan ikke lage bindinger til protoner, d.v.s. ta protoner fra syrer, og er derfor ingen base i kjemisk forstand...t(r ) t(0)=1,5 min, t(0)=,0,75 min, k = 1,5 /0,75 = 2 ; k = mengdeforhold i SF og MF = 2:1 dermed innheolder MF 1/(1+2) =0,33 = 33%. Dvs. ikke 67%. (Ved 67% in MF hadde k vært 0,5) Systemene er optimerte for EI, fragmenteringen i EI hjelper med identifikasjon, bred spektra-søking i biblioteker er mulig (nesten bare) for EI. Enklere og mindre forurensende (mindre vedlikehold) enn CI. HPTLC har mindre partikler og høyereeffektivitet. Flekkene blir mindre - kortere vandringslende til å separere dem. Kort vandringslengdr gir raskere analyse. Dette gir også mindre sonespredning (mindre longit. Diffusjon). HIC er RP-LC for proteiner med MF av saltvann eller vann og rel. svake RP-SF. BAC er spesial-adsorpsjonsfaser, der analytt retarderes ved ligander (immobil. på SF-matriks) somhas spesifkk sterk binding til den. (vanligvis prep.) Carbowax er et produktnavn for polyetylen gly koler, brukt som GLC-SF er. (Carbowx 20M, den mest tungtflyktige, er en polar standard-kolonne). Diastereomerer har ulke fysikalsk-kjemiske egenskaper også i akiral miljø. Dermed er kiral SF ikke forutsetning for separasjon. Typisk 2-trinns-gradient (etter kondisjonering): Først svak MF for å vaske ut ikke- og lite retarderte forurensinger, deretter passe sterk MF for ( rel. rask) eluering av analytten.