refererer til elektroforese. Ionet får umiddelbart en konstant hastighet der akselrasjonskraften er lik friksjonskraften.

Transkript

1 1 lektroforese lektroforese er vandring av ioner i løsning under innflytelse av et elektrisk felt. I kapillær elektroforese eksperimentet i figur benyttes et elektrisk felt på 30 kv for separasjon av komponenter i en løsning inne i et kvartskapillær som er 50 cm langt og har en indre diameter på m. Forskjellige løste stoff har forskjellig mobilitet og vil derfor vandre med forskjellig hastighet gjennom et kapillær. Modifikasjoner av dette eksperimentet tillater at nøytrale molekyler og ioner separeres. t åpent kapillær reduserer platehøyden og forbedrer oppløsningen relativt til en pakket kolonne ved at A-leddet i van Deemter likningen elimineres. Kapillærelektroforese reduserer platehøyden da masseoverføringsleddet, Cu x, som skyldes at det tar tid for analytter å komme i likevekt mellom stasjonærfasen og mobilfasen, er eliminert. I kapillærelektroforese er det ingen stasjonærfase. Det eneste leddet som bidrar til båndspredning er longitudinal diffusjon. Andre kilder til båndspredning i reelle systemer nevnes senere. Kapillærelektroforese har vanligvis til teoretiske plater. H A + B/u x + Cu x Når et ion med ladning q (Coulomb) plasseres i et elektrisk felt (V/m) er kraften som virker på ionet q (Newton). I en løsning vil friksjonskraften være fu ep der u ep er hastigheten til ionet og f friksjonskoeffisienten. Indeks nede ep refererer til elektroforese. Ionet får umiddelbart en konstant hastighet der akselrasjonskraften er lik friksjonskraften. u q f ep ep lektroforetisk mobilitet er proporsjonalitetskonstanten mellom hastigheten av ionet og styrken av det elektrisk felt. Mobiliteten er proporsjonal med ladningen og omvent proporsjonal med friksjonskoeffisienten. For molekyler med liknende størrelse vil mobiliteten øke med økende ladning. For en sfærisk partikkel med radius, r, som beveger seg gjennom en væske med viskositet, η, er friksjonskoeffisienten, f, gitt ved Stokes likning. f 6πηr

2 2 Fordi mobiliteten er q/f, vil større radius gi lavere mobilitet. Det fleste molekyler er ikke sfæriske, men Stokes likning kan benyttes til å definere en hydrodynamisk radius for molekylet basert på mobilitet. lektroosmose. Innsiden av veggen i et kvartskapillær er dekket med silanol (Si-OH) grupper som har negativ ladning (Si-O - ) over ph 2. Figur viser det elektriske dobbeltlag på veggen i kapillæret. t sterkt tett absorbert immobilisert lag av kationer nær veggen delvis nøytraliserer den negative ladningen. Den gjenværende negative ladningen nøytraliseres av overskudd av mobile solvatiserte kationer i den diffuse delen av dobbeltlaget i løsningen nær veggen. Tykkelsen på den diffuse delen av dobbeltlaget er fra ~10 nm når ionestyrken er 1 mm til ~0,3 nm når ionestyrken er 1 M. I et elektrisk felt vil kationer tiltrekkes katoden og anioner tiltrekkes anoden. Overskudd av kationer i den diffuse delen av dobbeltlaget gir en netto bevegelse mot katoden. Denne pumpeeffekten, elektroosmose, drives ved at solvatiserte kation nærmere veggen enn 10 nm og danner en uniform pluggliknende elektroosmotisk flow av hele løsningen mot katoden. Dette i sterk kontrast til hydrodynamisk flow som drives av trykkforskjeller mellom endene av kapillæret. I hydrodynamisk flow er hastighetsprofilen gjennom tverrsnittet av væsken parabolsk. Det er raskest i midten og går ned mot null ved veggene. Proporsjonalitetskonstanten mellom elektroosmotisk hastighet, u eo, og påtrykt felt kalles elektroosmotisk mobilitet, eo. lektroosmotisk mobilitet ueo eo lektroosmotisk mobilitet er proporsjonal med overflatetettheten av ladning på kvarts og omvendt proporsjonal med kvadratroten av ionestyrken. lektroosmose avtar ved lav ph (Si-O - Si-OH overflatetettheten av ladningen avtar) og ved høy ionestyrke. Ved ph 9 i 20 mm boratbuffer er elektroosmotisk flow typisk rundt 2 mm/s. Ved ph 3 reduseres flow med en størrelsesorden. Vi løste oppgave Uniform elektroosmotisk flow bidrar til høy oppløsningsevne i kapillærelektroforese. Alle effekter som senker uniformiteten bidrar til båndspredning og senker oppløsningsevnen. lektrisk strøm i kapillærer (flow av ioner)

3 3 genererer varme (Joule oppvarming). Under typiske betingelser vil senterlinja i kapillærkanalen være 0,02 til 0,3 K varmere enn kantene av kanalen. Viskositeten av løsningen er lavere i de varmere områdene og forstyrrer den flate elektroosmotiske profilen i væsken. Dette er ikke et stort problem i kapillær med indre diameter 50 m, men temperaturgradienter ville vært et problem i rør med diameter større enn 1 mm. Avkjøling av væsken i noen instrument reduserer konduktiviteten i løsningen inne i kapillærer og hjelper med å hindre Joule oppvarming. Tilsynelatende mobilitet. Den tilsynelatende (eller observerte) mobilitet av et ion er summen av elektroforetisk mobilitet av ionene pluss elektroosmotisk mobilitet av løsningen. ep + eo For et kation som beveger seg i samme retning som den elektroosmotiske flow vil ep og eo ha samme fortegn slik at er større enn ep. lektroforese transporterer anioner i motsatt retning av elektroosmose. ep og eo har motsatt fortegn. Ved nøytral eller høy ph vil rask elektroosmose transportere anioner til katoden fordi elektroosmose vanligvis er hurtigere enn elektroforese. Ved lav ph er elektroosmose svak og anioner vil kanskje aldri nå detektoren. Dersom man ønsker å separere anioner ved lav ph kan man snu polariteten av instrumentet slik at prøvesiden blir negativ og detektorsiden positiv. Den tilsynelatende mobiliteten ( ) av en spesiell species er nettohastighet (u net ) av en species dividert på et elektriske feltet. u net Ld t V Lt der L d : lengden av kolonnen fra injeksjonspunkt til deteksjon. L t : den totale lengde av kolonnen fra en ende til en annen. t : tiden et løst stoff bruker fra injeksjonspunkt til detektor. lektroosmotisk flow måles ved å addere en UV-absorberende nøytral analytt til prøven og måle migrasjonstiden t nøytral til detektoren. lektroosmotisk mobilitet er hastigheten av nøytrale species u nøytral dividert med det elektriske feltet.

4 4 u eo nøytral Ld tnøytral V Lt Den elektroforetiske mobilitet er differansen eo For maksimum presisjon måles mobilitet relativt til en intern standard. Absolutte variasjoner fra kjøring til kjøring burde ikke påvirke mobilitet dersom det ikke er en tidsavhengig interaksjon mellom løste stoff og veggen. Vi løste oppgave Teoretiske plater. 2 L I kap. 23 definerte vi platetallet som N der σ er standardavvik i båndet. 2 σ Dersom den eneste mekanismen som bidrar til båndspredning er longitudinell diffusjon er standardavviket gitt ved σ 2Dt der D er L L diffusjonskoeffisienten og t er migrasjonstiden t. Ved å kombinere unet disse ligningene med definisjonen av elektrisk felt, V/L, der V er den påtrykt spenningen, får man et uttrykt for platetallet i kapillær elektroforese. N V 2D Hvor mange teoretiske plater kan vi håpe på å få? Ved bruk av en typisk verdi 2 8 m som 2 10 utledet for 10 minutter migrasjon i et 55 cm langt kapillær V s med 25 kv og bruk av diffusjonskoeffisienter fra tabell får vi for K plater og for serum albumin 4, plater. Høyt platetall betyr at oppløsningen er god og båndene er meget smale. I praksis vil båndspredning fra endelig utspredning av det injiserte båndet en parabolsk flow profil fra oppvarming inne i kapillæret. Absorpsjon av løste stoff til kapillærveggen (som virker som en stasjonærfase) endelig lengde på detektorsonen og mobilitets mismatch mellom løste stoff og buffer ioner fører til ikke-ideell elektroforetisk oppførsel. Dersom disse andre faktorene kontrolleres kan man få 10 5 plater i rutinekjøringer. Likningen sier at jo høyere spenning, jo større platetall. Likningen sier også at platetall er uavhengig av kapillærlengden ved konstant spenning. Lengre kapillær tillater imidlertid at man benytter høyere spenning som øker platetallet. Spenning begrenses av oppvarming av kapillærer, som ofte gir en parabolsk temperaturprofil, som gir båndspredning. Optimal spenning fås ved å tegne et

5 5 Ohms lov plott der strøm mot spenning med bakgrunnselektrolytt i kapillæret. I fravær av overoppvarming skulle dette gi en rett linje. Den maksimale tillatte spenning er der kurver avviker fra linearitet, med f. eks. 5%. Bufferkonsentrasjon, buffersammensetning, termostattemperatur og aktiv kjøling har alle betydning for hvor mye spenning som kan tolereres. Opp til et punkt vil høyere spenning gi bedre oppløsningsevne og hurtigere separasjon. Kontroll av miljøet inne i kapillæret. t kvartskapillær klargjøres for bruk første gang ved å vaske det 15 minutter med 1 M NaOH, deretter med 0,1 M NaOH og til slutt med bakgrunnselektrolytt (typisk en 20 mm buffer) som skal benyttes i den elektroforetiske separasjonen. Ved senere bruk vaskes 2 minutter med 0,1 M NaOH etterfulgt av minst 5 minutter med bakgrunnselektrolytten. Kommersielle instrumenter tvinger væske gjennom kapillæret ved å anvende trykk ved inngangen eller ved å redusere trykket ved utløpet. Når man forandrer buffer bør man tillate minst 5 minutter for innstilling av likevekt. Buffer i begge reservoar bør periodevis erstattes, fordi ioner forsvinner og fordi elektrolyse hever ph ved katoden og senker ph ved anoden. For arbeid i ph området 4 6, der likevekt mellom ph i kolonneveggene og buffer er kritisk og meget langsom, trenger kapillæret hyppig å regenereres med 0,1 M NaOH dersom migrasjonstidene blir gale. Forskjellige separasjoner krever mer eller mindre osmotisk flow. For eksempel, små anioner med høy mobilitet og proteiner med stor negativ ladning vil kreve rask flow ellers vil de ikke vandre mot katoden. Ved ph 2 er det liten ladning på silanolgruppene og liten elektroosmotisk flow. Ved ph 11 er veggene sterkt ladet og elektroosmotisk flow er sterk. Proteiner med mange positive ladninger kan bindes til den negativt ladde kvartsveggen. For å kontrollere dette kan mm diaminopropan (som gir + NH 2 CH 2 CH 2 CH 2 NH 2 + ) tilsettes bakgrunnselektrolytten for å nøytralisere ladning på veggene. Veggene kan nøytraliseres ved å kovalent binde silan med nøytrale hydrofile substituenter for å redusere ladning på veggen til nærmere null. Mange dekklag er imidlertid ustabile under alkaliske betingelser. Vi kan tilsette et kationiske overflatebehandlingsmiddel som cetyltrimetylammoniumbromid, til bakgrunnselektrolytten for å reversere retningen av elektorosmotisk flow. Dette molekyler har positiv ladning på en side og en lang hydrokarbon hale på den andre siden. Disse molekylene dekker den negativt ladde kvartsen med halene som peker ut fra kvartsoverflaten. t nytt lag av molekylene orienterer seg i motsatt retning slik at nettoeffekten blir at overflaten får positiv ladning.

6 6 Prøveinjeksjon og prøvesammensetning. Injeksjonen kan være hydrodynamisk ( bruk av trykkdifferanse mellom de to endene av kapillæret eller elektrokinetisk ( bruk av elektrisk felt for å drive prøven inn i kapillæret). For hydrodynamisk injeksjon dyppes kapillæret i prøveløsningen og det injiserte volumet er 4 Pπd t volum 128η L t Der P : trykkdifferansen mellom endene av kapillæret d : kapillærets indre diameter og t : injeksjonstiden η :prøvens viskositet og L t : den totale lengden av kapillæret. Vi løste oppgave For elektrokinetisk injeksjon dyppes kapillæret med i prøven og et volum mellom endene av kapillæret. Antall mol av hver ion som injiseres i kapillæret i løpet av t sekunder er gitt ved b 2 mol _ injisert κ tπr C κ s ; den tilsynelatende mobilitet av analytt ( ep + eo ) : det elektriske felt (V/m) r : radius av kapillæret C: konsentrasjonen av prøve (mol/m 3 ) κ b : forholdet mellom konduktiviteten av buffer og prøve κ s t problem med elektrokinetisk injeksjon er at de forskjellige analyttene har forskjellige mobilitet. I kvantitative analyser vil den injiserte prøven ikke ha samme sammensetning som den originale prøven. lektrokinetisk injeksjon er mest brukbar for kapillær gelelektroforese, der væsken i kapillæret er for viskøs for hydrodynamisk injeksjon. Vi løste oppgave Optimal bufferkonsentrasjon i prøveløsningen er 1/10 av elektrolyttkonsentrasjonen i bakgrunnen og prøve konsentrasjonen bør være 1/500 av elektrolyttkonsentrasjonen i bakgrunnen. Fordi prøveløsningene har lavere ionestyrke er konduktiviteten lavere og motstanden er høyere enn i

7 7 bakgrunnselektrolytten. Det elektriske felt over prøvepluggen inne i kapillæret er mye høyere enn det elektriske feltet Detektorer Fordi vann er transparent, kan ultrafiolette detektorer operere ved bølgelengder så lave som 185 nm, der de fleste analytter har sterk absorpsjon. Figur viser hvordan lysveien kan økes for høyere sensitivitet. For å dra nytte av korte bølgelengder ved ultrafiolett deteksjon må bakgrunnsabsorpsjonen være tilstrekkelig transparent i området av interesse. Boratbuffere er vanlig brukt i kapillærelektroforese fordi de er transparente. Fluorescensdeteksjon er sensitive til naturlig fluoriserende analytter eller fluoriserende derivater. Amperometriske deteksjon er sensitiv for analytter som kan oksideres eller reduseres ved en elektrode. n kopper elektrode er spesielt brukbar fordi den er stabil for langtids bruk ved konstant potensial ved høy ph som benyttes i mange separasjoner. Konduktivitetsdeteksjon med ionebyttersuppresjon av bakgrunnselektrolytt er kapable til en sensitivitet på små analytter i området 1-10 ppb. Figur viser prinsippet for indirekte deteksjon med fluorescens, absorbans, amperometri, konduktivitet eller andre former for bakgrunndeteksjon. I det analytiske båndet tar analyttmolekylene plassen til kromoforen slik at detektoren gir et negativt utslag når analytt passerer.