Testing av sarkomer Molekylærpatologiske metoder Histoteknikerforeningen Sarkomseminar Fredag 22. mars 2013 Jeanne-Marie Berner Molekylær patologi i sarkomer Molekylærpatologi i sarkomer Hjelpemiddel i diagnostikk Bruker kjent kunnskap om genetiske forandringer i svulster Gir tilleggsinformasjon om diagnoser/klassifisering Kan veilede bruk av terapi, prognostiske markør Må ha kjennskap til molekylære avvik, spesifikke forandringer Alltid i kombinasjon med andre metoder, morfologi/ immunprofil/klinisk informasjon Påvisning av fusjonstranskripter Mutasjonsscrening KIT-PDGFRA i gastrointestinale svulster MDM2-CDK4 amplifikasjon, qpcr Tumorer med karakteristiske tumorspesifikke translokasjoner Komplekse karyotyper Genetisk ustabilitet Påvisning translokasjoner Ulike metoder Ewings sarkom Diagnostiske markører 1
Småcellede rundcellede svulster RT-PCR translokasjonstester Sarkom Translokasjon Alveolært rhabdomyosarkom t(2;13)(q35;q14) t(1;13)(p36;q14) Fusjonsgener PAX3-FOXO1 PAX7-FOXO1 Ewings sarkom/pnet t(11; 22)(q24;q12) t(21;22)(q22;q12) EWSR1-FLI1 EWSR1-ERG Myxoid liposarkom t(12;16)(q13;p11) FUS-DDIT3 Synovialt sarkom t(x;18)(p11;q11) SS18-SSX1/2/4 rhabdomyosarkom malignt lymfom desmoplastisk småcellet rundcellet tumor Ewings sarkom Avgjørende for behandling ekstraksjon biopsi PCR X 30-40 cycles cdna syntese revers transkripsjon cdna PCR spesifikke primere PCR produkt Real-time PCR, Taqman probe Alveolært rhabdomyosarkom, aggressiv kreftform som rammer barn PAX3 og PAX7: transkripsjonsfaktorer muskelutvikling Probe Mer potent transkripsjonsfaktor. Nedregulering av PAX-spesifikke gener Onkogen transformasjon 75 % 10-15% 2
Alveolar rhabdomyosarcoma t(2;13) Eks) test PAX3/PAX7-FOXO1 Ekson 1-7 Ekson 2 PAX3 FOXO1 Fusjonstranskript cdna blokk Ferskfrosset biopsi, nålbiopsi benmarg, celler, aspirat primere probe Måle kons og renhet PCR reaksjon cdna RT-PCR PAX3 FOXO1 Normale transkripter gir ingen signaler qpcr Kontroll analyse GUS Test PAX3/7-FOXO1 Innkalt preparat, biopsi lymfeknute halsen kvinne født 88 Diagnose: udifferensiert malign tumor Mistanke lymfom GUS-kontroll Test PAX3/7-FOXO1 prøve immunprofil Rhabdomyosarkom desmin PCR-test PAX3/PAX7-FOXO1 myf4 Alveolært rhabdomyosarkom CT>30, 1000 kopier 2x prøve Positiv kontroller: SJRH30 (PAX3) RMZ-RC2 (PAX7) parafinkontroll NTC Begrensinger fusjon ikke detektert av primere brukt i test Fusjonsnegative svulster dårlig kvalitet, nekrotisk materiale kan gi degradert sammenlign med Ct verdi for GUS, bør helst ha < 30 fra formalinfikserte prøver har generelt mer degradert PCR reaksjon hemmes av inhibitorer fra prøvemateriale ikke representativt prøvemateriale for lite materiale analysert <5% Ewing: t(11;22): 90% t(21;22): 5-10 % 3
GIST Sjelden kreftform (insidens 10-20/million) Høyest insidens i 50-70 års alderen Magesekk (50 %) eller tynntarm (20-30 %) Oppstår fra mesenchymale stamceller som gir opphav til interstitielle Cajal-celler (pacemakerceller). Uttrykker CD117 KIT, 95% Aktivering av tyrosinkinase ved mutasjoner GIST Cellerik stromal tumor spolformede, epiteloide, pleomorfe Immunhistokjemi: Positiv CD117, 95 % Tyrosinekinase reseptor De fleste GIST har mutasjoner i KIT eller PDGFRA Viktig patogenetisk hendelse KIT, transmembran glykoprotein Reseptor for stamcellefaktor Behandling Kirurgi er primærbehandling Vanlig kjemoterapi og strålebehandling har ikke effekt 50 % utvikler residiv/metastaser innen 5 år Tyrosinkinashemmer: Imatinib bedre prognose Imatinib: uoperabel tumor eller metastatisk sykdom Adjuvant behandling Høyrisikopasienter (størrelse og mitoser) Mutasjonsstatus kan forutsi effekt av behandling Mutasjoner i KIT og PDGFRA Respons til Imatinib delesjoner punktmutasjoner Ekson 9 Ekson 11 Ekson 13 Ekson 17 Konstant aktivering av tyrosin kinase aktivering uavhengig av ligand Ukontrollert cellevekst ekson 12 ekson 14 ekson 18 Ingen mut Exon 9 Exon 11 Exon 13 Exon 17 Dårlig respons Noe respons Best respons Lav respons Lav respons 4
Mutasjonsanalyse KIT /PDGFRA DNA ekstraskjon (blokk/fersk vev) KIT ekson 11 ekson 127 bp intron PCR reaksjoner KIT ekson 9,11,13,17 PDGFRA ekson 12,14,18 F-primer PCR-produkt 223 bp R-primer direkte sekvensering alle ekson Sjekker PCR-produkter F Sekvensering: F og R R KIT ekson 11 KIT exon 17, Asp816 normal allele: GAC -> Asp mutated allele: CAC -> His etter behandling mutated allele: CAC -> His resistent Imatinib før behandling normal allele: GAC -> Asp ekson Type mutasjon eksempel Hyppighet % KIT 80 9 duplikasjon c.1504_1509dup; p.ala502_tyr503du p 11 delesjoner/insersjoner subsetusjoner ITD 550-561 557, 559, 560, 576 3 ende 10-20 merk o>e lokalisert i tynntarm, økt dose ImaEnib 70 best respons ImaEnib delesjon 557-558: prognosesk faktor for Elbakefall 13 punktmutasjon 642 <0.5 sekundære mutasjoner 14 punktmutasjon 670 kun sekundære mutasjoner 17 subsetusjoner Asp816, Asp820, Asn822 PDGFRA 5 12 delesjoner/insersjoner punktmutasjon insersjon p.glu556_ile565dup 561, 582-586 14 missens 659 <0.5 18 Delesjon subsetusjon Villtype Ingen mutasjoner KIT eller PDGFRA <0.1 middels respons ImaEnib 1 god respons ImaEnib 842-847 2-3 D842V: dårlig repsons på ImaEnib, andre mutasjoner sensieve 10-15 dårlig respons ImaEnib 5
fettsvulst Sekundære mutasjoner? LIPOM HØYT DIFFERENSIERT LIPOSARKOM TEST qpcr MDM2/CDK4 Tyrosinkinase domener: t(3;12) Exon 13 Exon 14 Exon 17 Coindre 2009 http://www.humangenetik.uni-bremen.de Mutasjoner i eller nær ATP-bindingslomme som tilsvarer kjente bindingsseter for gleevec Rearrangeringer kromosom 12 Normalt kopitall av MDM2 og CDK4 Ringkromosomer med amplifiserte sekvenser fra kromosom 12 MDM2 og CDK4 Coindre et al. 2009 Metode Kvantitativ PCR, MDM2/CDK4 fersk vev parafinblokk DNA Absolutt kvantitering standardkurve qpcr Kvantitativ PCR for: MDM2 (12q13-14) CDK4 (12q13) ALB, kontrollgen (4q13.3) Hurtig Sensitiv Spesifikk Robust Kvantitativ PCR MDM2 Beregnet amplifikasjon: CDK4 Mengde MDM2/ALB= 10,7 Mengde CDK4/ALB= 4,9 ALB, kontroll eksempel liposarkom retroperitoneum Kvinne 64 år Tumor i lysken og retroperitonealt To separate svulster? lyske MDM2 CDK4 Beregnet amplifikasjon: Mengde MDM2/ALB= 0,7 Mengde CDK4/ALB= 0,8 ALB Amplifikasjon: Mengde MDM2/ALB=12,3 Mengde CDK4/ALB= 10,8 6
Når bør molekylærpatologi anvendes? Småcellede og rundcellede svulster (hos barn) EWSR1-FLI1/ERG PAX3/7-FOXO1 Synovialt sarkom SS18-SSX1/2/4 Lipomatøse tumorer Velldifferensierte liposarkom, MDM2-CDK4 myxoid liposarkom, FUS-DDIT3 Gastrointestinal stromale tumorer (GIST) ckit / PDGFRA mutasjoner EV vise med ex Methods for detection of translocations Karyotyping fresh tissue difficult on FNA Fluorescence in situ Hybridisation, FISH paraffin embedded tissue FNA RT-PCR fresh and frozen tissue paraffin embedded tissue FNA Large structural abnormalities No foreknowledge required Can take time to grow cells Interphase cells can be analysed Sensitive, fast method, can detect heterogeneity Specific Fast method type of rearrangement is Extremely determined sensitive by the probe Small amount of tissue needed is very fragile Primer specific, variant translocation may be missed Tolkning Diagnose Test Fusjonspositive med primere i vår test Andre genfusjoner Alternative metoder Alveolært rhabdomyosarkom 80 % < 1% FISH Myxoid liposarkom FUS-DDIT3 85 % EWSR1-DDIT3 FISH Ewings sarkom/ PNET EWSR1-FLI1/ ERG 90 % EWSR1-ETV1 EWSR1-ETV4 EWSR1-FEV EWSR1-PATZ1 mm FISH Synovialt sarkom PAX3/7- FOXO1 SS18- SSX1/2/4 > 95 % < 5% FISH 7