DNLF kurs Diakonhjemmet November 12 2015 Tuberkulose i allmennpraksis Tone Tønjum Avdeling for mikrobiologi
Mycobacterium tuberculosis og tuberkulose Oversikt Tuberkulose (TB) Epidemiologi, klinikk, patogenese M. tuberculosis-komplekset og NTM Diagnostikk agens, resistens, epidemiologi TB behandling Diagnostikk av vertsrespons ved TB
Mykobakteriediagnostikk - OUS-RH
TB-utfordringen De 22 mest TB-belastede land 1/3 av verdens befolkning er infisert med Mtb
Global TB insides Drug-resistant Mtb 1/3 av verdens befolkning er kolonisert med Mtb Data from WHO, 2014
TB-utfordringen 1.3 millioner dødsfall 8.6 million nye TB tilfeller 2.0 milliarder PPD+ individer WHO anslag for 2020: 1 milliard personer nylig infisert 200 millioner TB-tilfeller 35 millioner dødsfall
Den globale TB-sitasjonen! TB-insidensen er nå fallende! Insidens-ratene fra 2010-11 faller i alle deler av verden, fallet var 0.5% i Øst-Europa, 2.0% I Sørøst-Asia, 3.1% i Afrika, 3.8% i Amerikas og 8.5% per år i Europa Men: MDR- og XDR-TB er økende!! 7
TB i Norge Jevn stigning i forekomst av tuberkulose i Norge, fra 201 tilfeller i 1996 til 405 tilfeller i 2014 Insidensen blant norskfødte var i 2014 blant de laveste i verden, på under ett tilfelle per 100 000 innbyggere 8
Årsaken til TB Mycobacterium tuberculosis: Medlem av Mtb-komplekset Ikke-bevegelig og ikke-sporulerende staver (1-10 μm i lengde, 0.2-0.6 μm i bredde) En aerob bakterie Deler seg hver 16-20 time (svært langsomtvoksende) Klassifisert som Gram-positiv, men er vanskelig å farge pga svært høyt lipid- og mykolsyre-innhold i celleveggen Siden MTB beholder visse farger selv etter syrebehandling, kalles de syrefaste bakterier
Tuberkulose kan forårsakes av andre medlemmer av M. tuberculosis-komplekset enn Mtb Mycobacterium bovis Mycobacterium africanum Mycobacterium microti M. canettii: mindre virulent enn den klassiske M. tuberculosis H37Rv M. caprae: en art som finnes primært hos spanske geiter, samt hos mennesker M. pinnipedii: gir TB hos marine vertsdyr
Tuberkulosens historie 1679, Sylvius identifiserte tuberkelen som en konsistent og karakteristisk forandring i lungene, og beskrev progresjonen til abscesser og kaviteter 1720, Benjamin Marten foreslo en ny teori for årsaken til TB - vidunderlige bittesmå levende skapninger
Tuberkulosens historie 1882 Robert Koch oppdaget en fargemetode for å påvise Mycobacterium tuberculosis mikroskopisk 1874 Armauer-Hansen: Mycobacterium leprae
Tuberkulosens historie 1895, Roentgen oppdaget røntgenstråling/x-ray 1921, BCG vaksine 1944, streptomycin og para-aminosalicylic acid (PAS) ble utviklet 1950-1960/70-tallet, isoniazid, rifampicin og andre anti-tb medikamenter utviklet develped 1980 - HIV 1990-tallet - DOTS
Aerosolspredning fra pasient med TB Aerosoldråpnene må ha riktig størrelse (1-5 um) for å nå alveolene
Tuberkulose overføring av smitte Høy sittsomhet Luftveiene er hovedinnfallsport Oftest overført via luft pga hoste, nysing og tale Tre tusen aerosoldråper spres ved 1 host, 1 minutt sang og 5 minutters samtale
Klassiske symptomer lungetuberkulose utgjør 85% av tilfellene Langvarig hoste (over tre uker), etter hvert med oppspytt Vekttap Nedsatt allmenntilstand Feber Nattesvette Sjeldnere symptomer er: Brystsmerte, tung pust, blodtilblandet oppspytt
Tuberkulose - klinikk Ekstrapulmonal TB TB-lymfadenitt Hud-TB Potts sykdom TB peritonitt og lever-tb Intestinal TB
Tuberkulose - klinikk Ekstrapulmonal TB Extrapulmonal TB 15% Ryggmarg/Ryggsøyle Hjerne Meninger
Testes TB Tuberkulose - klinikk Ekstrapulmonal TB Ovarie-TB TB endometritt Binyre-TB 19
TB patogenese Pieters, J. (2008). Cell Host and Microbe 3:399-407 Vandal, O. H., et al. (2009). J. Bact.191:4714-4721
Mycobacterium tuberculosis: patogenese og latens FEMS Microbiology Reviews 36, 514-532, 2012
Tuberkulose utfall av infeksjon Faktorer som kan bidra til progresjon av latent infeksjon til aktiv TB sykdom omfatter: Immunstatus HIV infeksjon Genetikk Miljøfaktorer Ernæring, alkohol Underliggende medisinske vertsforhold Bakterielle virulensfaktorer lite kartlagt
Diagnostikk Prøvetaking ved mistanke om TB Rekvirer dir mikro, PCR og dyrkning NB! Utfylling av rekvisisjon! Lungetuberkulose: Luftveisprøver (larynksaspirat, ekspektorat, BAL): 3X Ekstrapulmonal TB: 6X uriner 10 ml spinalvæske Prøver fra lokale lokalisasjoner: glandler, halscyster, biopsier, etc
Diagnostikk Flyt- skjema http://www.fhi.no/publikasjoner-og-haandboker/tuberkuloseveilederen
TB: Den diagnostiske utfordringen Mål: Høy sensitivitet og spesifisitet i både direkte påvisning og dyrkning! 25
Klinisk prøvemateriale TB-lab Dekontaminasjon +/- Kultur BACTEC MGIT 960 0.8 ml Panta + 0.5 ml prøve Tumor colli: + FOS 0.5 ml Tumor colli/sår: + 30oC Kultur pos: Ring svar Identifikasjon, MSIS Direkte påvisning - Mikroskopi: Auraminfarging Auramin pos: Ring svar, Mtb PCR, meld MSIS - Mtb PCR for identifikasjon PCR pos: Ring svar - Mtb Rifampicinresistens/ rpob, RpoB pos/neg: Ring svar Resistensbestemmelse -Rifampicin-resistens (PCR sequencing rpob) Ring svar - Kultur Mtb res.best. Ring svar NB! Meld multiresistente stammer (samtidig Rifampicin og Isoniazid resistens)
Direkte påvisning ved mikroskopi Auramin-farging Ziehl-Neelsen-farging 27
Direkte påvisning ved PCR: Cobas TaqMan MTB Test Sensitivitet Taqman: Luftveisprøver: 98.9% (Direkte mikro neg: 98.1%) Ekstrapulmonale prøver: 88.9% (Direkte mikro neg: 85.4%) 28
Rifampicin-resistens som surrogat-markør for MDR- og XDR-Mtb RIF-resistens som mono-resistens er ikke vanlig (5-15%) 80-95% av RIF-resistente stammer er også resistente overfor INH 29
Genetikk ved Mtb rifampicin-resistens 30
GenXpert MTB/RIF: direkte påvisning av Mtb og rifampicin-resistens Boehme et al NEJM 2010 Helb et al., JCM 48:29-237, 31 2010 Blakemore et al., JCM 48:2495-2501, 2010
GeneXpert: Enkel prøvepreparering 1. Inoculate media and prepare smear from deposit 2. Add 1.5ml Sample Reagent to 0.5ml deposit 3. Shake then stand10 min. 5. Transfer the 2ml to cartridge 4. Shake then stand further 5 minutes Begin Test 32
GeneXpert MTB/RIF molecular beacon-testen A C D 5-3 - B rpob gene E -3-5 5 Probes bind to wildtype Probes do not bind to mutant sequence Molecular Beacon 6 fluorescent dyes detected simultaneously Target Hybrid PAGE 33 33
Mtb GenXpert sensitivitet/spesifisitet Xpert Positive Xpert Negative Smear negative Culture Positive Sensivity in smear positive, culture positive (S+C+) was 100% (275/275) Sensitivity in smear negative, culture positive (S-C+) was 90.9% (70/77) Specificity of the assay was 98.3% Culture Negative Smear Positive Culture Positive 70 5 275 7 289 0 Sensitivity observed for rifampicin resistance was 96.7% Specificity observed for rifampicin resistance was 98.6% 34
GenXpert TB/Rif Resultater like i alle geografiske områder Mulig begrensning: Elektrisitet tilgjengelig, høy temperature Høyere sensitivitet enn mikroskopi Xpert MTB/RIF kort opptrening ila 2-3 dager Ziehl-Neelsen opptrening tar 2 uker Xpert MTB/RIF kort hands-on tid < 15 minutter 35
Xpert MTB/RIF: biosafety levels required Ikke nødvendig med laboratorium med sikkerhetsbenk (CDC) 36 PAGE 36
Dyrkning av mykobakterier Löwenstein-Jenssen fast medium:eggeplommer m.m. Høy kompleksitet Deteksjon ved visuell inspeksjon BACTEC MGIT 960 medmiddlebrook liquid 7H9 medium Deteksjon av fluorescence ved oksygenreduksjon/forbruk
BACTEC MGIT 960 1. Helautomatisert dyrkningssystem for mykobakterier 2. Inkubering og påvisning/deteksjon i det samme systemet 3. Gulvmodell med 3 skuffer med plass til 320 MGIT-rør i hver skuff. Total kapasitet 960 rør; 8000 kulturer hvert år 5. Fluorescens-basert teknologi: Oksygen forbruk fluorescens
Resistensbestemmelse Gjelder Mtb, sjelden NTM Førstelinje-medikamenter: Rifampicin, isoniazid, pyrazinamid, etambutol, streptomycin testes i TB rutinelab Andrelinje-medikamenter: Fluoroquinoloner, capreomycin, kanamycin, amikacin,.. Bedaquiline.. Mer underveis.. testes TB referanselab
Resistensbestemmelse Löwensten- Jenssen s medium (LJ) BACTEC MGIT 960
Økt deteksjon og hurtigere vekst av mykobakterier ved tilsetning av næringscocktail Fastidious Organism Supplement (FOS)
1. 22.7% høyere sensitivitet og signifikant kortere tid nødvendig for vekst av M. tuberculosis isolater når cocktail-supplement tilsatt, økt sensitivitet 38% for NTM 2. 4-7 dager kortere dyrkningstid 60 Time until growth 50 40 30 20 No supplements No supplements Supplements added 10 0 Supplements added 1 5 9 13 17 21 25 29 33 37 41 45 49 53 57 61 65 69 73 Specimen no.
TB-diagnostikk - utfordringer Oppdaterte metoder høy sensitivitet og spesifisitet, også i direkte påvisning Optimal logistikk rask diagnostikk Hyppig telefonbeskjeder og foreløpig elektronisk svar god og rask service
All antibiotikaresistens hos mykobakterier skyldes punktmutasjoner eller andre endringer i kromosomale gener
Gener som kan kode for Mtb resistensutvikling Rifampicin: rpob (RNA polymerase B subunit) Isoniazid: katg (katalase-peroxidase), inha (enoyl-acyl carrier protein reductase), aphc (alkyl-hydroperoxide reductase), kasa (keto-acyl synthase), ndh (NADH dehydrogenase), etc. Pyrazinamid: pnca(pyrazinamidase) Streptomycin: rpsl (S12), rrs (16S rdna) Ethambutol: embb (arabinosyl transferase) Kinoloner: gyra, gyrb (DNA gyraser) Flere..
TB molekulær epidemiologi Metoder IS6110 Spoligotyping Minisatelitter: Variable Number Tandem Repeats (VNTR)/ Mycobacterial Interspersed Repetitive Units (MIRU) Multiple Locus VNTR (Variable Number of Tandem Repeats) Analysis (MLVA): basert på polymorfi i tandem-repeterte DNA sekvenser
IS6110-basert fingerprinting: Restriction Fragment Length Polymorphism, RFLP av # IS6110-kopier i TB-genomer (0-25) Mest diskriminerende metode Tidkrevende metode (2-4 uker) Vanskelig å sammenligne store datasett PCR-RFLP Hemi-nested Inverse PCR (HIP) RAPD 1353 603 310
Spoligotyping: Spacer Oligonucleotide Typing Direkte repeterte (DR) elementer 36bp, frekvens varierer Bruker primere for DR til å amplifisere flankerende ikke-repetitive spacer-sekvenser 34-41bp Identifiserer spacerne ved hybridisering Mindre diskriminerende enn IS6110 typing MEN... Raskere å utføre, kortere turnaround time Digitale resultater, muliggjør sammenligning fra stamme til stamme Kan gjøres direkte, krever ikke kultur Variable Number of Tandem Repeats Measures variability in 6 (av 24) loci Mycobacterial Interspersed Repetitive Units Measures variability in 12 loci
Molekylær epidemiologi kan spore utbrudd: Spoligotyping & MIRU-VNTR IS 6110 RFLP Current gold standard MIRU-VNTR Up to DR 24 loci in genome
Nye utfordringer innen TB Antibiotikaresistens: MDR XDR Immun-evasjon & tilpasning / adaptasjon Økt virulens / overlevelse
M. tuberculosis genom-karakteristika 4,411,532 basepar 3,959 ORFs 90.80% ORFs encodes proteins G-C content of 65.6 % Relatively constant G-C content 1 rrna operon Cole et al., Nature 393, 537-44, 1998
Mycobacterium tuberculosis Genomsekvensering: short-term & long-term evolution Dance-academy outbreak; Beijing strains 200 Mtb genomes, 43000 polymorphic sites Lineage 7; New lineage
Tuberkulose - behandling WHOs anbefaling: Kombinasjonsbehandling: Isoniazid Rifampicin Pyrazinamide evt ethambutol, streptomycin NB! Direkte observert terapi!
Standard medikamentregime ved tuberkulose Intensivfase 2 måneder Isoniazid; Rifampicin; Pyrazinamid; Etambutol Fortsettelsesfase 4 måneder Isoniazid; Rifampicin
Standard medikamentregime ved tuberkulose Medikament (Forkortelse) Dosering Daglig behandling Dosering Behandling 3x/uke Isoniazid (H) 5 mg/kg* (Maks 300 mg ) 10 15 mg/kg (Maks 900 mg) Rifampicin (R) 10 mg/kg (Maks 600 mg) 10 mg/kg (Maks 600 mg) Pyrazinamid (Z) 25 mg/kg (Maks 2 g) 35 mg/kg (Maks 3 g) Etambutol (E) 15 mg/kg** (Maks 1,6 g) 30 mg/kg (Maks 2,4 g ) Streptomycin (S) 15 mg/kg (Maks 1,0 g) 15 mg/kg (Maks 1,5 g) Dosering: En gang daglig, evt til fettrikt måltid Evt supplere med pyridoksin 40 mg daglig, gis til pasienter i dårlig ernæringsstatus, gravide og ammende og ved økt risiko for nevropati for å forebygge nevrologiske bivirkninger av isoniazid
TB behandling Førstelinje-medikamenter: Rifampicin, isoniazid, pyrazinamide, ethambutol, streptomycin Andrelinje-medikamenter: Fluoroquinolonex, capreomycin, kanamycin, amikacin,.. Bedaquiline.. Behov for flere.. Trussel: MDR-Mtb XDR Mtb
Prøver og undersøkelser som utføres ved oppfølging av TB- behandling Tidspunkt Blodprøver Lungerøntgen/ Tuberkulose-undersøkelse skjermbilde Andre av luftveisprøve tester Ved behandlingsstart hemoglobin (Hb), leukocytter Lungerøntgen(hvis (LPK), SR, CRP ASAT, ikke nylig tatt), ev. ALAT, bilirubin, urinsyre, supplert med CT kreatinin, urinstoff, hivtest, thorax ev.hepatitt B og hepatitt C direkte mikroskopi, PCR og dyrkning Etter 2 uker Hb, LPK, SR, CRP, ASAT, ALAT, bilirubin, kreatinin, urinstoff, trombocytter direkte mikroskopi Etter 2 måneder Hb, LPK, SR, CRP ASAT, ALAT, bilirubin, kreatinin, urinstoff, trombocytter Lungerøntgen direkte mikroskopi og dyrkning Etter 4 måneder Hb, LPK, SR, CRP ASAT, ALAT, bilirubin, kreatinin, urinstoff, trombocytter direkte mikroskopi og dyrkning Ved opphør av behandling, vanligvis etter 6 måneder Hb, LPK, SR, CRP, ASAT, ALAT, bilirubin, kreatinin, urinstoff, trombocytter Lungerøntgen direkte mikroskopi og dyrkning
Tuberkulintest: Mantoux Mantoux-metoden med standard Purified Protein Derivate: PPD med styrke 2 tuberkulinenheter (TU) Tuberkulinreaksjonen: intrakutan injeksjon en typisk type IV-reaksjon = forsinket hypersensitivitet / cellemediert immunitet: Makrofager og Th1-lymfocytter 58
Mantoux - avlesning 72 t - - 16-18 mm 59
Interferon gamma release assays (IGRA) Tilgjengelige tester Quantiferon TB Gold (In Tube)-ELISA: Utføres ved alle regionale mikrobiologiske laboratorier ELISpot - Utføres ved referanselaboratoriet, FHI
TB Aktivering vs latens Immunologisk hukommelse: Tidligere sensitiviserte celler Steps to T Cell Activation: T cells recognize antigen not in its natural form; rather the antigen is presented by reference structures encoded by the major..t cell groups. Cell Host & Microbe, Volume 4, Issue 3, 2008, 219-228
Immunologisk diagnostikk: Interferon Gamma Release Assay (IGRA) Prinsipper Presentasjon av myko antigen PPD Mantoux hudtest: måler indurasjon/erytem In vitro blodtest: Måler IFNgamma-produksjon Antigen: ESAT-6, CFP-10. TB7.7 IGRA 62
Immmunologiske prinsipper TB IGRA Mtb antigenene ESAT-6, CFP-10, and TB7.7 finnes i: M. tuberculosis, M. bovis, M. africanum 4 atypiske mykobakteriearter/ntm: M. kansasii, M. szulgai, M. flavescens, M. marinum Finnes ikke i BCG
TB IGRA Tester Source: Nature Clinical Practice Rheumatology (2007) QuantiFERON TB-GOLD (QFT) måler nivået av frigjort IFN-g i plasma med ELISA-teknikk (enzyme linked immunosorbent assay) etter stimulering og inkubering av fullblod over natt. ESAT-6 og CFP- 10 er tilsatt direkte i bunnen av tapperøret. ELISA-prosedyren kan gjøres neste dag, eller plasma kan lagres i rørene i opptil 8 uker på kjøl eller 3 måneder i -20 C frys før analyse analyse av OD-verdier og kalkulering av resultater minus neg kontroll IU/ml verdien IFN-gamma = 0.35 IU/ml anses som sannsynlig tuberkuloseinfeksjon T- SPOT-TB er en ELISPOT basert test som detekterer IFN-gproduserende T celler (spots) etter antigen-stimulering av et definert antall mononucleære celler isolert fra blod. mer sensitiv enn tuberkulintest og QFT for individer med immunsvikt, inkludert lavt CD4 tall. Stimulering av celler og inkubering over natt må gjøres samme dag som prøven tas, og ELISPOT prosedyren må gjøres dagen etter. Med T-Cell Xtend TM kan imidlertid blodet transporteres eller lagres ved romtemperatur i opptil 32 timer før celler isoleres og testen utføres 64
Quantiferon i praksis Spesielle prøvetakingsglass: 3 glass, 1 ml i hver Forbehandling av prøven Inkubering(37oC, 16-24t) Sentrifugeres før forsendelse Positiv og negativ kontroll
IGRA Sensitivitet og spesifisitet Sensitivitet: 75-97% Spesifisitet: 90-100% God spesifisitet Usikker sensitivitet, særlig i spesielle pasientgrupper: Små barn Pasienter med immunsvikt Mulig TB-smitte - lang tid tilbake Usikker negativ prediktiv verdi Pai M. Expert Rev. Mol. Diagn. 2006; 6 (3), p 413-422 Pai M., Ann of Int Med 2008
Diagnostikk av latent tuberkulose: Hvorfor? Identifisere de som skal ha profylaktisk behandling Reaktivering - viktigste årsak til ikkeimportert sykdom i områder med lav forekomst av TB Ved positiv Mantoux for å utelukke falsk positiv test Ved negativ Mantoux der mistanke om falsk negativ test pga anergi
Når skal IGRA-tester anvendes? Mantoux er fortsatt første test Supplement til tuberkulin hudtest utført på risikogrupper Ved positiv tuberkulintest for å utelukke falsk positiv test (NTM/BCG-vaksine) Ved negativ tuberkulintest som mistenkes å være falsk negativ på grunn av T celleanergi Pasienter som skal tilbys forebyggende behandling dersom testen er positiv
Spesielle grupper Utredning av tuberkulosesmitte ved svekket immunitet Små barn 0-5 år Immunsvekkede HIV Før oppstart immunosuppressiv behandling Aktiv tuberkulose Helsearbeidere Asylsøkere
IGRA: Oppsummering Ingen gullstandard! Resultat må sees i sammenheng med: Smitterisiko Klinisk vurdering Øvrig diagnostikk Alder og generell immunstatus Nyttig hos definerte risikogrupper Best egnet i lavendemisk land med BCG vaksinasjon
Behandling av latent TB Behandling bør tilbys med mindre det er tungtveiende grunner for ikke å gjøre det Behandling bør vurderes, men risiko for bivirkninger må vurderes nøye Behandling er vanligvis ikke indisert, med mindre det foreligger annen risiko
Stopp TB