Biologisk monitering Analytiske utfordringer Skaper, bruker og formidler kunnskap om arbeid og helse Forskningsdirektør Prof. Pål Molander 1,2 1 Statens arbeidsmiljøinstitutt (STAMI) 2 Kjemisk institutt, Universitetet i Oslo Seminar om biologisk monitering OLF, Stavanger 15.12.2008
Statens arbeidsmiljøinstitutt (STAMI) Det nasjonale forskningsinstituttet på arbeidsmiljøområdet Etat under Arbeids- og inkluderingsdepartementet (AID) Faglig rådgiver for Arbeidstilsynet og Petroleumstilsynet Budsjett på ca. 100 mill. pr. år Ca. 120 ansatte, tverrfaglighet 2
Kjemisk helsefare Omstridt faktagrunnlag Ca. 1.000 dødsfall årlig i Norge kan relateres til arbeidsmiljøfaktorer (ca. 50 arbeidsulykker) (Atil). Atil estimerer at minst 500 dødsfall årlig skyldes kjemisk arbeidsmiljø Fortsatt ca. 60 meldte løsemiddelskader årlig, 50 KOLS, 100 yrkesastma SSB levekårsundersøkelse 2006: 8% av arbeidsstokken oppgir at de blir yrkeseksponert for kjemikalier (ca. 200.000), i enkelte yrker opp til 40% To myndighetsrapporter er nylig blitt fremlagt: Pilotprosjekt Kjemisk arbeidsmiljø i petroleumssektoren (Ptil) Kjemikaliekampanjen 2003-2006 (Atil) Hovedbudskap: Kunnskapen om eksponeringsforhold (kjemiske) i norsk arbeidsliv er begrenset Bare 25% av bedriftene i utvalgte bransjer med kjemisk eksponering har gjennomført en (god nok) lovpålagt risikovurdering 3
Kjemisk helsefare Omstridt faktagrunnlag European Agency for Occupational Health and Safety at Work (Bilbaoinstituttet): Estimert 2,3 millioner arbeidsrelaterte dødsfall i verden årlig, hvorav ca. 167.000 er i Europa (ca. 200 millioner sysselsatte i Europa) 160.000 arbeidsrelatert sykdom 74.000 relatert til yrkeseksponering for helseskadelige kjemikalier I Norge ca. 1.700 arbeidsrelaterte dødsfall årlig (ca. 4%) EU: 1 arbeidsrelatert dødsfall hvert 3,5 minutt Internasjonale studier: Ca. 15% av astma, kronisk obstruktiv lungesykdom (KOLS) og lungekreft, samt ca. 17% av alle hjerte/karsykdomsdødsfall har sin bakgrunn i det kjemiske arbeidsmiljøet (menn) 4
Hvor mange kjemikalier har vi? Andel deklarasjoner helsefarlige Ca. 15.000 (35.000) produkter Ca. 10.000 kjemiske stoffer Ca. 70 meget giftig Ca 2.000 giftig Ca 8.000 irriterende Ca 8.000 allergifremkallende Ca 1.000 kreftfremkallende Ca 500 reproduksjonsskadelige Ca 1.000 arvestoffskadelige Ca 15.000 helskadelige 5
Biologisk monitering Albertini et al., Mutation Research, 2001, 480-481, 317-331. 6
Biologisk monitering Organiske, uorganiske og biologiske eksponeringer Eksempler på instrumentelle anlytiske analyseteknikker: Organisk - Separasjonsteknikker - Spektroskopi - Massepektrometri - Ekstraksjonsprinsipper - Immunoassays Uorganisk - Spektroskopi - Massespektrometri - Elektroanalytiske metoder - Radiokjemiske metoder Væskekromatografi (HPLC) Gasskromatografi (GC) Superkritiskfluidkromatografi Kapillær elektrokromatografi (CEC) Kapillær elektroforese (CE) 7
Instrumentell organisk analytisk kjemi Det er veldig mange organiske forbindelser i typiske biologiske matrikser, både naturlig forekommende forbindelser og fremmedstoffer For å kunne måle organiske enkeltkomponenter i biologiske prøver kreves det ofte både en prøveopparbeidelse (prøver å bli kvitt alt vi ikke er interessert i samt forsøker å oppkonsentrere prøven) og separasjon (ofte en kromatografisk separasjon hvor man separerer de(n) aktuelle komponenten(e) fra hverandre i en tid slik at disse kan detekteres (måles) enkeltvis. t 0 Sample preparation Separation t 1 Selectivity/specificity? t 2 Detection 8
Kromatografi Flyktige forbindelser: Ikke-flyktige forbindelser: Gasskromatografi (GC) Væskekromatografi (HPLC) Paradigmeskifte på midten av 1990-tallet: Kommersiell LC-MS (væskekromatografi koplet til massespektroskopi) 9
LC-MS 10
LC-MS Høy selektivitet Ofte høy følsomhet 11
LC-MS Multiple choice LC Ionization Mass analyzer RP ESI Q NP APCI QqQ IC APPI TOF SEC MALDI qtof (CE/CEC) ICP IT 12
Miniatyrisert LC-MS Lavere fortynning Lavere deteksjonsgrenser 13
Foreløpig konklusjon Nye og forbedrede analytisk-kjemiske teknikker har de senere år utvidet drastisk mulighetene for å kunne måle kjemiske forbindelser i biologiske matrikser Både forbedret selektivitet, følsomhet og robusthet Gitt et kompetent og velutstyrt laboratorium: Kan måle lavere nivåer av flere forbindelser enn tidligere på en bedre kvalitetssikret måte til en relativt lav pris Hva kan man bruke denne kunnskapen til? Mangler for de fleste forbindelser kunnskap om dose-respons forhold Mangler for mange forbindelser kunnskap om biologisk relevans (eks. ytre miljø) Få miljøer som både har kunnskap om og et balansert forhold til biomonitering i seg selv og biologisk relevans/helse 14
Ytre miljø vs. arbeidsmiljø? Forskjellig risikoforståelse? 15
Ytre miljø vs. arbeidsmiljø Eksempel bromerte flammehemmere 16
Ytre miljø vs. arbeidsmiljø Eksempel bromerte flammehemmere HBCD en av fokuskjemikaliene i ytre miljø Påvises i økende grad i morsmelk, selspekk mm. Tidligere ikke studert i arbeidsmiljø 1 vitenskapelig publikasjon i 2007 fra Norge (STAMI) 10-1000 ganger høyere nivåer i blod fra arbeiderne enn tidligere høyest eksponerte Opp til 25.000 ganger høyere luftnivåer enn tidligere målt i byluft Finnes ikke administrativ norm i Norge Liten kunnskap om helseeffekter 17
Ytre miljø vs. arbeidsmiljø Eksempel bromerte flammehemmere 18
Biomonitoring: 1-hydroxypyrene in urine Column-switching µlc-esi-ms SIR [M-H] - m/z 217.1 Injection volume: 100 µl Urine dilution: 1:10 Focusing solvent composition (P1): ACN H 2 O (5:95, v/v) (120 µl/min) TIC MP (P2): ACN - 5 mm NH 4 Ac (70:30, v/v) (1 µl/min) SP: 0.15 x 30 mm, 10 µm Kromasil C 18 0.15 x 100 mm, 3.5 µm Kromasil C 18 clod ~ 200 pg/ml urine 19
Biomonitoring: B[a]P-tetrols DNA-adducts Column switching µlc-fluorescens-esi-ms/ms mlod ~ 200 pg/ml urine 20
Biomonitoring: Phathalate monoesters in urine Column-switching µlc-esi-ms (MRM) m/z 221.1 177.0 m/z 193.1 121.1 m/z 277.0 233.0 m/z 255.1 183.0 Injection volume: 200 µl Urine dilution: 1:10 Focusing solvent composition (P1): ACN H 2 O (HCl adjusted to ph 2) (15:85, v/v) (20 µl/min) MP (P2): THF - 5 mm NH 4 Ac (Gradient: 0.5 90% THF) (4 µl/min) SP: 0.32 x 30 mm, 5 µm Hypercarb 0.32 x 100 mm, 5 µm Hypercarb clod ~ 2 ng/ml urine 21
Biomonitoring: PFOS and PFOA in plasma Column-switching µlc-esi-tof-ms Injection volume: 250 µl Plasma dilution: 1:10 SIM [M-H] - m/z 413.4 SIM [M-H] - m/z 499.2 Focusing solvent composition (P1): ACN 10 mm NH 4 Ac (5:95, v/v) (100 µl/min) MP (P2): ACN 10 mm NH 4 Ac (Gradient: 0.5 90% ACN) (5 µl/min) SP: 0.32 x 30 mm, 10 µm Kromasil C 18 0.32 x 100 mm, 3.5 µm Kromasil C 18 clod ~ 500 pg/ml plasma 22
Biomonitoring: Cotinine in urine µlc-esi-ms/ms Røyker: 1406.76 µg/g kreatinin Passiv røyker: 30.49 µg/g kreatinin Relative abundance m/z 177 m/z 80 TIC 2.41 x 10 6 Relative abundance m/z 177 m/z 80 TIC 1.11 x 10 5 0 2 4 6 8 10 12 0 2 4 6 8 10 12 Retention (min) Retention time (min) 23
rat19 050598 (10.969)C m(596:61 0) TOFM SES+ 530.823 58 % 4 19.283 408.285 430.9 52 506.305 40.903 454.910 48 8.94 49 8.892 507. 327 531.319 531.362 541.82 9 5.370 56. 340 576.8 82587.2 64 10 0 m/z 4 0410 420430 404 50460 47048 0490 50510 52053 0540 50560 5705 80590 60 Biomonitering: Smertesignalpeptider i dialysevæske Column-switching µlc-esi-tof-ms µdialyse av signalpeptider fra rottemuskelvev 100-200 µl ekstrakt Bradykinin 100 530.845 531.319 % 0% 531.362 419.283 541.829 408.285 430.952 555.370 506.305 556.340 440.903 498.892 454.910 491.896 507.327 576.882 587.287 598.333 m/z 400 410 420 430 440 450 460 470 480 490 500 510 520 530 540 550 560 570 580 590 600 0 100 2.00 4.00 6.00 8.00 10.00 12.00 14.00 16.00 18.00 20.00 Arg-bradykinin Sml. med RIA: % 100 0% 352.951 356.263 406.265 406.284 406.595 406.935 430.962 440.933 498.850 532.938 576.848 608.895 609.356 619.886 675.867 686.868 760.818 350 375 400 425 450 475 500 525 550 575 600 625 650 675 700 725 750 775 800 -Forbedret deteksjonsgrense -Forbedret selektivitet m/z 0 2.00 4.00 6.00 8.00 10.00 12.00 14.00 16.00 18.00 20.00 Time 24
Biomonitoring bibliografi (ISI) (1960-tallet - 2009) 25
Occupational health - Bibliografi 26
Konklusjon Biomonitering gir et mål på opptak fra alle ruter, men det er store personlige forskjeller m.h.p. metabolisering og utskillelseshastigheter (toksikokinetikk) Dette begrenser i mange tilfeller verdien av biomonitorering som mål for eksponering på personnivå Biomonitorering er derimot godt egnet i yrkeshygienisk sammenheng til vurdering av grupper av arbeidstakere Mange og stadig flere robuste og appliserbare biomoniteringsmetoder er tilgjengelige for stadig flere biomarkører. Dette feltet har utviklet seg hurtig de senere årene. Stort kunnskapsbehov om biologisk relevans og dose-despons Mye pågående forskningsarbeid som studerer sammenhenger mellom eksponering og opptak (i kombinasjon med luftmålinger) 27
www.stami.no