(12) Oversettelse av europeisk patentskrift

Transkript

1 (12) Oversettelse av europeisk patentskrift (11) NO/EP B1 (19) NO NORGE (1) Int Cl. C12N 9/ (06.01) A61K 38/4 (06.01) Patentstyret (21) Oversettelse publisert (80) Dato for Den Europeiske Patentmyndighets publisering av det meddelte patentet (86) Europeisk søknadsnr (86) Europeisk innleveringsdag (87) Den europeiske søknadens Publiseringsdato.0.0 () Prioritet , US, 907 P (84) Utpekte stater AT BE BG CH CY CZ DE DK EE ES FI FR GB GR HR HU IE IS IT LI LT LU LV MC MT NL NO PL PT RO SE SI SK TR Utpekte samarbeidende stater AL BA MK RS (73) Innehaver Amgen, Inc, Patent Operations, M/S 28-2-C One Amgen Center Drive, Thousand Oaks, California , US-USA (72) Oppfinner ZHOU, Mingyue, 2878 Gettysburg Avenue, Hayward, CA 944, US-USA BOONE, Thomas, 271 Kelly Knoll Lane, Newbury Park, CA 913, US-USA MEININGER, David, Park, st Avenue, Seattle, WA 98121, US-USA SCHWARTZ, Margrit, 16 Hull Drive, San Carlos, CA 94070, US-USA SHAN, Bei, 349 Quay Lane, Redwood City, CA 9406, US-USA SHEN, Wenyan, 346 Bryant Street, Palo Alto, CA 946, CA-Canada (74) Fullmektig Onsagers AS, Postboks 1813 Vika, 0123 OSLO, Norge (4) Benevnelse Modifiserte lecitin-kolesterol-acetyltransferase-enzymer (6) Anførte publikasjoner WO-A-97/17434 WO-A-08/00291 WANG K ET AL: "Importance of the free sulfhydryl groups of lecithin-cholesterol acyltransferase for its sensitivity to oxidative inactivation." BIOCHIMICA ET BIOPHYSICA ACTA 1 NOV 00, vol. 1488, no. 3, 1 November 00 ( ), pages , XP ISSN: FRANCONE O L ET AL: "Effects of site-directed mutagenesis at residues cysteine-31 and cysteine-184 on lecithin-cholesterol acyltransferase activity." PROCEEDINGS OF THE NATIONAL ACADEMY OF SCIENCES OF THE UNITED STATES OF AMERICA 1 MAR 1991, vol. 88, no., 1 March 1991 ( ), pages , XP00160 ISSN: HENGSTSCHLÄGER-OTTNAD E ET AL: "Chicken lecithin-cholesterol acyltransferase. Molecular characterization reveals unusual structure and expression pattern." THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY 3 NOV 199, vol. 270, no. 44, 3 November 199 ( ), pages , XP ISSN:

2 1 Oppfinnelsens område Oppfinnelsen vedrører generelt fagområdet for medisin og mer spesifikt sammensetninger og fremgangsmåter for behandling av koronar hjertesykdom, aterosklerose, inflammatoriske forstyrrelser og forstørrelser som er assosiert med trombose. Bakgrunn for oppfinnelsen Over 0 millioner amerikanere har kardiovaskulære problemer, og mange andre land står foran høye og økende forekomster av kardiovaskulær sykdom. Det er den ledende årsaken til dødsfall og uførhet i USA og i de fleste europeiske land. På det tidspunktet hjerteproblemer blir påvist er den underliggende årsaken, aterosklerose, vanligvis ganske fremskredet, og har utviklet seg i årtier. Aterosklerose er en polygen kompleks sykdom hos pattedyr som er kjennetegnet ved deponeringen av plakk av lipider og andre blodderivater i arterieveggene (aorta, koronare arterier og halspulsåren). Disse plakkene kan i større eller mindre grad være forkalkede i overensstemmelse med progresjonen av prosessen. De er også assosierte med akkumuleringen av fettdeponeringer som i hovedsak består av kolesterolestere i arteriene. Kolesterol akkumuleres i skumcellene i arterieveggen, for derved å gjure lumen smalere og minske strømmen av blod. Dette følges av en fortykning av arterieveggen, med hypertrofi i glattmuskel, fremkomsten av skumceller og akkumuleringen av det fibrøse vevet. Hyperkolesterolemi kan dermed være resultatet i svært alvorlige kardiovaskulære patologier slik som infarkt, perifer vaskulær sykdom, slag, plutselig død, hjertedekompensering, cerebral vaskulære ulykker og liknende. Kolesterol blir fraktet i blodet med ulike lipoproteiner inkludert svært lavtetthetslipoprotein (VLDL), lavtetthets-lipoprotein (LDL) og høytetthets-lipoprotein (HDL). VLDL blir syntetisert i leveren og blir konvertert til LDL i blodet, noe som gjør det mulig å forsyne det perifere vevet med kolesterol. I motsetning til dette fanger HDL kolesterolmolekyler fra de perifere vevene og transporterer dem til leveren der de blir konvertert til gallesalter og utskilt. Utviklingen av aterosklerose og risikoen for koronar hjertesykdom (CHD) korrelerer inverst nivåene av HDL i serum. Gordon et al. (1989) N. Engl. J. Med. 321:1311, Goldbourt et al. (1997) Thromb. Vasc. Biol. 17:7. Lavt HDL-kolesterol forekommer ofte i konteksten med sentral fedme, diabetes og andre trekk ved det metabolske syndromet. Goldbourt et al., ovenfor. Det har blitt foreslått at lave HDL-kolesterolnivåer er assosiert med en økt risiko for CHD, mens høye konsentrasjoner av HDL har en beskyttende effekt mot utviklingen av prematur aterosklerose. Gordon et al. (1986) Circulation 74:1217. Studier viste at risikoen for utvikling av klinisk aterosklerose hos menn faller 2-3 % med hver 1 mg/dl økning i konsentrasjonen av HDL i plasma.

3 Gordon et al. (1989) N. Engl. Med. 321:1311. Det har blitt slått fast at konsentrasjoner av LDL-kolesterol kan bli redusert ved behandling med statiner, som er inhibitorer av kolesterolbiosyntese-enzymet 3-hydroksyl-3-metylglutarylkoenzym-A-reduktase og derved har denne behandlingen blitt benyttet som en vellykket tilnærming for å redusere risikoen for aterosklerose der den primære indikasjonen er høyt LDL-nivå. Det er likevel fremdeles uklart hvorvidt statiner er fordelaktige for pasienter hvis primære lipidunormalhet er lavt HDL-kolesterol. Lecitin-kolesterol-acyltransferase (LCAT) er et enzym som katalyserer forestringen av fritt kolesterol ved overføringen av en acylgryppe fra fosfatidylkolin på 3- hydroksylgruppen på kolesterol, for å danne kolesterylester og lysofosfatidylkolin. McLean et al. (1986) Proc. Natl. Acad. Sci. 83:233 og McLean et al. (1986) Nucleic Acids Res. 14(23):9397. LCAT blir syntetisert i leveren og utskilt i plasma der den blir kombinert med HDL, kalt anti-aterogene lipoproteiner. Disse HDLpartiklene har kapasiteten til å akseptere overskuddet av kolesterol, som deretter blir forestret med LCAT i HDL-partiklene. Kolesterylestermolekylene i HDL-partiklene blir enten transportert til leveren direkte gjennom SR-BI-reseptor, eller transformert til apob-inneholdende lipoproteiner, inkludert svær lavtetthets-lipoproteiner (VLDL) og LDL, mediert ved CETP og deretter transportert til leveren via LDLreseptorveien. Denne mekanismen, kalt revers kolesteroltransport (Glomset (1968) J. Lipid Res. 9:1) tillater fjerningen av overskudd av kolesterol fra kroppen, og er derfor involvert i forebyggingen av aterogenese. LCAT spiller en nøkkelrolle i denne prosessen ved å danne en gradient av fritt kolesterol mellom plasmamembranene og de sirkulerende lipoproteinene. Wang et al. (00), Biochim. Biophys. Acta 1488(3), diskuterer viktigheten av de frie sulfhydrylgruppene i LCAT for dens sensitivitet overfor oksidativ inaktivering. Denne oppfinnelsen tilveiebringer modifiserte LCAT-proteiner med økt enzymatisk aktivitet og/eller stabilitet og fremgangsmåter for behandling av koronar hjertesykdom, aterosklerose, inflammatoriske forstyrrelser og forstyrrelser assosiert med trombose ved å benytte disse modifiserte LCAT-proteinene. Oppfinnelsen vedrører: 1. Modifisert lecitin-kolesterol-acyltransferase (LCAT)-protein, der det modifiserte LCAT-proteinet omfatter en modifisering i den modne LCAT-aminosyresekvensen ifølge SEKV ID nr. 1 eller SEKV ID nr. 2 som vist på figur 2, og modifiseringen består av en substitusjon på aminosyrerest C31 valgt fra gruppen som består av C31I, C31M, C31F, C31V, C31W, C31Y, C31R og C31H. 2. Modifisert lecitin-kolesterol-acyltransferase (LCAT)-protein, der

4 3 1 2 det modifiserte LCAT-proteinet omfatter en modifisering i den modne LCAT-aminosyresekvensen ifølge SEKV ID nr. 1 eller SEKV ID nr. 2 som vist på figur 2, og modifiseringen består av en substitusjon på aminosyrerest C31 som er valgt fra gruppen som består av C31I, C31M, C31F, C31V, C31W, C31Y, C31R og C31H, og en ytterligere substitusjon på en aminosyrerestposisjon som er valgt fra gruppen som består av F1, L4, N, V28, P29, G, L32, G33 og N Modifisert LCAT-protein ifølge 2, der den ytterligere substitusjonen er valgt fra gruppen som består av F1A, L4F, NE, NQ, ND, NA, V28A, V28I, V28C, V28T, V28R, P29G, P29F, P29T, GA, GI, L32A, L32I, L32M, L32F, L32C, L32W, L32Y, L32T, L32S, L32N, L32H, L32E, G33I, G33M, G33F, G33S, G33H, N34A, N34C, N34S og N34R. 4. Modifisert LCAT-protein ifølge 2, der C31-substitusjonen er en C31Ysubstitusjon og den ytterligere substitusjonen er på en aminosyrerestposisjon som er valgt fra gruppen som består av F1, L4, N, L32 og N34.. Modifisert LCAT-protein ifølge 4, der den ytterligere substitusjonen er valgt fra gruppen som består av F1S, F1W, L4F, L4M, ND, L4K, N34S, L32F og L32H. 6. Modifisert LCAT-protein ifølge, omfattende en L4F-substitusjon og en C31Y-substitusjon. 7. Modifisert LCAT-protein ifølge, omfattende en C31Y-substitusjon der den ytterligere substitusjonen er en ND-substitusjon. 8. Modifisert LCAT-protein ifølge 4, omfattende en N-substitusjon og en C31Y-substitusjon. 9. Modifisert LCAT-protein ifølge 4, omfattende en L4-substitusjon og en C31Y-substitusjon Modifisert LCAT-protein ifølge ethvert av 1-9, som har enzymatisk aktivitet som er høyere enn villtype-lcat-proteinet ifølge SEKV ID nr. 1 eller SEKV ID nr. 2 som bestemt i en plasma-lcat-aktivitets-kolesterolforestringsrate (CER)- analyse. 11. Modifisert LCAT-protein som omfatter LCAT-proteinet ifølge ethvert av 1- og en vehikkel.

5 4 12. Modifisert LCAT-protein ifølge 11, der vehikkelen er valgt fra gruppen som består av en immunoglobulin-konstant (Fc)-region, en vannløselig polymer og polyetylenglykol. 13. Farmasøytisk sammensetning omfattende et modifisert LCAT-protein ifølge ethvert av 1-12 og en farmasøytisk akseptabel bærer. 14. Modifisert LCAT-protein ifølge ethvert av 1-12 til anvendelse i terapi Modifisert LCAT-protein ifølge ethvert av 1-12, til anvendelse i en fremgangsmåte for behandling av en LCAT-relatert forstyrrelse. 16. Modifisert LCAT-protein ifølge 1 til anvendelse i en fremgangsmåte for behandling av en LCAT-relatert forstyrrelse, der den LCAT-relaterte forstyrrelsen er valgt fra gruppen som består av aterosklerose, inflammasjon, trombose, koronar hjertesykdom, høyt blodtrykk, LCAT-mangelsyndrom, Alzheimers sykdom, hornhinneopasitet, metabolsk syndrom, dyslipidemi, hjerteinfarkt, slag, kritisk lemiskemi og angina. 17. Modifisert LCAT-protein ifølge 1, der terapien er for å øke HDL-kolesterol eller forhindre akkumulering av kolesterol. 18. Modifisert LCAT-protein ifølge 1 til anvendelse i en fremgangsmåte for behandling eller forebygging av en kardiovaskulær sykdom. 19. Modifisert LCAT-protein ifølge 1 til anvendelse i behandling eller forebygging av aterosklerose.. Modifisert LCAT-protein ifølge ethvert av 1-19, der det modifiserte LCATproteinet blir administrert i kombinasjon med et ytterligere middel. 21. Modifisert LCAT-protein ifølge, der det ytterligere middelet er valgt fra gruppen som består av et cytokin, et ateroskleroselegemiddel, et kolesterolsenkende legemiddel, en ACE-inhibitor, et anti-inflammatorisk legemiddel og et antitromboselegemiddel og et anti-diabeteslegemiddel. Oppsummering av oppfinnelsen 40 Tilkjennegitt her blir modifiserte LCAT-proteiner omfattende en aminosyresubstitusjon i en villtype-lcat-proteinaminosyresekvens. I én utførelsesform er det modifiserte LCAT-proteiner mer enzymatisk aktivt enn villtype-lcat-proteinet som det modifiserte LCAT-proteiner er avledet fra. I en

6 annen utførelsesform øker det modifiserte LCAT-proteinet nivåer av høytetthetslipoprotein (HDL) et omfang som er større enn villtype-lcat-proteinet som det modifiserte LCAT-proteinet er utledet fra. I en annen utførelsesform er det modifiserte LCAT-proteinet mer stabilt in vivo, eller mindre immunogent en villtypeproteinet det er utledet fra. I en beskrivelse omfatter det modifiserte LCAT-proteinet en aminosyrerestsubstitusjon på posisjon 31 i SEKV ID nr. 1 eller på en posisjon i en ortolog villtype-lcat-proteinaminosyresekvens tilsvarende posisjon 31 i SEKV ID nr. 1 er substituert. I ulike utførelsesformer og beskrivelser er det modifiserte LCAT-proteinet avledet fra humant-, kanin-, ape-, hamster-, mus- eller rottevilltype-lcat-protein. I en annen beskrivelse er det modifiserte LCAT-proteinet utledet fra en villtype- LCAT-aminosyresekvens ifølge SEKV ID nr. 1, og inkluderer en substitusjon på posisjon F1, L3, L4, N, L7, C31, N384 eller E416. I ulike beskrivelser er substitusjonen F1A, F1G, F1I, F1L, F1M, F1P, F1V, F1C, F1Y, F1T, F1Q, F1N, F1H eller F1D. I andre beskrivelser er substitusjonen L3I, L3F, L3C, L3W eller L3Y. I andre beskrivelser er substitusjonen L4A, L4I, L4M, L4F, L4V, L4W, L4Y, L4T, L4Q eller L4R. I enda andre beskrivelser er substitusjonen NA, NM, NH, NK, ND eller NE. I andre beskrivelser er substitusjonen L7M, L7F eller L7E. I visse aspekter og beskrivelser er substitusjonen C31A, C31I, C31M, C31F, C31V, C31W, C31Y, C31T, C31R eller C31H. I andre beskrivelser er substitusjonen N384C, N384Q eller E416C. I andre utførelsesformer og beskrivelser omfatter det modifiserte LCAT-proteinet en substitusjon på posisjon C31 i SEKV ID nr. 1 og en substitusjon på aminosyrerestposisjon F1, L4, N, V28, P29, G, L32, G33 eller N34. I ulike aspekter og beskrivelser er substitusjonen F1A, L4F, NE, NQ, ND, NA, V28A, V28I, V28C, V28T, V28R, P29G, P29F, P29T, GA, GI, L32A, L32I, L32M, L32F, L32C, L32W, L32Y, L32T, L32S, L32N, L32H, L32E, G33I, G33M, G33F, G33S, G33H, N34A, N34C, N34S eller N34R. I andre aspekter og beskrivelser er substitusjonen på posisjon C31 lik C31A, C31I, C31M, C31F, C31V, C31W, C31Y, C31T, C31R eller C31H. I én utførelsesform omfatter det modifiserte LCATproteinet en C31Y-substitusjon og en tilleggssubstitusjon F1, L4, L32 eller N34, og i visse aspekter er disse substitusjonene F1S, F1W, L4M, L4K, N34S, L32F eller L32H. I enda andre utførelsesformer inkluderer et modifisert LCAT-protein som er beskrevet her ytterligere en vehikkel, og i ulike utførelsesformer er vehikkelen en immunoglobulin-konstant (Fc)-region eller en vannløselig polymer, eller mer spesifikt, en vannløselig polymer som er polyetylenglykol. I andre beskrivelser inkluderer en modifisert LCAT som tilveiebrakt her en region i villtype-lcat-protein-aminoterminalaminosyresekvens som er duplisert og

7 6 1 kovalent koblet til en terminal på det modifiserte LCAT-proteinet. I én beskrivelse er regionen for villtype-lcat-protein-aminoterminalaminosyresekvensen til 1 aminosyrer lang. I andre beskrivelser er regionen for villtype-lcat-proteinaminosyresekvensen duplisert og kovalent koblet til aminoterminalen til det modifiserte LCAT-proteinet, karboksy-terminalen på det modifiserte LCATproteinet eller begge. Også tilveiebrakt er farmasøytiske sammensetninger omfattende et modifisert LCAT-protein som tilveiebrakt her og en farmasøytisk akseptabel bærer. Anvendelser for behandling av en LCAT-relatert forstyrrelse er også tilveiebrakt som omfatter trinnet med administrering av en mengde av et modifisert LCATprotein som er tilveiebrakt her i en mengde som er effektiv til å behandle nevnte forstyrrelse. I ulike utførelsesformer blir det modifiserte LCAT administrert intravenøst eller administrert ved bolus. I ulike aspekter i anvendelsene er den LCAT-relaterte forstyrrelsen aterosklerose, inflammasjon, trombose, koronar hjertesykdom, høyt blodtrykk, LCAT-mangelsyndrom, Alzheimers sykdom, hornhinneopasitet, metabolsk syndrom. Dyslipidemi, hjerteinfarkt, slag, kritisk lemiskemi og/eller angina. Også tilveiebrakt er en anvendelse for økning av HDL-kolesterol hos et individ omfattende trinnet med administrering til individet av en terapeutisk effektiv mengde av modifisert LCAT-protein som tilveiebrakt her. Oppfinnelsen tilveiebringer ytterligere en anvendelse til forebygging av akkumulering av kolesterol hos et individ omfattende administrering av en terapeutisk effektiv mengde av et modifisert LCAT-protein som tilveiebrakt her. 2 3 Beskrivelse av tegningene Figur 1 tilveiebringer Genbank-aksesjonsnummer for villtype-lcat-proteiner som kan benyttes for fremstilling av modifiserte LCAT-proteiner. Figur 2 tilveiebringer aminosyresekvensen ifølge Genbank-aksesjonsnummer AAA9499 (SEKV ID nr. 2). Detaljert beskrivelse av oppfinnelsen I. Definisjoner Uttrykket «LCAT» eller «lecitin-kolesterol-acyltransferase» refererer slik de benyttes her til et villtype-glykoproteinenzym som katalyserer syntesen av kolesterolestere og lysolecitin fra fosfatidylkolin og uforestret kolesterol som er til stede i lipoproteiner. Dette enzymet blir primært produsert av leveren og sirkulerer i blod reversibelt bundet til lipoproteiner. Humant LCAT (SEKV ID nr. 1, Genbank-

8 7 aksesjonsnummer AAB34898) har en polypeptidmasse på 49 kda, eller omtrent 67 kda med karbohydratmassen. Ulike LCAT-aminosyresekvenser for oppnåelse av et modifisert LCAT-protein som er nyttig i denne oppfinnelsen er vist på figur 1. Humant LCAT (SEKV ID nr. 1, Genbank-aksesjonsnummer AAB34898) 1 2 Uttrykket «modifisert LCAT» refererer til lecitin-kolesterol-acyltransferase som definert ovenfor, der én eller flere aminosyrer i villtype-lcat-proteinet er substituert med en annen aminosyre, eller én eller flere aminosyrer er addert til enhver av endene eller i midten av villtype-lcat som det modifiserte LCATproteinet er avledet fra. Modifiserte LCAT-proteiner som det her gjelder har forbedrede farmakokinetiske egenskaper sammenlignet med villtype-lcatproteinet som det modifiserte LCAT-proteinet er utledet fra. Mer spesifikt har et modifisert LCAT-protein enten (i) økt enzymatisk aktivitet sammenlignet med villtype-lcat-proteinet som det modifiserte LCAT-proteinet er utledet slik dette er målt i de samme in vitro-analysebetingelsene, (ii) økt evne til å øke HDL-nivåer in vivo sammenlignet med villtype-lcat-protein som det modifiserte LCATproteinet er utledet fra, (iii) økt plasmastabilitet eller halveringstid, dvs. økt sirkulatorisk halveringstid, sammenlignet med plasmastabiliteten til villtype-lcat som det modifiserte LCAT-proteinet er utledet fra, og/eller (iv) minsket immunogenisitet (dvs. frembringer mindre av en immunrespons) sammenlignet med villtype-lcat-protein som det modifiserte LCAT-proteinet er utledet fra. Analyser for måling av LCAT-enzymaktivitet inkluderer for eksempel anvendelse av apoailiposomanalyse og anvendelse av plasma-lcat-aktivitetsanalyse, som henholdsvis bestemmer forestringsrate for kolesterol i et kunstig system og et fysiologisk relevant system. Analyser for måling av LCAT-stabilitet in vivo inkluderer ELISA, som bestemmer halveringstiden til rekombinant LCAT-protein i blodet etter LCATproteinadministrering. Biologisk aktive fragmenter av et modifisert LCAT-protein er kontemplert i det omfanget at fragmentet inkluderer aminosyre-endringen(e) som er introdusert i villtype-lcat-aminosyresekvensen. Uttrykkene «derivatiserende», «derivat» eller «derivatisert» omfatter prosesser og resulterende, modifiserte LCAT-proteiner der for eksempel og uten begrensning (1)

9 forbindelsen har en syklisk del, for eksempel kryssbinding mellom cysteinylrester i forbindelsen, (2) forbindelsen er kryssbundet eller har et kryssbindingssete, for eksempel har forbindelsen en cysteinylrest og danner slik kryssbundne dimerer i kultur eller in vivo, (3) én eller flere peptidylbindinger er erstattet med en ikkepeptidylbinding, (4) N-terminalen er erstattet med NRR 1, NRC(O)R 1, - NRC(O)OR 1, -NRS(O) 2 R 1, -NHC(O)NHR, en suksinimidgruppe, eller substituert eller ikke-substituert benzyloksykarbonyl-nh-, der R og R 1 og ringsubstituentene er som definert heretter, () C-terminalen er erstattet med C(O)R 2 eller NR 3 R 4 der R 2, R 3 og R 4 er som definert heretter, og (6) forbindelser der hver individuelle aminosyre-enheter er modifiserte ved behandling med midler som er i stand til å reagere med valgte sidekjeder eller terminale rester. Derivatisering av et modifisert LCAT-protein endrer ikke ytterligere den modifiserte LCATproteinaminosyresekvensen, bortsett fra i det omfanget at derivatisering inkluderer addisjon av én eller flere aminosyrerester på karboksyterminalen på den modifiserte LCAT-proteinaminosyresekvensen, aminoterminalen på den modifiserte LCATproteinaminosyresekvensen, eller både karboksyterminalen og aminoterminalen på den modifiserte LCAT-proteinaminosyresekvensen. I tillegg kan et modifisert LCAT-protein bli derivatisert med en sidekjedemodifisering på en aminosyrerest, med det forbehold at sidekjedemodifiseringen på cystein på posisjon 31 i den humane villtype-lcat-sekvensen, og tilsvarende cysteinrester i humane homologe og ortologe proteiner som identifisert ved aminosyresekvenssammenstilling, inkludert nødvendige åpninger, er ekskludert fra omfanget av oppfinnelsen. Videre er det på det rene at når «modifisert LCAT-protein» nevnes her, så er også et modifisert LCAT-proteinderivat også kontemplert for dette aspektet av oppfinnelsen som er beskrevet. Uttrykket «farmakologisk aktiv» betyr at et stoff som er beskrevet slik er bestemt å ha aktivitet som påvirker en medisinsk parameter (for eksempel blodtrykk, blodcelleantall, kolesterolnivå) eller sykdomstilstand (for eksempel aterosklerose, inflammatoriske forstyrrelser og tromboseforstyrrelser). Uttrykket «fysiologisk akseptable salter» omfatter ethvert salt som er kjent eller som senere oppdages å være farmasøytisk akseptabelt. Noen spesifikke eksempler er: acetat, trifluoracetat, hydrohalider, slik som hydroklorid og hydrobromid, sulfat, citrat, tartrat, glykolat og oksalat. «Vesentlig homogen», slik det benyttes her med referanse til et preparat ifølge oppfinnelsen, betyr at preparatet inkluderer en enkelt enhet av en terapeutisk forbindelse som er påvisbar i preparatet av totale terapeutiske molekyler i preparatet, dersom ikke annet er gitt i en spesifikk prosentandel av totale terapeutiske molekyler. Generelt er et vesentlig rent preparat homogent nok til å oppvise fortrinnene for et homogent preparat, for eksempel problemfri ved klinisk applikasjon når det gjelder forutsigbarhet i farmakokinetikk fra lot til lot.

10 9 «Biologisk virkeevne» refererer til kapasiteten til å gi en ønsket biologisk effekt. Biologisk virkeevne for ulike forbindelser, eller ulike doseringer av den samme forbindelsen, eller ulike administreringer av den samme forbindelsen er generelt normalisert til mengden av forbindelse(r) for å muliggjøre passende sammenligning «Aterosklerose» refererer til en tilstand som er kjennetegnet ved herdingen og/eller innsnevringen av arterier som er forårsaket av oppbygningen av ateromatøst plakk på innsiden av arterievegger. Det ateromatøse plakket deles i tre komponenter, (1) ateroma, en nodulær akkumulering av et mykt flakete materiale i sentrum av store plakk, sammensatt av makrofager nærmest lumen av arterien, (2) underliggende områder med kolesterolkrystaller, (3) forkalkning på den ytre basen av mer fremskredne lesjoner. Indikatorer på aterosklerose inkluderer for eksempel utviklingen av plakk i arteriene, deres forkalkning, der omfanget av dette kan bli bestemt ved Sudan-IV-farging, eller utviklingen av skumceller i arterier. Innsnevringen av arteriene kan bli bestemt ved hjelp av koronar angioplastikk, ultra-rask CT eller ultralyd. «Inflammasjon» eller «inflammatorisk forstyrrelse» referer til en lokalisert, beskyttende respons utløst ved skade eller ødeleggelse av vev, som virker for å ødelegge, fortynne eller bekjempe både det skadende middelet og det skadde vevet. Uttrykket «inflammatorisk sykdom» eller «inflammatorisk tilstand» betyr slik de benyttes her enhver sykdom der en overdreven eller uregulert, inflammatorisk respons fører til overdrevne, inflammatoriske symptomer, vertsvevskade eller tap av vevsfunksjon. I tillegg betyr uttrykket «autoimmunsykdom» slik det benyttes her enhver gruppe forstyrrelser der vevsskade er assosiert med humorale eller cellemedierte responser på kroppens egne bestanddeler. Uttrykket «allergisk sykdom» betyr slik det benyttes her ethvert symptom, vevsskade eller tap av vevsfunksjon som skyldes allergi. Uttrykket «arterittsykdom» betyr slik det benyttes her en stor familie sykdommer som er kjennetegnet ved inflammatoriske lesjoner i leddene som kan tilskrives en mengde etiologier. Uttrykket «dermatitt» betyr slik det benyttes her enhver av en stor familie med sykdommer i huden som er kjennetegnet ved inflammasjon i huden som kan skyldes en mengde etiologier. Uttrykket «transplantatfrastøting» betyr slik det benyttes her enhver immunreaksjon som er rettet mot transplantert vev (inkludert organ og celle (for eksempel benmarg) som er kjennetegnet ved et tap av funksjon i det transplanterte og omkringliggende vev, smerte, svelling, leukocytose og trombocytopeni. «Trombose» og «tromboserelatert forstyrrelse» refererer til unormal trombedannelse som forårsaker obstruksjon av blodkar og tilstander som er assosierte med slik obstruksjon. Blodkar opererer under vesentlige forskyvningsbelastninger som er en funksjon av blodstrømningsforskyvningsrate. Ofte forekommer det skade på små blodkar og kapillærer. Når disse karene skades blir hemostase utløst for å stoppe blødningen. Ved typiske omstendigheter blir en slik skade håndtert gjennom en sekvens av hendelser som ofte refereres til som «trombedannelsen».

11 Trombedannelse er avhengig av plateadhesjon, -aktivering og -aggregering og koaguleringskaskaden som kulminerer i konverteringen av løselig fibrinogen til uløselig fibrinpropp. Trombedannelse på et sårsted forhindrer at blodkomponenter forlater blodkarene. Deretter foregår sårheling og oppløsning av proppen og blodkarintegritet og strømning er gjenopprettet. Uttrykket «HDL» refererer til høytetthets-lipoproteinene. Uttrykket «LDL» refererer slik det benyttes her til lavtetthets-lipoproteinene. Uttrykket «VLDL» refererer til svært lavtetthets-lipoproteinene. Uttrykket «behandling» eller «behandle» inkluderer administreringen til et individ med behov for en farmakologisk aktiv mengde av et modifisert LCAT-protein ifølge oppfinnelsen som vil inhibere, minske eller reversere utviklingen av for eksempel en patologisk aterosklerose, inflammatorisk forstyrrelse eller tromboserelatert forstyrrelse. I et annet aspekt betyr behandling slik det benyttes her administreringen, til et individ med behov, av en mengde av en forbindelse ifølge oppfinnelsen, som med hensyn på aterosklerose vil øke HDL-kolesterolnivåer. «Inhibering» i sammenheng med inhibering av aterosklerose er ment å skulle bety forebygging, oppbremsing, stabilisering eller reversering av dannelse eller vekst av ateromatøse plakk, inflammatorisk forstyrelse eller tromboserelatert forstyrrelse. Behandling av sykdommer og forstyrrelser her er ment også å inkludere terapeutisk administrering av et modifisert LCAT-protein ifølge oppfinnelsen (eller et farmasøytisk salt, derivat eller prolegemiddel derav) eller en farmasøytisk sammensetning inneholdende det modifiserte LCAT-proteinet til et individ som er antatt å ha behov for behandling av sykdommer og forstyrrelser, slik som for eksempel inflammatoriske forstyrrelser, tromboseforstyrrelser, koronar hjertesykdom, høyt blodtrykk, LCAT-mangelsyndrom, Alzheimers sykdom, hornhinneopasitet, metabolsk syndrom, dyslipidemi, hjerteinfarkt, slag, kritisk lemiskemi, angina og liknende. Behandling omfatter også administrering av det modifiserte LCAT-proteinet eller farmasøytisk sammensetning til individer som ikke har blitt diagnostisert til å ha behov for dette, dvs., profylaktisk administrering til individet til forebygging av en tilstand eller forstyrrelse. Generelt blir individet i utgangspunktet diagnostisert av en lege og/eller autorisert medisinsk personell, og et regime for profylaktisk og/eller terapeutisk (akutt eller kronisk) behandling via administrering av det/de modifiserte LCAT-proteinet/-proteinene eller sammensetningene ifølge oppfinnelsen blir foreslått, anbefalt eller foreskrevet. Uttrykket «terapeutisk effektiv mengde» er mengden av forbindelsen ifølge oppfinnelsen som vil oppnå målet med forbedring i forstyrrelsesalvorlighet og forekomsthyppighet. Forbedringen i forstyrrelsesalvorlighet inkluderer for eksempel med hensyn til aterosklerose, forebygging av akkumulering av kolesterol i blodkarvegger, økning av blodnivåer av HDL-kolesterol, reverseringen av aterosklerose, i tillegg til oppbremsing av progresjonen av aterosklerose,

12 11 forebygging eller behandling av inflammatoriske forstyrrelser og forebygging eller behandling av tromboserelaterte tilstander. Som benyttet her er uttrykket «individ» ment å skulle bety et menneske eller annet pattedyr, som oppviser, eller som har risiko for å utvikle, aterosklerose, en inflammatorisk forstyrrelse eller en tromboserelatert forstyrrelse. Et slikt individ kan ha, eller ha en risiko for å utvikle, for eksempel tilstander slik som inflammasjon, trombose, koronar hjertesykdom, høyt blodtrykk, LCATmangelsyndrom, Alzheimers sykdom, hornhinneopasitet, metabolsk syndrom, dyslipidemi, hjerteinfarkt, slag, kritisk lemiskemi, angina og liknende. Prognostiske og kliniske indikasjoner på disse tilstandene er kjent på fagområdet II. Modifiserte LCAT-proteiner A. Analyser Analyser for bestemmelse av LCAT-enzymaktivitet, plasmastabilitet (enzymhalveringstid i plasma) eller LCAT-proteinnivåene i plasma er kjent på fagområdet. Absolutt LCAT-aktivitet i serum og endogen forestringsrate av kolesterol kan bli bestemt som for eksempel beskrevet i Albers J. et al. (1986) Methods in Enzymol. 129: , Dobiasova M. et al. (1983) Adv. Lipid Res. : I ett aspekt kan LCAT-aktivitet bli bestemt ved å måle konverteringen av radiomerket kolesterol til kolesterolester etter inkubering av LCAT og radiomerkede LCAT-substrater inneholdende ApoA-I. Forestringsrate av kolesterol (CER, nmol CE/ml per time) kan bli målt ved å bestemme konverteringsraten av merket kolesterol til kolesterylester etter inkubering av plasma som er radiomerket med en spormengde av radioaktivt kolesterol ved likevekt med en [ 14 C]-kolesterolalbumin-blanding ved 4 ºC. Den endogene kolesterolforestringsraten (som bestemt ved plasma-lcat-aktivitetsanalyse) gjenspeiler ikke bare massen til LCAT men også karakteren og mengden av LCAT-substrat og kofaktor som er til stede i serumet, og tilveiebringer derfor et bedre mål på den terapeutiske LCATaktiviteten. Analyser for måling av LCAT-stabilitet (halveringstid) i blod- og plasma-lcatproteinkonsentrasjonen er også kjent på fagområdet. Etter administrering kan nivåer av rekombinant LCAT-protein i plasma bli bestemt ved å benytte ELISA beskrevet av JR Crowther: ELISA theory and practice, methods in molecular Biology Volume 42. Reagenser for måling av LCAT-stabilitet og proteinkonsentrasjon inkluderer anti-lcat-antistoffer som er kommersielt tilgjengelige fra flere forhandlere. Eksempler på anvendelse av denne analysen for å bestemme aktivitet og/eller stabilitet for det modifiserte LCAT er gitt nedenfor.

13 12 B. Aminosyremodifiseringer 1 Modifiserte LCAT-proteiner er tilveiebrakt som omfatter en aminosyresubstitusjon i en villtype-lcat-proteinaminosyresekvens. Fordi aminosyresekvensen til et villtype-lcat-protein er modifisert gjennom substitusjon av én eller flere aminosyrer så er det modifiserte LCAT-proteinet i ett aspekt et ikke-naturlig forekommende protein. Modifiserte LCAT-proteiner er avledet fra ethvert villtype- LCAT-protein, der eksempelmessige villtype-lcat-proteiner er vist på figur 1. For aspekter av oppfinnelsen som inkluderer modifiserte LCAT-proteiner der et humant LCAT-protein er modifisert for å inkludere én eller flere aminosyresubstitusjoner, eller én eller flere aminosyreaddisjoner, og i ett aspekt er den humane villtype-lcat-aminosyresekvensen vist ifølge SEKV ID nr. 1. I diskusjon av spesifikke aminosyrer i den humane LCAT-proteinsekvensen ifølge SEKV ID nr. 1 vil fagfolk på området forstå at den samme eller tilsvarende modifikasjonen på den samme eller tilsvarende aminosyrerest i andre humane LCAT-aminosyresekvenser (dvs. allelvarianter eller andre naturlig forekommende LCAT-sekvenser) eller i ortologe LCAT-aminosyresekvenser er kontemplert og omfattet. Med hensyn på SEKV ID nr. 1 er aminosyresubstitusjoner kontemplert på (ved å benytte enkeltbokstav-aminosyrebetegnelser etterfulgt av posisjon i proteinsekvensen, dvs. at «F1» indikerer fenylalanin på posisjon 1 i SEKV ID nr. 1): F1, W2, L3, L4, N, V6, L7, F8, P9, P, H11, T12, T13, P14, K1, A16, E17, L18, S19, N, H21, T22, R23, P24, V2, I26, L27, V28, P29, G, C31, L32, G33, N34, Q3, L36, E37, A38, K39, L40, D41, K42, P43, D44, V4, V46, N47, W48, M49, C0, Y1, R2, K3, T4, E, D6, F7, F8, T9, I60, W61, L62, D63, L64, N6, M66, F67, L68, C69, L70, G71, V72, D73, C74, W7, I76, D77, N78, 2

14 13 1 S40, P406, T407, A408, S409, P4, E411, P412, P413, P414, P41 og/eller E416. Aminosyrer på én eller flere av disse posisjonene blir substituert med enhver naturlig forekommende eller ikke-naturlig forekommende aminosyre. For eksempel og uten begrensning så omfatter det modifiserte LCAT en C31Y-substitusjon og en substitusjon på én eller flere av aminosyrerester F1, L4, L32 og N34. I ett aspekt er denne andre substitusjonen F1S, F1W, L4M, L4K, N34S, L32F og/eller L32H. I ulike aspekter blir spesifikke substitusjoner tilveiebrakt. For eksempel og uten begrensning, så blir en alifatisk aminosyrerest (G, A, V, L eller I) substituert med en annen alifatisk rest, en aromatisk aminosyrerest (F, Y eller W) blir substituert med en annen aromatisk rest, en alifatisk hydroksylsidekjede (S eller T) blir erstattet med en annen alifatisk hydroksylsidekjederest, en basisk rest (K, R eller H) blir erstattet med en annen basisk aminosyrerest, en sur rest (D eller E) blir erstattet med en annen sur aminosyrerest, en amidsidekjederest (N eller O) blir erstattet med en annen amidsidekjederest, en hydrofob rest (norleucin, M, A, V, L eller I) blir erstattet med en annen hydrofob rest, en nøytral aminosyrerest (C, S, T, N eller O) blir erstattet med en annen nøytral rest, en rest som påvirker kjedeorientering (G eller P) blir erstattet med en annen rest som påvirker kjedeorientering, og/eller en svovelinneholdende sidekjederest (C eller M) blir erstattet med en annen svovelinneholdende sidekjederest. I andre beskrivelser blir konservative substitusjoner introdusert i en villtype-lcataminosyresekvens. 2

15 14 Opprinnelig rest Tabell 1 Eksempel på konservative substitusjoner Enda andre substitusjoner som er kontemplert inkluderer, også uten begrensning, de som er vist i tabell 2 nedenfor. Tabell 2 Opprinnelig rest A R N D C Q E G H I L K M F Opprinnelig rest Eksempelmessig substitusjon V, L, I K, Q, N Q E S, A N D P, A N, Q, K, R L, V, M, A, F, Norleucin Norleucin, I, V, M, A, F R, 1,4-diaminosmørsyre, Q, N L, F, I L, V, I, A, Y Eksempelmessig substitusjon

16 1 P S T W Y V A T, A, C S Y, F W, F, T, S I, M, L, F, A, Norleucin C. Derivater 1 2 I tillegg til modifiserte LCAT-proteiner beskrevet ovenfor er det kontemplert at andre «derivater» av modifiserte LCAT-proteiner kan bli substituert for et modifisert LCAT-protein beskrevet ovenfor. Slike derivater kan forbedre løseligheten, absorpsjonen, biologisk halveringstid og liknende for forbindelsene. Enhetene kan alternativt eliminere eller stoppe en hvilken som helst uønsket bivirkning av forbindelsene og liknende. Slike derivater av modifiserte LCAT-proteiner inkluderer de der det er slik at: 1. De modifiserte LCAT-proteinene eller en del derav er sykliske. For eksempel kan peptiddelen bli modifisert for å inneholde to eller flere cysteinrester (for eksempel i linkeren) som kan sykliseres ved disulfidbindingsdannelse. 2. Det modifiserte LCAT-proteinet er kryssbundet eller er gjort i stand til å kryssbinde mellom molekyler. For eksempel kan peptiddelen bli modifisert for å inneholde én cysteinrest og derved være i stand til å danne en intermolekylær disulfidbinding med et likt molekyl. Proteinet kan også være kryssbundet gjennom sin C-terminal. 3. En eller flere peptidylbindinger [-C(O)NR-] blir erstattet med en ikkepeptidylbinding. Eksempelmessige ikke-peptidylbindinger er CH 2 -karbamat [- CH 2 -OC(O)NR-], fosfonat, -CH 2 -sulfonamid [-CH 2 -S(O) 2 NR-], urea [-NHC(O)NH- ], -CH 2 -sekundært amin og alkylert peptid [-C(O)NR 6 - der R 6 er lavere alkyl]. 4. N-terminalen er derivatisert. Typisk kan N-terminalen være acylert eller modifisert til et substituert amin. Eksempler på N-terminale derivatgrupper inkluderer NRR 1 (forskjellig fra NH 2 ), -NRC(O)R 1, -NRC(O)OR 1, -NRS(O) 2 R 1, - NHC(O)NHR 1, suksinimid eller benzyloksykarbonyl NH-(CBZ-NH-), der R og R 1 hver uavhengig er hydrogen eller lavere alkyl med det forbeholdet at R og R 1 ikke begge er hydrogen og der fenylringen kan være substituert med 1 til 3 substituenter valgt fra gruppen bestående av C 1 -C 4 -alkyl, C 1 -C 4 -alkoksy, klor og brom, til en suksinimidgruppe, til en benzyloksykarbonyl-nh-(cbz-nh-)-gruppe, og peptider der den frie C-terminalen er derivatisert til C(O)R 2 der R 2 er valgt fra gruppen som består av lavere alkoksy og NR 3 R 4 der R 3 og R 4 uavhengig er valgt fra gruppen

17 16 bestående av hydrogen og lavere alkyl. Med «lavere» er det ment en gruppe som har fra 1 til 6 karbonatomer C-terminalen er derivatisert. Typisk er C-terminalen forestret eller amidert. Man kan for eksempel benytte fremgangsmåter som er beskrevet på fagområdet for å addere (NH-CH 2 -CH 2 -NH 2 ) 2 til forbindelser ifølge denne oppfinnelsen på C- terminalen. Likeledes kan man benytte fremgangsmåter beskrevet på fagområdet for å addere NH 2 til forbindelsene ifølge denne oppfinnelsen på C-terminalen. Eksempelmessige C-terminale derivatgrupper inkluderer for eksempel C(O)R 2 der R 2 er lavere alkoksy eller NR 3 R 4 der R 3 og R 4 uavhengig er hydrogen eller C 1 -C 8 - alkyl (eller C 1 -C 4 -alkyl). 6. En disulfidbinding blir erstattet med en annen, for eksempel mer stabil kryssbindingsenhet (for eksempel alkylen). Se for eksempel Bhatnagar et al. (1996), J. Med. Chem. 39: , Alberts et al. (1993) Thirteenth Am. Pep. Symp., En eller flere individuelle aminosyrerester er modifisert. Ulike derivatiserende midler er kjent å reagere spesifikt med valgte sidekjeder eller terminale rester, som beskrevet i detalj nedenfor. I tillegg kan modifiseringer av individuelle aminosyrer bli introdusert i den modifiserte LCAT-aminosyresekvensen ved å reagere spesifikke aminosyrerester for proteinet med et organisk, derivatiserende middel som er i stand til å reagere med valgte sidekjeder eller terminale rester. Det følgende er eksempelmessig. Lysinyl- og aminoterminale rester kan bli reagert med ravsyreanhydrid eller andre karboksylsyreanhydrider. Derivatisering med disse midlene har effekten av å reversere ladningen på lysinylrester. Andre passende reagenser for derivatisering av alfa-aminoinneholdende rester inkluderer imidoestere slik som metyl-picolinimidat, pyridoksalfosfat, pyridoksal, klorborhydrid, trinitrobenzensulfonsyre, O- metylisourea, 2,4-pentandion og transaminase-katalysert reaksjon med glyoksylat. Arginylrester kan bli modifisert ved reaksjon med ett eller flere konvensjonelle reagenser, blant dem fenylglyoksal, 2,3-butandion, 1,2-sykloheksandion og ninhydrin. Derivatisering av argininrester krever at reaksjonen blir utført ved alkaliske betingelser på grunn av den høye pka for den funksjonelle guanidingruppen. Videre kan disse reagensene reagere med gruppene på lysin i tillegg til arginin-guanidinogruppen. Den spesifikke modifiseringen av tyrosylrester per se har blitt studert grundig, med spesifikk interesse mot å introdusere spketralmerker inn i tyrosylrester ved reaksjon med aromatiske diazoniumforbindelser eller tetranitrometan. Mest vanlig kan N- acetylimidizol og tetranitrometan bli benyttet for å danne henholdsvis O-acetyltyrosyl-enheter og 3-nitroderivater. Karboksylsidegrupper (aspartyl eller glutamyl) kan selektivt bli modifisert ved reaksjon med karbodiimider (R -N=C=N-R ) slik som 1-sykloheksyl-3-(2-

18 17 morfolinyl-(4-etyl)-karbodiimid eller 1-etyl-3-(4-azonia-4,4-dimetylfenyl)- karbodiimid. Videre kan aspartyl- og glutamylrester bli konvertert til asparaginylog glutaminylrester ved reaksjon med ammoniumioner Glutaminyl- og asparaginylrester blir ofte deamidert til de tilsvarende glutamyl- og aspartylrestene. Alternativt kan disse restene bli deamidert under mildt sure betingelser. Enhver form av disse restene faller innenfor omfanget av denne oppfinnelsen. Cysteinylrester på en posisjon forskjellig fra rest 31 kan bli erstattet med aminosyrerester eller andre enheter enten for å eliminere disulfidbinding, eller motsatt, for å stabilisere kryssbinding. Se for eksempel Bhatnagar et al. (1996), J. Med. Chem. 39: Derivatisering med bifunksjonelle midler er nyttig for å kryssbinde peptidene eller deres funksjonelle derivater til en vannuløselig bærematriks eller til andre makromolekylære bærere. Vanlig benyttede kryssbindingsmidler inkluderer for eksempel 1,1-bis(diazoacetyl)-2-fenyletan, glutaraldehyd, N- hydroksysuksinimidestere, for eksempel estere med 4-azidosalisylsyre, homobifunksjonelle imidoestere, inkludert disuksinimidylestere slik som 3,3 - ditiobis(suksinimidylpropionat) og bifunksjonelle maleimider slik som bis-nmaleimido-1,8-oktan. Derivatiserende midler slik som metyl-3-[(pazidofenyl)ditio]-propioimidat gir fotoaktiverbare intermediater som er i stand til å danne kryssbindinger i nærværet av lys. Alternativt kan reaktive vannuoppløselige matriser slik som cyanogenbromidaktiverte karbohydrater og de reaktive substratene beskrevet i US patent nr. 3,969,287, 3,691,016, 4,19,128, 4,247,642, 4,229,37 og 4,3,440 bli benyttet til proteinimmobilisering. Andre mulige modifiseringer inkluderer hydroksylering av prolin og lysin, fosforylering av hydroksylgrupper av på seryl- og treonylrester, oksidering av svovelatomet i cystein, metylering av alfa-aminogruppene på lysin-, arginin- og histidinsidekjeder (Creighton, T.E., Proteins: Structure and Molecular Properties, W.H. Freeman & Co., San Francisco, s (1983)), acetylering av det N- terminale aminet, og, i noen tilfeller, amidering av de C-terminale karboksylgruppene. Slike derivatiserte enheter forbedrer fortrinnsvis ett eller flere karakteristika inkludert enzymatisk aktivitet, løselighet, absorpsjon, biologisk halveringstid og liknende for de oppfinneriske forbindelsene. Alternativt fører derivatiserte enheter til forbindelser som har de samme eller så å si de samme karakteristika og/eller egenskapene som forbindelsen som ikke er derivatisert. Enhetene kan alternativt eliminere eller stoppe eventuelle uønskede bivirkninger av forbindelsene og liknende.

19 Karbohydrat(oligosakkarid)-grupper kan hensiktsmessig bli festet på seter som er kjente for å være glykosyleringsseter i proteiner. Generelt er O-koblede oligosakkarider koblet til serin (Ser)- eller treonin (Thr)-rester mens N-koblede oligosakkarider er koblet til asparagin (Asn)-rester når de er en del av sekvensen Asn-X-Ser/Thr, der X kan være enhver aminosyre bortsett fra prolin. X er fortrinnsvis én av de 19 naturlig forekommende aminosyrene bortsett fra prolin. Strukturene til N-koblede og O-koblede oligosakkarider og sukkerrester funnet i hver type er forskjellige. Én type sukker som ofte forekommer på begge er N- acetylneuraminsyre (referert til som sialinsyre). Sialinsyre er vanligvis den terminale resten på både N-koblede og O-koblede oligosakkarider og kan i kraft av sin negative ladning overføre sure egenskaper til den glykosylerte forbindelsen. Slike seter kan bli inkorporert i linkeren på forbindelsene ifølge denne oppfinnelsen og er fortrinnsvis glykosylert av en celle under rekombinant produksjon av polypeptidforbindelsen (for eksempel i pattedyrceller slik som CHO, BHK, COS). Slike seter kan likevel videre bli glykosylert med syntetiske eller halvsyntetiske prosedyrer som er kjent på fagområdet. Modifiserte LCAT-proteiner ifølge foreliggende oppfinnelse kan bli endret på DNA-nivå i tillegg. DNA-sekvensen til enhver del av forbindelsen kan bli endret til kodon som er mer kompatible med den valgte vertscellen. For E. coli, som er vertscellen i ett aspekt, så er optimaliserte kodon kjent på fagområdet. Kodon kan bli substituert for å eliminere restriksjonsseter eller for å inkludere sovende restriksjonsseter, noe som kan hjelpe til i prosesseringen av DNA i den valgte vertscellen. Vehikkelen, linkeren og peptid-dna-sekvensene kan bli modifisert for å inkludere enhver av de foregående sekvensendringene. Et annet sett med nyttige derivater er de ovenfor beskrevne molekylene konjugert til toksiner, sporingsmidler eller radioisotoper. Slik konjugering er spesielt nyttig for molekyler som omfatter peptidsekvenser som binder til tumorceller eller patogener. Slike molekyler kan bli benyttet som terapeutiske midler eller som hjelp ved kirurgi (for eksempel radioimmunstyrt kirurgi eller RIGS) eller som diagnostiske midler (for eksempel radioimmundiagnostiske midler eller RID). Som terapeutiske midler innehar disse konjugerte derivatene et antall fortrinn. De fremmer anvendelse av toksiner og radioisotoper som ville vært toksiske dersom de ble administrert uten den spesifikke bindingen som er tilveiebrakt ved peptidsekvensen. De kan også redusere bivirkningene som følger anvendelsen av strålings- og kjemoterapi ved å fremme lavere, effektive doser av konjugeringspartneren. Nyttige konjugeringspartnere inkluderer: - Radioisotoper slik som 90 Yttrium, 131 Jod, 22 Actium og 213 Vismut,

20 19 - Ricin-A-toksin, mikrobielt avledede toksiner slik som Psudomonasendotoksin (for eksempel PE38, PE40) og liknende, - Partnermolekyler i innfangingssystemer (se nedenfor), Biotin, streptavidin (nyttig som enten partnermolekyler i innfangingssystemer eller som sporingsmidler, spesielt i diagnostisk anvendelse), og - Cytotoksiske midler (for eksempel doxorubicin). Én nyttig tilpasning av disse konjugerte derivatene er anvendelse i et innfangingssystem. I et slikt system vil molekylene ifølge foreliggende oppfinnelse omfatte et ufarlig innfangingsmolekyl. Dette innfangingsmolekylet vil være i stand til å binde spesifikt til et separat effektormolekyl omfattende for eksempel et toksin eller radioisotop. Både det vehikkel-konjugerte molekylet og effektormolekylet vil bli administrert til pasienten. I et slikt system vil effektormolekylet ha en kort halveringstid bortsett fra når det er bundet til det vehikkel-konjugerte innfangingsmolekylet, for slik å minimere alle toksiske effekter. Det vehikkelkonjugerte molekylet vil ha en relativt lang halveringstid men vil være ufarlig og ikke-toksisk. De spesifikke bindingsdelene av begge molekyler kan være del av et kjent bindingspar (for eksempel biotin, streptavidin) eller kan være et resultat av peptidgenereringsfremgangsmåter slik som de som er beskrevet her. Slike konjugerte derivater kan bli fremstilt med fremgangsmåter som er kjent på fagområdet. I tilfellet med protein-effektormolekyler (for eksempel Psudomonasendotoksin) kan slike molekyler bli uttrykt som fusjonsproteiner fra korrelative DNA-konstruksjoner. Radioisotop-konjugerte derivater kan for eksempel bli fremstilt som beskrevet for BEXA-antistoffet (Coulter). Derivater som omfatter cytotoksiske midler eller mikrobetoksiner kan for eksempel bli fremstilt som beskrevet for BR96-antistoffet (Bristol-Myers Squibb). Molekyler benyttet i innfangingssystemer kan for eksempel bli fremstilt som beskrevet i patentene, patentsøknadene og publikasjonene fra NeoRx. Molekyler benyttet til RIGS og RID kan for eksempel bli fremstilt som i patentene, patentsøknadene og publikasjonene fra NeoProbe. C. Vehikkel-/bærerenheter 3 Forbindelsene ifølge oppfinnelsen kan også være kovalent eller ikke-kovalent assosiert med et bærermolekyl, slik som en lineær polymer (for eksempel polyetylenglykol, polylysin, dekstran, osv.), en forgrenet polymer (se for eksempel US patent nr. 4,289,872,,229,490, WO 93/2129), et lipid, en kolesterolgruppe (slik som et steroid) eller et karbohydrat eller oligosakkarid. Andre mulige bærere inkluderer antistoffenheter, og spesielt konstantregioner som er avledet fra et

21 1 2 3 antistoff. Enda andre mulige bærere inkluderer én eller flere vannløselige polymertilkoblinger slik som polyoksyetylenglykol, eller polypropylenglykol som beskrevet i US patent nr. 4,640,83 4,496,689, 4,1,144, 4,670,417, 4,791,192 og 4,179,337. Enda andre nyttige polymerer som er kjent på fagområdet inkluderer monometoksy-polyetylenglykol, dekstran, cellulose eller andre karbohydratbaserte polymerer, poly-(n-vinyl-pyrrolidon)-polyetylenglykol, propylenglykolhomopolymerer, en polypropylenoksid-/etylenoksid-kopolymer, polyoksyetylerte polyoler (for eksempel glyserol) og polivinylalkohol, i tillegg til blandinger av disse polymerene. 1. Immunoglobulin-konstantregion-vehikler/-bærere I én utførelsesform inkluderer et modifisert LCAT-protein ifølge oppfinnelsen minst én vehikkel festet til proteinet via N-terminalen, C-terminalen eller en sidekjede på én av aminosyrerestene. I én utførelsesform er et Fc-domene en vehikkel. Slik kan et Fc-domene bli fusjonert til N- eller C-terminalen på peptider eller på både N- og C-terminalen. Flere vehikler, som eksemplifisert her, kan også benyttes, for eksempel en Fc på hver terminal eller en Fc på en terminal og en PEG-gruppe på den andre terminalen eller på en sidekjede. I ulike utførelsesformer er Fc-komponenten enten en nativ Fc eller en Fc-variant. For eksemplets del og uten begrensning er Fc-komponenten en Fc-region fra den humane immunoglobulin-igg1-tungkjeden eller et biologisk aktivt fragment, derivat eller dimer derav, se Ellison, J. W., Nucleic Acids Res. : (1982). Det er likevel på det rene at en Fc-region for anvendelse i oppfinnelsen kan være avledet fra en IgG, IgA, IgM, IgE eller IgD fa enhver art. Native Fc-domener er satt sammen av monomere polypeptider som kan være bundet til dimere eller multimere former ved kovalent (dvs. disulfidbindinger) og/eller ikke-kovalent assosiering. Antallet intermolekylære disulfidbindinger mellom monomere subenheter i native Fc-molekyler er fra 1 til 4 avhengig av klasse (for eksempel IgG, IgA, IgE) eller underklasse (for eksempel IgG1, IgG2, IgG3, IgA1, IgA2). Ett eksempel på en nativ Fc er en disulfidbundet dimer som er resultatet av papain-fordøying av en IgG (se Ellison et al., (1982), Nucleic Acids Res. :4071-9). I ulike utførelsesformer inkluderer Fc-sekvenser som er kontemplert de som er kjent på fagområdet, slik som for eksempel Fc-IgG1 (GenBank-aksesjonsnummer P0187), Fc-IgG2 (GenBank-aksesjonsnummer P0189), Fc-IgG3 (GenBankaksesjonsnummer P01860), Fc_IgG4 (GenBank-aksesjonsnummer P01861), Fc- IgA1 (GenBank-aksesjonsnummer P01876), Fc-IgA2 (GenBank-aksesjonsnummer P01877), Fc-IgD (GenBank-aksesjonsnummer P01880), Fc-IgM (GenBankaksesjonsnummer P01871), og Fc-IgE (GenBank-aksesjonsnummer P0184).