FISKEHELSE - 8. årgang nr. 1, 2006 FISKEHELSE

Transkript

1 FISKEHELSE 1

2 Annonsering i tidsskriftet Fiskehelse Fiskehelse utgis av Fiskehelseforeningen, en faglig gruppe i Tekna. Målgruppen til tidsskriftet er fiskehelsebiologer, veterinærer, konsulenter, forskere, forvaltning, oppdrettere og andre interesserte i fagfeltet. Bladet finansieres av annonser og abonnementer. Fiskehelseforeningen har ikke kommersielle interesser i tidsskriftet. Pris på annonser er: Ett innrykk Fargetrykk (4 farger) Sort/hvitt Halvside Kr 2000 Kr 1000 Helside Kr 3000 Kr 1500 Fire påfølgende innrykk (15% rabatt) Halvside Kr 6800 Kr 3400 Helside Kr Kr 5100 Alle priser er eks. moms Fiskehelse inneholder faglige artikler der forskere og andre fagfolk skriver om aktuelle problemstillinger innenfor fiskehelse og akvakultur. I tillegg er det presentasjoner av mastergrader i fiskehelse og informasjon fra Fiskehelseforeningen. Henvendelser angående annonser i tidsskriftet Fiskehelse sendes til: Kari Spinnangr kari.spinnangr@tekna.no Abonnering på tidsskriftet Fiskehelse Ved å være abonnent på tidsskriftet Fiskehelse får du aktuell informasjon om hva som foregår innenfor fagfeltet akvakultur og fiskehelse. Bladet blir gitt ut to ganger i året og abonnementet koster 150 kr pr. år. Abonnementet opprettholdes inntil eventuell oppsigelse. Henvendelser angående abonnering på tidsskriftet Fiskehelse sendes til: Kari Spinnangr kari.spinnangr@tekna.no Artikler i tidsskriftet Fiskehelse 2 Er du interessert i å skrive en artikkel i tidsskiftet Fiskehelse kan du ta kontakt med redaktør. Mal for skriving i finnes på

3 Fagtidsskriftet Fiskehelse Utgiver: Tekna Fiskehelseforeningen (FHF) Faglig gruppe i Tekna Adresse: Fiskehelseforeningen Tekna Postboks 2312 Solli 0212 Oslo Innhold Side Leder av Fiskehelseforeningen 4 Medfødt forsvar mot virus hos fisk - Børre Robertsen 5 Hurtigtest for IPN - Atle Lillehaug og Turunn Taksdal 11 Nodavirus en overdreven fare eller en reell trussel? - Kjetil Korsnes, Egil Karlsbakk, Øivind Bergh, Sonal Patel, Trond E. Isaksen, Audun H. Nerland og Are Nylund 13 Redaksjonen: Redaktør: Kjetil Korsnes kjetil.korsnes@hibo.no Teknisk redaktør: Rolf Hetlelid Olsen rolf.hetlelid.olsen@imr.no Redaksjonsmedlemmer: Vidar Aspehaug vidar.aspehaug@patogen.no Ragnhild Hanche-Olsen ragnhild_ho@yahoo.no Eirik Frøiland eirik.froiland@nfh.uit.no Nye isolater av Vibrio anguillarum isolert fra Atlantisk torsk (Gadus morhua L.); Karakterisering og effekt av vaksinering - Lene-Catrin Martinsen 19 Spironucleus oppsummering etter 17 år og to doktorgrader - Erik Sterud, Anders Jørgensen, Trygve Poppe og Tor Atle Mo 27 DNA-vaksinering av fisk en oppsummering av forskningen så langt - Aase B. Mikalsen 34 Smittehygienisk organisering av oppdrettsnæringen etter utbrudd av furunkulose i Anne Stene og Knut Sjåstad 39 Langtidsstudium av hjerte- og skjelettmuskelbetennelse (HSMB) - Ruth Torill Kongtorp, Marianne Halse, Torunn Taksdal og Knut Falk 44 Forsidebilde: Spironucleus salmonis trio fra regnbueørret tarm. Foto: Sterud et al. ISBN ISSN

4 Leder av Tekna Fiskehelseforeningen Kjære fiskehelseinteresserte Utgaven du nå leser har tatt tid å lage. Fiskehelse har slitt med å få en redaktør og redaksjonskomité på plass, og for denne utgaven er det undertegnede som fungerer som ansvarlig redaktør. Det er flere som må takkes for at denne utgaven er blitt mulig, og en liten fungerende komité har vært i aksjon. Ranghild Hanche-Olsen har vært Fiskehelse sin kontakt ved Veterinærinstituttet og Eirik Frøiland ved Norges Fiskerihøgskole/Universitetet i Tromsø. I tillegg har Vidar Aspehaug vært kontakt mot Høgskolen i Ålesund. Vi håper artiklene i denne utgaven speiler noe av den aktiviteten som foregår rundt om i landet. Vi takker artikkelforfatterne som har bidratt, og sender samtidig en oppfordring til andre skriveføre om å sende inn stoff. Tekna Fiskehelseforeningen (FHF) har innledet og formalisert et faglig samarbeid med Akvaveterinærenes forening (AVF) om konferanse og kurs. Dette innebærer at begge foreningene vil arbeide sammen om å arrangere Frisk Fisk-konferansen og ulike fagkurs, der FHF har hovedansvar for gjennomføring av konferansen og AVF for kurstilbudet. Begge foreningene har begrensede ressurser, slik at dette er et viktig steg for å samle innsatsen for å fremme fagfeltet fiskehelse. Vi håper derfor på god deltagelse, både på konferansen i Tromsø i januar 2007 og på vårkurset i Oslo i mars. Tema for kurset er De mest tapsbringende sykdommene på laks og torsk, der en fokuserer på nyervervet kunnskap innenfor viktige sykdommer på både torsk og laks. Se ellers egen annose for vårkurset i denne utgaven. For FHF er det faglige samarbeidet med AVF viktig, og signaliserer et tidsskille og peker på hva foreningen vil vektlegge fremover. Med hilsen, Kjetil Korsnes Medlemskontakt Har du spørsmål eller kommentarer til styret i Fiskehelseforeningen, kan følgende adresse benyttes: medlemskontakt@fiskehelseforeningen.org Vi ber også om at medlemmer som har fått ny mailadresse melder i fra til medlemskontakten, slik at informasjon fra styret når ut til dere. 4

5 Medfødt forsvar mot virus hos fisk Professor Børre Robertsen Institutt for marin bioteknologi, Norges fiskerihøgskole/universitetet i Tromsø, 9037 Tromsø e-post: borre.robertsen@nfh.uit.no Det er vel kjent at virussykdommer forårsaker store tap i norsk lakseoppdrett. Normalt er imidlertid både fisk og pattedyr ganske motstandsdyktige mot virus. Dette skyldes at det medfødte immunforsvaret stopper de aller fleste virusinfeksjoner i en tidlig fase. Grunnen til at mennesker eller fisk likevel blir angrepet av virus, kan være at forsvaret svekkes av stress eller infeksjoner. Laks er for eksempel ganske motstandsdyktig mot IPN-virus, bortsett fra i tidlig yngelfase da immunsystemet er lite utviklet, og etter utsett av smolt i sjø da immunsystemet antakelig er svekket. Noen virustyper klarer dessuten å unngå eller hemme dyrets forsvarsmekanismer. Det er også kjent at ulike laksestammer har betydelig variasjon i mottakelighet for IPNV. Laks har med andre ord et medfødt immunforsvar mot IPN-virus som varierer i effektivitet avhengig av laksestamme, livsstadium og hvilke forhold fisken lever under. Som beskrevet nedenfor tyder forskningen på at atlantisk laks har et dårlig medfødt immunforsvar mot ILAvirus. Interferonsystemet er den viktigste mekanismen i det medfødte forsvaret hos pattedyr [1], og senere års forskning har vist at fisk har et interferonsystem som ligner mye på det man finner hos pattedyr [2]. Forskningen ved Institutt for marin bioteknologi, NFH, har bidratt til å avdekke viktige funksjoner i interferonsystemet hos laks. Interferonsystemet Interferonsystemet aktiveres ved at vertscellene gjenkjenner to-trådig RNA (dsrna) som produseres ved replikasjon av de aller fleste virus [1,2]. Dermed begynner cellene å produsere et alarmprotein som kalles interferon (IFN) som sirkulerer rundt i kroppen og signaliserer til kroppscellene at de skal begynne å produsere antivirale proteiner som hemmer virusreplikasjonen (Fig. 1). I mange tilfeller kan da IFN-systemet stoppe videre invasjon av Figur 1: Funksjonen til interferon (IFN) i cellers forsvar mot virus. Når en celle infiseres av virus, gjenkjenner cellen to-trådig RNA (dsrna) som produseres ved virusreplikasjonen. Dette skjer ved gjennom binding av dsrna til et av reseptorproteinene PKR, RIG- I, MDA-5 eller TLR3. Binding setter i gang en signalprosess som ender med at transkripsjonsfaktorene NF-κB, IRF-3 (og eller IRF- 7) blir fosforylert og dermed vandrer inn i kjernen hvor de fester seg til promoterregionen til IFN-genet. Som følge produseres alarmproteinet IFN, som skilles ut og sirkulerer i blodbanen. IFN binder seg til et reseptorprotein som finnes på overflaten av de fleste celler, og denne bindingen signaliserer at cellen skal produsere Mx, ISG15 og andre antivirale proteiner som hemmer replikasjonen av viruset. IFN kan på den måten beskytte celler mot virusinfeksjon. Pilene indikerer signaler som går inne i cellen som respons på påvirkningene. De viktigste proteinene som inngår i signalveien for IFN-produksjon er vist i cellen til venstre. I IFNstimulerte celler aktiveres den såkalte Jak/Stat-veien signalveien som vist i cellen til høyre. Dette fører til fosforylering av transkripsjonsfaktorene Stat1, Stat2 og IRF-9 som vandrer inn i kjernen og binder seg til såkalte interferon-stimulerte responselmenter (ISRE) i promoteren til IFN-stimulerte gener som Mx og ISG15. 5

6 viruset. Viktigheten av IFN-systemet i forsvar mot virus hos pattedyr er grundig dokumentert. Mus som har defekte gener for IFN-reseptorer, blir for eksempel svært mottakelige for ulike virusinfeksjoner. IFN-systemet er trolig like viktig i fiskens forsvar mot virus. Man har først i de senere år begynt å forstå hvordan celler gjenkjenner virus. Dette skjer ved at dsrna binder seg til reseptorproteiner inne i cellen. Man kan faktisk bruke poly I:C, et syntetisk dsrna, til å imitere en virusinfeksjon. Reseptorproteiner for viralt dsrna omfatter protein kinase R (PKR) og RNA-helikasene RIG-I og MDA-5 som finnes i cytoplasma, samt Toll-lignende reseptor 3 (TLR3) som er lokalisert til endosomer. Viralt enkelttrådig RNA kan dessuten gjenkjennes av TLR7 og TLR8 mens viralt DNA kan gjenkjennes av TLR9. Disse reseptorene finnes i endosomene hos plasmacytoide dendrittiske celler som er superprodusenter av IFN. Binding av viral nukleinsyre til reseptor setter altså i gang en signalprosess som leder til produksjon og sekresjon av IFN (Fig. 1). I neste omgang binder IFN seg til en spesifikk reseptor på nye vertsceller og setter dermed i gang en signalprosess som leder til syntese av antivirale proteiner som gir beskyttelse mot virusinfeksjon. Laksens interferon beskytter celler mot infeksjon av IPN-virus Mens de første IFN-genene hos mennesker ble klonet i 1980, ble de første IFN-genene hos fisk klonet i 2003, deriblant fra atlantisk laks [2,3]. Grunnen til at det tok så lang tid før IFN hos fisk ble klonet, er at sekvenslikheten mellom IFN fra pattedyr og fisk svært liten (<30%). I likhet med pattedyr viste laks seg å ha to hovedtyper IFN, type I IFN som virker i det medfødte immunforsvaret, og type II IFN som virker i det adaptive immunforsvaret [2]. Type II IFN er identisk med IFN-γ og vil ikke bli nærmere diskutert her. Mens mennesket har mange ulike subtyper av type I IFN (IFN-α, IFN-β, IFN-δ, IFN-ε, IFN-κ, IFN-τ, IFN-ω,og IFN-λ), har man foreløpig bare funnet én type I IFN hos laks og annen fisk. Hos laks finnes det imidlertid minst to gener som koder for lignende utgaver av type I IFN, og de ligner mest på IFN-α fra pattedyr [3]. Laksens IFN-α har en molekylmasse på 18,2 kda, er stabilt ved ph 2 og blir indusert av både dsrna og virusinfeksjon. Følgelig har laksens IFN egenskaper som ligner veldig mye på type I interferoner fra pattedyr. Ved å sette IFN-genet fra laks inn i menneskeceller dyrket i kultur, ble det mulig å lage såkalt rekombinant lakse-ifn som dermed kunne testes for antiviral aktivitet [3]. Testen blir gjort ved å inkubere lakseceller i 24 timer med IFN og deretter smitte cellene med IPN-virus (Fig. 2). Når kontrollcellene begynner å dø av virusinfeksjonen, blir cellene fiksert og farget med krystallfiolett. Overlevende celler blir sterkt farget, mens døde celler forblir fargeløse. Som illustrert på figur 2 viser slike forsøk at rekombinant lakse-ifn har en potent evne til å beskytte lakseceller mot infeksjon med IPNV. Laksens IFN-α oppfyller dermed alle krav til definisjonen på type I IFN. Fortynninger av IFN F F i d f Figur 2: Antiviral assay som viser at lakseinterferon beskytter celler mot infeksjon av IPN-virus. Bildet viser brønner med TO-celler i et celledyrkningsbrett etter farging med krystallfiolett. Ubehandlede celler eller celler behandlet med ulike fortynninger av rekombinant lakseinterferon ble først inkubert i 24 timer. Cellebrønner merket IPNV og IFN+IPNV ble deretter infisert med IPN-virus, mens cellebrønner merket Uinf og IFN forble uinfiserte. Tre dager senere ble cellene fiksert og farget. Fargeintensiteten korrelerer med antall levende celler i brønnene. 6 s d s f d s f g t e

7 Mx og andre antivirale proteiner produseres i celler som respons på IFN og dsrna Hos mus og menneske er det vist at IFN kan skru på avlesning av flere hundre gener der noen av genene koder for antivirale proteiner [1]. Dette setter i gang en rekke mekanismer som i sum stopper replikasjonen av virus. De antivirale funksjonene er bare kjent for enkelte av de IFNinduserte proteinene. Noen antivirale proteiner slik som ISG56 og protein kinase R (PKR), hemmer translasjon av Figur 3: Tillaging av lakseceller som produserer Mx-protein kontinuerlig. mrna til protein, mens 2, 5 -oligoadenylat syntetase (OAS) aktiverer en RNase som ødelegger viralt (og cellulært) RNA. Andre antivirale proteiner kan indusere programmert celledød (apoptose). Cellen kan altså gå så langt som å bremse opp egne livsviktige funksjoner eller til og med ødelegge seg selv for å hindre produksjon av virus-partikler. Et av de mest studerte IFN-induserte proteinene er Mx-proteinet, som hos mus og menneske hemmer replikasjon av influensavirus og flere andre virustyper. Faktisk er det vist at resistens mot influensavirus hos mus nedarves som et enkelt dominant gen og at dette genet koder for Mx-protein. Musas Mxprotein er lokalisert til kjernen mens menneskets Mx-protein er lokalisert til cytoplasma mens. Mx-proteiner er GTPaser, men hvordan de hemmer virusreplikasjon er fremdeles usikkert. Bare når det gjelder orthomyxoviruset Thogotovirus har en vist at Mx-protein blokkerer import av viralt nukleoprotein inn i kjernen. ISG15 er et av de proteinene som induseres tidligst og produseres i størst mengde i IFN-stimulerte celler. Dette proteinet er spesielt interessant både fordi det har evne til å binde seg kovalent til andre cellulære proteiner, og fordi det ser ut til å være involvert i antivirale mekanismer. Hvordan ISG15 virker antiviralt er heller ikke kjent. De siste årenes massive sekvensering av gener hos fisk har vist at denne vertebratgruppen har de fleste av de IFN-induserte genene som er påvist hos pattedyr. Unntaket er OAS som kanskje ikke finnes hos fisk. Vår gruppe har klonet både Mx og ISG15 fra laks og har vist at disse proteinene blir indusert av IFN, dsrna og virus i levende fisk og dyrkede fiskeceller [4-7]. Mxproteinene hos laks ser ut til å være lokalisert til cytoplasma. Vi har også klonet Mx-protein fra kveite, men det viste seg å være lokalisert til kjernen [8]. Nedenfor er det beskrevet hvordan vi viste at laksens Mx-protein faktisk hemmer replikasjon av IPN-virus. Laksens Mx-protein hemmer replikasjon av IPN-virus Genteknologiske metoder har gjort det mulig å studere den antivirale aktiviteten til laksens Mx-protein [9]. Mxgenet fra laks ble satt inn i et plasmid (mini-kromosom) utstyrt med DNA-sekvenser som gjør at genet blir avlest kontinuerlig i dyreceller (Fig.3). Plasmid med Mx-gen ble deretter brukt til å selektere fram lakseceller som produserer Mx-protein kontinuerlig (Fig.4). Figur 4: Uttrykk av Mx-protein i lakseceller vist med farging av spesifikt antistoff. ASMx1: Celler som er genetisk manipulert til å produsere Mx-protein fra atlantisk laks kontinuerlig. IFN: Celler som er stimulert med rekombinant lakseinterferon. Kontroll: Ubehandlede celler. r b d f 7

8 Mx-produserende lakseceller ble i neste omgang utsatt for infeksjon med IPN-virus. Lakseceller som hadde blitt genmanipulert til å lage grønt fluorescerende protein (GFP), ble brukt som negativ kontroll. IFN-behandlede lakseceller ble brukt som positiv kontroll. Tre dager etter infeksjon ble andelen av overlevende celler i de ulike kulturene estimert med krystallfiolettfarging. Figur 5 illustrerer beskyttelsen mot IPN-virus som ble oppnådd i de ulike celletypene. I likhet med de IFN-behandlede cellene overlevde nesten 100 prosent av cellene som produserte Mx-protein infeksjon med IPN-virus, mens kontrollcellene døde. Dette viser at laksens Mx-protein beskytter cellene mot IPN-virus, og at det derfor antakelig er svært viktig for laksens evne til å motstå IPNvirusinfeksjoner. ILA-virus lar seg ikke hemme av IFN-systemet hos laks ILA-virus dreper laks svært effektivt ved smitteforsøk. Noe av forklaringen kan være at viruset klarer å lure IFNsystemet hos laks. Det viste seg nemlig at verken IFN eller poly I:C klarte å beskytte lakseceller mot ILA-virus, til tross for at cellene inneholdt store mengder Mx-protein [5,10]. Viruset stimulerer faktisk selv produksjon av Mx-protein og ISG15 ved infeksjon av levende laks eller celler in vitro. Disse resultatene tyder på at ILA-virus enten unngår å bli hemmet av antivirale proteiner, eller at det selv hemmer sentrale antivirale mekanismer i IFNsystemet. At ILA-virus ikke lar seg hemme av laksens Mx-protein var overraskende fordi det jo er et orthomyxovirus og mammalske orthomyxovirus som influensavirus blir jo effektivt hemmet av vertens Mxprotein. Forskningen på IFN-systemet avdekker svakheter i laksens iboende immunitet mot IPN- og ILA-virus Vår forskning viser altså at IFN er i stand til å beskytte lakseceller mot IPNV-infeksjon og at Mx-protein bidrar til å hemme replikasjonen av viruset. Dette tyder på at laksen har betydelig iboende immunitet mot IPN-virus, noe som kan synes rart når IPN fremdeles er et så stort problem hos nyutsatt smolt i oppdrettsnæringen. Imidlertid er det nå grunn til å påpeke at det i flere år har vært svært vanskelig å rutinemessig framkalle høy dødelighet hos laksesmolt ved eksperimentell smitte med IPNV. Smittelaboratoriene både i Namsos og Tromsø har faktisk hatt store problemer med å tilby reproduserbare smittemodeller for IPN! Dette må jo bety at laksesmolten har stor motstandskraft mot IPN når den oppstalles under optimale forhold. Postsmoltdødelighet på grunn av IPN i felt kan derimot skyldes at IFN-systemet hos fisken er svekket, for eksempel på grunn av høy fisketetthet og dårlig vannkvalitet eller fordi en stor andel av fisken er for dårlig smoltifisert. IFN-systemets potente evne til å beskytte lakseceller mot IPN-virus indikerer at det burde være mulig å få bukt med IPN-problemet i felt. Problemstillingen er helt annerledes for ILA-virus. Viruset lar seg ikke hemme av IFN-systemet hos laks. Tvert i mot stimulerer viruset sterk syntese av IFN, Mx-protein og ISG15 både i lakseceller og levende laks. Kanskje drar viruset fordel av å framkalle kraftige betennelsesreaksjoner hos laksen. Laks ser altså ut til å ha svært liten iboende immunitet mot ILA-virus. Dette kan bidra til å forklare hvorfor det er så enkelt å framkalle høy dødelighet hos laks i laboratoriet selv med små doser ILA-virus både ved injeksjon og kohabitant-smitte. Heldigvis er antall ILAutbrudd per år relativt lavt, noe som jo indikerer at virulente varianter av viruset ikke forekommer endemisk langs kysten. Skulle problemet eskalere, må en nok basere seg på å vaksinere mot ILA. Forskningen på IFN-systemet hos laks bidrar altså til å avdekke svakheter i fiskens medfødte forsvar mot to av de mest problematiske virusene i oppdrett. Applikasjoner Vår forskning har vist at Mx-protein er en viktig markør for laksens helsetilstand når det gjelder evne til å motstå infeksjon av IPN-virus. Slike molekylære markører kan forhåpentlig brukes til å avsløre forhold som svekker fiskens immunforsvar, og hvordan fiskens forsvar mot virus eventuelt kan stimuleres i kritiske perioder av fiskens livssyklus. Til dette formålet forsøker vi nå å utvikle Figur 5: Effekt av IPN-virusinfeksjon på lakseceller som produserer Mx-protein kontinuerlig (ASMx1), celler som er stimulert med lakseinterferon (IFN) i 24 timer, celler som produserer grønt fluoreserende protein kontinuerlig (GFP) og ubehandlede celler (kontroll). a. Prosent overlevende celler 3 dager etter infeksjon ble beregnet ved å måle lysabsorbsjonen ved 550 nm etter farging med krystallfiolett. b. Virusutbytte i cellene 3 dager etter infeksjon. 8

9 antistoff-baserte assays (ELISA) for Mx-protein og IFN. Informasjon om antivirale gener i IFN-systemet kan forhåpentlig også være viktig for avlsprogrammene. Forskjell i resistens mot virus hos ulike laksestammer kan imidlertid også ha andre forklaringer som for eksempel ulikheter i reseptorer for virus eller nivåer av naturlige antistoffer mot virus. Fra pattedyrforskningen er det kjent at IFN-systemet spiller på lag med det adaptive immunsystemet i kampen mot infeksjoner. IFN eller IFN-stimulerende forbindelser kan nemlig forsterke effekten av vaksiner, det vil si fungere som adjuvanter. Dette vil vi også teste ut på laks. I et nytt forskningsprosjekt finansiert av Havbruksprogrammet skal vi nå også forsøke å utvikle immunologiske assays for laksens IFN-gamma som produseres ved adaptiv cellulær immunrespons. Dette interferonet produseres ved virus-infeksjon av dyr som er immunisert gjennom vaksinering eller naturlig infeksjon. Assays for IFN-gamma er tenkt brukt til å evaluerer effektiviteten av virus-vaksiner. Referanser 1. Haller O, Kochs G, Weber F. The interferon response circuit: Induction and suppression by pathogenic viruses. Virology 2006;344: Robertsen B. The interferon system of teleost fish. Fish and Shellfish Immunology 2006;20: Robertsen B, Bergan V, Rokenes T, Larsen R, Albuquerque A. Atlantic salmon interferon genes: cloning, sequence analysis, expression, and biological activity. J Interferon Cytokine Res 2003;23: Rokenes TP, Larsen R, Robertsen B. Atlantic salmon ISG15: Expression and conjugation to cellular proteins in response to interferon, double-stranded RNA and virus infections. Mol Immunol 2007;44: Jensen I, Robertsen B. Effect of double-stranded RNA and interferon on the antiviral activity of Atlantic salmon cells against infectious salmon anemia virus and infectious pancreatic necrosis virus. Fish Shellfish Immunol 2002;13: Jensen I, Albuquerque A, Sommer AI, Robertsen B. Effect of poly I:C on the expression of Mx proteins and resistance against infection by infectious salmon anaemia virus in Atlantic salmon. Fish Shellfish Immunol 2002;13: Robertsen B, Trobridge G, Leong JC. Molecular cloning of double-stranded RNA inducible Mx genes from Atlantic salmon (Salmo salar L.). Dev Comp Immunol 1997;21: Bergan V, Robertsen B. Characterization of Atlantic halibut (Hippoglossus hippoglossus) Mx protein expression. Dev Comp Immunol 2004;28: Larsen R, Røkenes TP, Robertsen B. Inhibition of infectious pancreatic necrosis virus replication by Atlantic salmon Mx1 protein. J Virol 2004;78: Kileng Ø. Infectious salmon anemia virus is a powerful inducer of genes of the tyep I interferon system of Atlantic salmon, but is not inhibited by interferon. Fish and Shellfish Immunology 2007; accepted. 9

10 et nutreco-selskap Respons det beste forsvar Styrk immunforsvaret med Respons før perioder der fisken har det ekstra tøft. En sterk fisk takler stress og kan bruke energien på fôrutnyttelse og vekst. God fiskehelse lønner seg! Flere overlevende høyere marginer. 10 Feeding your passion for fish

11 Hurtigtest for IPN infeksiøs pankreasnekrose Atle Lillehaug* og Torunn Taksdal Seksjon for fiskehelse, Veterinærinstituttet, Postboks 8156 Dep, 0033 Oslo *e-post: Infeksiøs Pankreasnekrose Infeksiøs pankreas nekrose er en alvorlig smittsom virussjukdom, i første rekke hos laksefisk i intensivt oppdrett, der sjukdommen til dels forårsaker omfattende dødelighet. Opprinnelig var IPN regnet som en yngelsjukdom som opptrådte kort tid etter startfôring, men i de senere år har det vært registrert utbrudd hos større fisk (parr/smolt) og etter utsetting i sjø. Det sees også utbrudd på regnbueørret. Klinisk sjukdom som følge av IPNV er også rapportert fra en rekke marine arter. IPN forårsakes av IPN-viruset, som er et birnavirus med dobbelttrådet RNA. Det er beskrevet en rekke serotyper av viruset, og stammer som isoleres i forbindelse med sjukdomsutbrudd på laksefisk i Norge, tilhører i de aller fleste tilfeller serotypen som går under betegnelsen Sp. Det sees små variasjoner mellom disse isolatene. I Norge er IPN en rapportpliktig gruppe-b sjukdom. På åttitallet ble det observert en sterk økning i påvisningen av IPN-virus både i sjøvann og ferskvann, i mange tilfeller uten at det ble registrert sjukdomsproblemer. Dette førte til at myndighetene endret praksis for tiltak mot sjukdommen, og båndlegging som følge av påvisning av IPNV skjer nå bare dersom det samtidig registreres dødelighet som kan relateres til påvisningen av viruset. IPN er trolig fortsatt en av de aller mest tapsbringende sjukdommene i norsk fiskeoppdrett. I 2005 ble IPN påvist på i overkant av 200 lokaliteter, og dette var en økning fra året før. Ved Veterinærinstituttet ble diagnosen IPN stilt på over 300 innsendte prøver. IPN-utbrudd sees oftest på sommeren på vårutsatt laksesmolt, men diagnosen stilles også på andre årstider og gjennom hele produksjonssyklusen. Det er stor variasjon i forløpet av IPN-utbrudd, enkelte anlegg kan erfare bare små tap, mens andre tilfeller kan gi opptil 50-70% mortalitet. Fisk som overlever et akutt IPN-utbrudd, kan ha varige skader i pankreas og vil kunne avmagres fordi de har redusert evne til å fordøye fett og protein. Hurtigtest På nittitallet ble det ved Seksjon for fiskehelse, Veterinærinstituttet, utviklet en hurtigtest til hjelp for å stille diagnosen IPN ved kliniske utbrudd i felt (Taksdal & Thorud, 1999). Testen er en såkalt koagglutinasjonstest som påviser virusantigen i fiskevev, og det er fortrinnsvis nyrevev som benyttes. Testen har begrenset følsomhet, og derfor viser den bare positiv reaksjon ved høge virustiter, noe man forventer å ha ved kliniske utbrudd av IPN. Prinsippet i testen er at polyklonale antistoffer mot IPNvirus, produsert i kanin, er koblet til drepte stafylokokker. Protein A på overflaten til disse bakteriene binder immunglobulin. Bakteriecellene er farget, og når antistoffene binder seg til virus fra fiskevev under testen, vil det føre til at bakteriecellene agglutinerer. På grunn av fargingen er dette synlig for det blotte øyet ved at det felles ut fnokker i prøveløsningen. For praktisk gjennomføring er det behov for sentrifuge og pipetter. Det tas ut i størrelsesorden 0,5-1g nyrevev, for mindre fisk kan organpakke eller hel yngel uten hode og hale benyttes. Prøvemateriale knuses sammen med fortynningsvæske i en plastpose, og løsningen sentrifugeres. På et pappbrett avsettes en dråpe av testløsning og kontrolløsning i hver sin sirkel, og blandes med en dråpe hver av supernatanten fra prøvematerialet etter sentrifugeringen. Hvis en får utfelling i dråpen med antistoff mot IPNV (uten at det oppstår slik reaksjon i kontrolløsningen), er testen positiv. Dersom testen benyttes i forbindelse med et nytt sjukdomsutbrudd, bør det sendes inn formalinfiksert materiale til laboratoriet for histologi og immunhistokjemi for å bekrefte diagnosen. I noen tilfeller sees agglutinasjon i begge testløsninger. Årsaken til dette er ikke klarlagt, men er trolig knyttet til prøvematerialet. I slike tilfeller kan en forsøke å gjennomføre testen på nytt på annet materiale fra samme utbrudd, eller man kan sende inn formalinfiksert materiale som beskrevet ovenfor. Sikkerheten ved bruk av testen er svært god i forhold til å stille en positiv IPN-diagnose. I løpet av en treårs periode ble det bare registrert en falsk positiv reaksjon av 320 undersøkelser. Risikoen for å stille en falsk negativ diagnose er større; i et materiale bestående av 94 test negative prøver, ble IPN påvist på et eller flere individer med immunhistokjemi i 16 av tilfellene (17%). Risikoen for falske negative reduseres ved å undersøke samleprøver fra flere fisk. Prøvematerialet bør ikke fryses, men kan oppbevares kjølig i et døgn før undersøkelse. Testen kan bestilles fra Veterinærinstituttet i pakninger på 25 (kr 5000,-) eller 50 tester (kr ,-). Porto kommer i tillegg. E-post for bestilling: fisk@vetinst.no Referanser Taksdal T & Thorud K: Evaluation of a rapid coagglutination (COA) test for the detection of infectious pancreatic necrosis virus (IPNV) in tissue samples of Atlantic salmon, Salmo salar L. Journal of Fish Diseases 1999; 22:

12 12 FISKEHELSE - 8. årgang nr. 1, 2006

13 Nodavirus en overdreven fare eller en reell trussel? Kjetil Korsnes 1,2*, Egil Karlsbakk 3, Øivind Bergh 2, Sonal Patel 2, Trond E. Isaksen 3, Audun H. Nerland 2 og Are Nylund 3 1 Avdeling for Fiskeri- og Naturfag, Høgskolen i Bodø, 8049 Bodø 2 Havforskningsinstituttet, Postboks 1870 Nordnes, 5817 Bergen 3 Biologisk Institutt, Universitetet i Bergen, 5020 Bergen *e-post: kjetil.korsnes@hibo.no Det har vært skrevet en del om nodavirus de siste årene, og fokus har ofte vært på spredning og mottakelighet hos fisk som oppdrettes. I kjølvannet av alle oppslagene i media kan en spørre seg om sykdom forårsaket av nodavirus utgjør en reell fare, eller først og fremst er interessant for forskningsmiljøene. Ettersom nodavirus igjen er aktualisert gjennom nye utbrudd av sykdom på både kveite og torsk, vil en gjennomgang og oppsummering av kunnskap rundt viruset gi oss grunnlag for diskusjon. For spesielt interesserte? I norsk sammenheng er sykdom knyttet til nodavirus tilsynelatende et marginalt problem som i første rekke har rammet yngelprodusenter av kveite. Dokumenterbare utbrudd har vært registrert siden 1995, men det er grunn til å anta at sykdommen var tilstede ved dødelighet på piggvar allerede i Totalt sett var det et begrenset antall utbrudd på kveite og piggvar i perioden I samme periode ble det også avdekket bærere av viruset hos disse to artene, uten at det ble registrert utbrudd av sykdom. Med tanke på at total produksjon av kveite i 2005 var 1173 tonn og av piggvar (2004) 278 tonn (kilde: Fiskeridirektoratet), kan det se ut som om sykdommen rammer en svært liten del av oppdrettsnæringen. Er den dermed en sykdom for spesielt interesserte? Det er imidlertid noen trekk som er verdt å merke seg før en eventuelt avfeier den som et marginalt problem. B-gruppe sykdom Mattilsynet har klassifisert sykdommen i B-gruppen, der praksis har vært å båndlegge anlegg ved påvisning. Dette kom som følge av utbruddene i siste halvdel av 90-tallet og på grunn av problemer viruset har forårsaket i oppdrett av marine arter andre steder i verden. Båndlegging er en klassisk måte å bekjempe sykdommer som vurderes som en trussel mot oppdretts- og villfisk. Syk fisk fjernes for å hindre smitteoverføring innen samme anlegg eller til nærliggende områder. Denne vurdering førte til etablering av et overvåkningsprogram som gikk fra 1999 til 2004, der hensikten var å systematisk avdekke virus i oppdrettsbestander av kveite, piggvar og torsk. Ved utvikling av sykdom eller påvisning av virus gikk Mattilsynet inn og båndla anlegg og vurderte aktuelle tiltak. Denne praksisen har gjort at en mistanke eller påvisning ble svært alvorlig for en oppdretter. Mattilsynet har ikke hatt noen enhetlig praksis på hvilke tiltak som skal iverksettes, men har hatt ulike vurderinger i ulike regioner av landet. Denne måten å håndtere sykdommen på har ført til usikkerhet på hvilke konsekvenser en påvisning av viruset vil medføre. Overvåkningsprogrammet ble avsluttet i 2004 etter innføring av EUdirektiv 91/67, og etter den tid har det ikke vært offentlig påvist virus før sommer og høsten I løpet av et kort tidsrom fikk en påvist sykdommen i ett kveite- og flere torskeanlegg. Utbredelse? Effektiv bekjempelse av sykdom krever at en kjenner smitteveiene, mottakelige verter og utbredelsen av sykdomsfremkallende organismer. For nodavirus ser smitteveiene ut til å være både vertikal (gjennom egg og melke) og horisontal (mellom fisk), og vertsregisteret er svært stort (Munday et al. 2002). Når det gjelder utbredelse er kunnskapen begrenset, og overvåkningsprogrammet var ment å si noe om situasjonen rundt om i oppdrettsanleggene. Problemet med programmet var todelt; 1) metoden for påvisning av virus var best egnet til å avdekke fisk med mye virus tilstede (lite sensitiv metode) og 2) uttak av fisk for analyser var overlatt til oppdretterne selv. Med tanke på mulige konsekvenser ved en påvisning av viruset, er det ikke vanskelig å forstå at det ikke alltid var fisk med sykdomstegn som ble underlagt undersøkelse. Motivasjonen for å være selektiv i uttaket var med andre ord tilstede. Programmet fanget likevel opp to tilfeller der en påviste viruset men ikke registrerte sykdomsutbrudd, og to tilfeller der en fikk utbrudd av sykdommen. Hvorvidt dette gir et representativt bilde er det grunn til å stille spørsmålstegn ved. Uavhengige positive funn i tilsynelatende virusfrie anlegg tyder på at programmet ikke har fanget opp den reelle utbredelsen av viruset (Korsnes et al. 2005a). I løpet av de siste årene har metodene for påvisning av viruset blir mye bedre (mer sensitive), slik at en i dag er i stand til å fange opp fisk som kun er bærer av viruset. Metodikken er blant annet brukt til undersøkelser av villfisk, der en har funnet det hos arter som torsk, sei, makrell, rødspette og breiflabb (Nylund et al. 2006). Selv om denne undersøkelsen er pågående og så langt ikke omfattende, peker den mot at viruset er mer vanlig i både ville og oppdrettede bestander av marin fisk enn først antatt. En slik utbredelse vil i så fall medføre at dagens tiltak ved påvisning i oppdrettsanlegg ikke kan bekjempe sykdommen. I tillegg har motivasjonen hos oppdrettere for å lete etter viruset (med nye sensitive metoder) ikke blitt noe større etter opphevingen av overvåkningsprogrammet. Ettersom sykdommen er klassifisert i B-gruppen, er prinsippet om at det en ikke vet har en ikke vondt av gjeldende praksis. Det er ikke så vanskelig å forstå at oppdrettere ikke er interessert i 13

14 VER/VNN utbrudd hos oppdrettstorsk. Foto: Sonal Patel. påvisning av B-sykdom, og dette gjør en systematisk innsamling av materiale fra anleggene svært vanskelig. Konsekvensen er at en ikke får noen oversikt over utbredelsen, og det gjør det svært vanskelig å forutse sykdomsutbrudd eller begrense spredning av viruset. Mye taler derfor for at en må endre forvaltningspraksis ved påvisning, og legge seg mer på linje med praksis rundt IPN-påvisninger hos laks. Nye utbrudd av sykdom Sommer og tidlig høst 2006 ble det registrert sykdomsutbrudd ved Havforskingsinstituttets forskningsanlegg i Austevoll (kveite) og Parisvatn (torsk), som begge ligger i Hordaland. I Austevoll har det vært påvist nodavirus på kveite tidligere, men utbruddet i Parisvatnet på torsk er første registrering på denne arten i Norge (Patel et al. 2006). Det er senere konstatert flere utbrudd andre steder, som viser at viruset finnes i torskeoppdrettsanlegg. At torsk er en mottakelig art er kjent fra både Nord-Amerika og Skottland, og det har vært fryktet at en skulle få utbrudd her i landet. Utbruddet i Parisvatnet kom på torsk mellom gram ved en sjøtemperatur på C, der en observerte klassiske tegn som spiralsvømming og likevektsproblemer hos fisken (Patel et al. 2006). Et interessant trekk ved utbruddet er størrelsen på torsken, som er stor sammenlignet med sykdomsutbrudd i Nord-Amerika (torskeyngel) og Skottland (1,5-3,5 gram) (Starkey et al. 2001, Johnson et al. 2002). Produksjonen av torsk (7410 tonn) var i Norge i 2005 beskjeden sammenlignet med laks, men det er forventet en kraftig økning i årene som kommer. Det er derfor grunn til å være oppmerksom på nodavirus som mulig sykdomsproblem. Blir nodavirus et problem? En kan stille seg spørsmålet om utbruddene i 2006 er isolerte hendelser som ikke har noen betydning på lang sikt, eller om det kun er toppen av et isfjell? Det er vanskelig å spå om fremtiden, men en bør være forberedt på mulige konsekvenser. Dersom en kun ser på sykdomsstatus i Norge, kan det virke noe søkt å vurdere at nodavirus vil skape problemer i fremtiden, men en skal ikke lenger tilbake enn til 80-tallet for å finne en infeksjon som utviklet seg til å bli svært problematisk. Det var ingen som forutså at infeksjon med lakselus ville bli et stort problem. I takt med den voldsomme veksten i lakseproduksjonen utviklet 14 lakselusen seg til å komme så å si ute av kontroll. Hadde en beskrevet situasjonen for både oppdretts- og villaksen på slutten av 90-tallet 15 år tidligere, ville de fleste avfeid scenarioet som tankespinn uten realisme. Spredningen av lakselus formelig eksploderte gjennom 90-tallet, og dette medførte at en egen forskrift for bekjempelse ble iverksatt i Analogien til parasitten lakselus er relevant fordi den forteller noe om misforholdet mellom forskning på den ene siden og oppdretts- og forvaltningspraksis på den andre. Det var opparbeidet mye kunnskap om lakselus, men det resulterte ikke i at denne ble brukt for å forebygge eller bremse problemet gjennom 90-tallet. Først ved iverksettelsen av luseforskriften har en begynt å få bukt med problemet, gjennom en forskrift som først og fremst skal beskytte villaksen. Det er ikke dermed sagt at en vil se en tilsvarende utvikling når det gjelder nodavirus, men løfter vi blikket ut i verden trenger en ikke å se langt før sykdommen er svært aktuell. Problemer i europeisk oppdrett Et eksempel på at nodavirus har blitt et sykdomsproblem er fra oppdrett av havabbor i Middelhavet. Der har en siden 1991 påvist sykdommen, men problemet økte i omfang i 1995 med en rekke utbrudd av sykdommen, spesielt når sjøtemperaturen har oversteget C (Le Breton et al. 1997, 1999; Bovo et al. 1999). Sykdommen økte i omfang i denne regionen etter en import av sjøabbor til Malta, og spredte seg til andre anlegg i området etter kort tid. Det er imidlertid ikke stadfestet at spredningen skyldtes direkte smitte mellom anleggene, og derfor har det vært spekulasjoner om at villfisk har vært involvert i smittespredningen. Ut fra funnene gjort ved Universitetet i Bergen (Nylund et al. 2006), bør en se nærmere på om viruset kan overføres fra villfisk til oppdrettsfisk og vice versa. På basis av det forholdsvis store innslaget av bærere av viruset i undersøkte villtorsk-bestander (20-50%), er det i alle fall rimelig klart at infisert fisk har vært tatt inn i anlegg og brukt som stamfisk. Disse bærerverdiene er foreløpige data fra prosjektene Bakgrunnsnivåer av patogener hos torsk og Torskehelse Kartlegging av sjukdomsagens i Hordaland som går ved UiB. I dag gjør sykdomstatusen i Middelhavet at nodavirus ansees som en alvorlig trussel for akvakulturnæringen der. Smitte mellom arter Det store vertsregisteret til nodavirus gjør at en skal være oppmerksom på mulig overføring mellom ulike arter i oppdrett. I Norge er det lakseproduksjon som utgjør hovedtyngden av oppdrett, noe som vil vedvare i mange år fremover. Fra et forskningssynspunkt har det derfor vært viktig å undersøke om nodavirus kan bli et sykdomsproblem på laks. I mange tilfeller er det like viktig å avdekke mottakelighet for nye sykdomsorganismer som å finne nye sykdomsutbrudd for å kunne iverksette tiltak for å hindre smittespredning eller -overføring. Det har ikke vært rapportert utbrudd av sykdommen hos laks, men det finnes rapporter på laks med kliniske tegn (Scullion et al. 1996) og funn av nodavirus-lignende partikler i hjertet hos laks (Grotmol et al. 1997; Nilsen og Nylund 1998). Med bakgrunn i slike observasjoner ble det gjennomført et smitteforsøk der nodavirus ble injisert i laks (Korsnes

15 et al. 2005b), der en fant at laksen utviklet sykdommen. En injeksjon av virus representerer ikke noen normal smitteoverføring, men den viser at viruset er i stand til å gi sykdom om fisken blir smittet. Ved et motsatt utfall (at fisken ikke ble syk eller bærer) ville en kunne ha konkludert med at nodavirus ikke er en fare for laks. På grunn av mottakeligheten vist ved injeksjon, har en gjort smitteforsøk der en har simulert en naturlig smitteoverføring med å blande fisk som er smittet og usmittet i samme tank. Disse forsøkene vil gi oss svar på om viruset kan overføres til laks gjennom naturlige infeksjonsveier, og om marin fisk kan overføre viruset til laks. Dette er viktig informasjon for å kunne begrense sykdomsspredning i oppdrettsnæringen, samt gi råd om hvordan sykdommen kan bekjempes. Det er med slik type kunnskap oppdrettsnæringen kan møte fremtidige sykdomsutfordninger, og det gjelder for flere sykdomsfremkallende organismer enn bare nodavirus. Nodavirusets egenskaper En kan spørre seg hvorfor nodavirus betraktes som en alvorlig sykdomsfremkallende organisme, og noe av svaret ligger i egenskaper viruset innehar. Nodavirus er et svært lite virus med en enkel oppbygging. Dette gjør at viruset er svært vanskelig å bryte ned, og forsøk har vist at viruset overlever i vann med ph mellom 2 og 11 og at formalin har liten effekt (Arimoto et al. 1996). I oppdrettssammenheng kan det se ut til at ozonbehandling og bruk av middelet Virkon gir godt resultat, men mer tradisjonelle desinfeksjonsmidler som UV og klor- eller jod-baserte midler gir også en reduksjon i virusmengde (Grotmol og Totland 2000, Frerichs et al. 2000). Det er ikke gjort mange forsøk for å dokumentere effekten av desinfeksjon på nodavirus, og det bør gjøres flere der en simulerer en oppdrettssituasjon. Blant annet er det konkludert med at vanlig ozoneringspraksis i næringen må endres for å ha god effekt på flere virustyper (Liltved et al. 2006). Den resistente egenskapen til nodavirus gjør at det overlever både i vannmassene og i verter og vektorer over lang tid. Evnen til å motstå nedbryting er sannsynligvis sentral for spredning, der viruset overlever i miljøet og kan transporteres over lengre avstander og over lang tid. Har viruset først etablert seg i en vert, vil verten kunne bære viruset gjennom hele livet og sannsynligvis overføre det til neste generasjon som stamfisk. Hvordan håndtere nodavirus? Dersom en utelukkende ser på marinfiskproduksjonen her til lands, er det riktig å si at nodavirus per i dag ikke er noe stort problem for næringen. Men samtidig må en da huske at produksjonen er meget beskjeden både i nasjonal og internasjonal målestokk. Med tanke på de vekstprognoser en forventer for marine fiskearter, vet en av erfaring at dette medfører større risiko for sykdom. Når antall fisk øker, øker også antallet individer som kan bli syk. Dette er noe laksenæringen har fått erfare, og en har lært mye om sykdomspredning og forebygging etter tildels massive sykdomsproblemer hos laks på 80- og 90-tallet. Derfor skal en ta med seg denne erfaringen når en ny oppdrettsnæring skal bygges på andre arter. Om laks er mottaklig for naturlig infeksjon med nodavirus vil det ha konsekvenser for plassering og eventuell samkultur med marin fisk, men uavhengig av dette kan vi gi noe råd om hvordan marinfisknæringen bør møte fremtiden for å unngå problemer som følge av nodavirus. Det er fremdeles mye vi ikke har kunnskap om, men vi kan peke på følgende områder som viktige for å kunne leve med sykdommen: Screening av stamfisk For å unngå å resirkulere viruset i oppdrettsnæringen gjennom overføring av nodavirus fra stamfisk til yngel (vertikal overføring), bør en undersøke all stamfisk for tilstedeværelse av virus. Dette vil muliggjøre en seleksjon av fisk for å etablere en virusfri stamfiskbestand. Dersom viruset får etablert seg i stamfisken vil en både spre viruset og selektere for virus som blir mer aggressive (virulente). Dette fordi en resirkulering i oppdrettssammenheng gjør fiskene som overlever sykdomsutbrudd til bærere av den virulente formen. I motsatt fall, med virusfri stamfisk, vil fisk kun møte virus med opphav i villfisk. Dermed får en ikke resirkulering, men kun eksponering mot virus etablert i villfisk. Dermed unngås seleksjon mot mer virulente virusstammer (som følge av oppdrett), ettersom oppdrettsfisk kun holdes en viss tid i sjø før den slaktes. I ville bestander av fisk vil det være en seleksjon mot for høg virulens, siden det medfører stor dødelighet (utrydding av verter). I naturen vil også virus som overføres vertikalt (fra foreldre til avkom) være lavvirulente, siden egg og yngel er sårbar for infeksjon. For aggressive virus vil derfor selekteres bort siden fisken dør. I oppdrettssammenheng er det en annen situasjon, med kontinuerlig påfylling av fisk for å kompensere dødelighet eller utgang. Dette medfører seleksjon for høgere virulens, siden en da har verter som kan føre virulent-virus videre. Totalt sett er seleksjonspresset viruset blir utsatt for, både i oppdrettede og ville bestander, avgjørende for hvordan sykdommen vil utvikle seg i fremtiden. Hvilke virulensmekanismer nodavirus innehar er lite kjent, og er et område som bør undersøkes nærmere. Dette er viktig for å undersøke når fisken er utsatt for sykdomsutvikling. En smittefri stamfisk ser ut til å være en vei å gå, men det krever at en har gode metoder for å påvise viruset hos bærere, og at en har metoder for å ta ut vevsprøver for slik påvisning. Det arbeides derfor med utvikling av metoder for nodavirus-påvisning som ikke dreper stamfisken. Hvorvidt det er mulig å undersøke villfanget fisk for bærerstatus gjenstår å se, men det er mulig å velge en seleksjonsvei der det oppdrettes fisk som undersøkes og deretter velges ut som stamfisk. Stamfisk på land og kontroll av inntaksvann En forutsetning for å holde stamfiskbestanden fri for virus er beskyttelse mot eksponering. På bakgrunn av undersøkelsene av utbredelse i ville bestander, tilrådes det å holde en selektert stamfisk på land for å unngå kontakt med villfisk. Dette forutsetter at inntaksvannet behandles og desinfiseres for å unngå inntak av virus. Desinfeksjonen må ta høyde for de resistente egenskapen, slik at en benytter metoder som har dokumenterbar effekt på reduksjon av mengde virus. I stor grad handler det om prosesskontroll i stam- og settefiskanleggene, der en har full kontroll på oppdrettsbetingelsene for fisken. Tiltak 15

16 som hindrer inntak av virus eller spredning internt i anlegget er derfor sentrale. Hvordan anleggene er utformet og hvordan de drives er derfor viktig for få kontroll med sykdommen. I en optimal situasjon har vi fisken på land i et kontrollert miljø, og holder fisken der til den er robust og stor nok for å møte et eventuelt smittepress av nodavirus. Det er imidlertid uklart hvor stor fisken i så fall må være, men observasjoner kan tyde på at stor kveite utvikler sykdommen (Aspehaug et al. 1999). Tradisjonelt har likevel høg dødelighet vært assosiert med yngelstadiene. I norsk sammenheng trenger vi mer kunnskap om hvordan nodavirus gir sykdom på fisk av ulik størrelse, og hvilken betydning dette eventuelt har for hvordan vi forebygger eller bekjemper sykdommen. Det gjenstår mye arbeid for å avklare dette, og det er spesielt viktig for å vurdere mulige vaksineringsstrategier mot sykdommen. Vaksinasjon? En forutsetning for en vaksinasjon er at en kjenner til sentrale egenskaper ved viruset, blant annet hvilke fiskegrupper (størrelse) som er mottakelige, virulensmekanismer og utbredelsen. En vaksinasjon forutsetter også at fisken har et immunsystem som kan stimuleres, og dette gjør at det for de aller tidligste stadiene i livssyklusen ikke er mulig å bruke vaksiner. Patogener som finnes praktisk talt overalt kan ikke møtes med tradisjonelle veterinærmedisinske tiltak som sanering av fisken på alle infiserte anlegg. Det er langt mer naturlig å sammenlikne med lakseoppdrettets måte å takle allestedsnærværende bakterier som vibriose- og kaldtvannsvibriosebakteriene. Her ble det tidlig utviklet gode vaksiner, og uten disse ville ikke vi hatt noen norsk oppdrettsnæring. I dag er disse sykdommene under kontroll og utgjør ikke noe trussel. Kan vi lage vaksiner som beskytter torsk mot nodavirus? Det er betydelig grunn til optimisme. Havforskningsinstituttet har sammen med flere norske og internasjonale partnere arbeidet med utvikling av vaksiner mot nodavirus siden slutten av nittitallet. Utgangspunktet var de store tapene i norsk kveiteyngelproduksjon fra midten av nittitallet, som hovedsakelig var utløst av viruset. Kveite rammes imidlertid på et svært tidlig stadium i yngelutviklingen, og det er ikke mulig å vaksinere de tidligste livsstadiene av fisk siden immunsystemet utvikles gradvis. Så langt har vi måttet konkludere at kveite rammes på et så tidlig utviklingsstadium at tradisjonell vaksinasjon ikke ville ha vært mulig. Vaksinene ville ikke ha rukket å gi beskyttelse før sykdommen utviklet seg. Hos kveite er vi henvist til å vaksinere stamfisken. Beskyttelse vil da kunne overføres til larver og yngel, noe som er vist eksperimentelt med andre fiskearter og sykdomsfremkallende organismer, men foreløpig er dette dessverre uprøvd for kveite og nodavirus. Observasjonene på torsk er imidlertid svært forskjellige, og så langt tyder alt på at det er mulig å vaksinere torsk slik at det utvikles beskyttelse mot viruset i god tid. Det finnes eksperimentelle vaksiner mot nodavirus som har gitt god beskyttelse i smitteforsøk med piggvar (Husgard et al. 2001). Også piggvar rammes av nodavirus på et mer avansert utviklingsstadium enn kveite, og det er fullt mulig å vaksinere fisken og oppnå beskyttelse. En rekombinant vaksine basert på nodavirus fra kveite har gitt god beskyttelse av piggvaren i smitteforsøk. Det er også gjort forsøk med bruk av en såkalt DNA-vaksine mot et annet virus (rhabdovirus). Det interessante var at slik vaksine ga god beskyttelse også mot nodavirus, trass i at de to virusene er svært forskjellige (Sommerset et al. 2003). Man har ennå bare teorier om hvordan denne beskyttelsen fungerer. DNA-vaksiner er omdiskuterte og vil neppe få lov til å komme ut av laboratoriet på en stund, selv om det er få biologiske eller økologiske grunner til at slike vaksiner ikke kan brukes. Den rekombinante vaksinen vil nå prøves på torskeyngel. Samtidig er det kontakt med nodavirus-forskere over store deler av verden, og kunnskapsutvekslingen er betydelig. En passende vaksinestrategi bør kombineres med strenge hygienetiltak rundt stamfisk og yngelproduksjon. Ved å forhindre at yngelen kommer i kontakt med nodavirus før vaksinasjonen, kan vi holde risikoen for smitte svært lav. Når fisken settes ut i et miljø der patogenene er vidt utbredt vil den da være bedre beskyttet. Hygiene rundt stamfisk og yngel, og god kontroll mot vertikal overføring av yngelen vil, sammen med en god vaksinestrategi, lære oss å leve med nodavirus. Forebyggende tiltak Det er ingen grunn til tro at forebygging og bekjempelse av sykdom hos marin fisk er vesentlig forskjellig fra laksefiskene. Erfaringene med produksjon av laks tilsier at forebyggende tiltak er basert på kunnskap om aktuelle sykdomsfremkallende organismer, kontroll med miljøet (vannet) og helsestatus på fisken selv. Generelle prinsipper som er viktige i lakseoppdrett vil derfor være like gyldige for marinfisk. Dette omfatter blant mye annet karmiljø, desinfeksjonsrutiner, fôringsregimer, generasjonsskille, helsetilsyn, vaksinasjon og stressreduksjon. Mer enn 30 år med lakseoppdrett har vist at det er viktig med fokus på forebyggende tiltak. Ettersom marinfisknæringen er i sin spede begynnelse, er det mulig å bruke denne kunnskapen til effektiv reduksjon av risiko for sykdomsutbrudd. Erfaring med laks tilsier at transport av fisk over lange avstander medfører risiko for spredning av sykdom, og for marinfisk er det enda mulig å vurdere begrensing av slik transport og mer regional produksjon. I tillegg er det viktig å vurdere miljømessige konsekvenser av marinfisk-produksjon, blant annet risiko for både sykdomsspredning og genetisk påvirkning til ville bestander. Er det for eksempel lurt å ha torskeoppdrett i nærheten av viktige gyteområder? Havforskningsinstituttet har frarådet oppdrett av torsk i Lofoten og Vesterålen. Fra et sykdomsperspektiv er det viktig å ha kunnskap om risiko for overføring av sykdom mellom villfisk og oppdrettsfisk (og vice versa) før en bygger opp en storskala produksjon av marine arter. 16

17 Avslutningsvis bør det nevnes at sykdommen som omtales som følge av nodavirus har det offisielle navnet viral encephalopati og retinopati (VER), som henspiller på typisk patologi som observeres ved sykdomsutbrudd. I tillegg omtales sykdommen som viral nervøs nekrose og viral nervevesnekrose (VNN). På bakgrunn av kunnskapen om viruset, arbeider forskningsmiljøene for å unngå at sykdommen skal bli en reell trussel. Det er da opp til forvaltningen og næringen selv å bruke ny kunnskap til å gjøre marinfisken frisk for fremtiden og fit for fight. Da kan vi leve med viruset og unngå sykdommen. Referanser Arimoto M, Sato J, Maruyama K, Mimura G, Furusawa I (1996) Effect of chemical and physical treatments on the inactivation of striped jack nervous necrosis virus (SJNNV). Aquaculture 143: Aspehaug V, Devold M, Nylund A (1999) The phylogenetic relationship of nervous necrosis virus from halibut (Hippoglossus Hippoglossus). Bulletin of The European Association of Fish Pathologists 19: Bovo G, Nishizawa T, Maltese C, Borghesan F, Mulinelli F, Montesi F, De Mas S (1999) Viral encephalopathy and retinopathy of framed marine fish species in Italy. Virus Research 63: Frerichs GN, Tweedie A, Starkey WG, Richards RH (2000) Temperature, ph and electrolyte sensitivity, and heat, UV and disinfectant inactivation of sea bass (Dicentrarchus labrax) neuropathy nodavirus. Aquaculture 185: Grotmol S, Totland GK, Kryvi H (1997) Detection of nodavirus-like agent in heart tissue from reared Atlantic salmon Salmo salar suffering from cardiac myopathy syndrome (CMS). Diseases of Aquatic Organisms 29: Grotmol S, Totland GK (2000) Surface disinfection of Atlantic halibut Hippoglossus hippoglossus eggs with ozonated sea-water inactivates nodavirus and increases survival of the larvae. Diseases of Aquatic Organisms 39: Husgard S, Grotmol S, Hjeltnes BK, Rødseth OM, Biering E (2001) Immune response to a recombinant capsid protein of striped jack nervous necrosis virus (SJNNV) in turbot Scophthalmus maximus and Atlantic halibut Hippoglossus hippoglossus, and evaluation of a vaccine against SJNNV. Diseases of Aquatic Organisms 45: Johnson SC, Sperker SA, Leggiadro CT, Groman DB, Griffiths SG, Ritchie RJ, Cook MD, Cusack RR (2002) Identification and characterization of a piscine neuropathy and nodavirus from juvenile Atlantic cod from the Atlantic coast of North America. Journal of Aquatic Animal Health 14: Korsnes K, Devold M, Nerland AH, Nylund A (2005a) Nodavirus hos marin fisk og laks. Fiskehelse 7(1): Korsnes K, Devold M, Nerland AH, Nylund A (2005b) Viral encephalopathy and retinopathy in Atlantic salmon Salmo salar after intraperitoneal challenge with a nodavirus from Atlantic halibut Hippoglossus hippoglossus. Diseases of Aquatic Organisms 68:7-15. Le Breton A, Grisez L, Sweetman J, Ollivier F (1997) Viral nervous necrosis (VNN) associated with mass mortalities in caged-reared sea bass Dicentrarchus labrax L. Journal of Fish Diseases 20: Le Breton AD (1999) Mediterranean finfish pathology: present status and new developments in prophylactic methods. Bulletin of The European Association of Fish Pathologists 19: Liltved H, Vogelsang C, Modahl I, Dannevig BH (2006) High resistance of fish pathogenic viruses to UV irradiation and ozonated seawater. Aquaculture Engineering 34: Munday BL, Kwang J, Moody N (2002) Betanodavirus infection of teleost fish: a review. Journal of Fish Diseases 25: Nilsen F, Nylund A (1998) Identification of viruses and parasites. Methodology in Fish Diseases Research (Barnes AC, Davidson GA, Hiney MP, McIntosh D, red.) pp Aberdeen, Fisheries Research Services. Nylund A, Karlsbakk E, Andersen L, Nylund S, Isaksen T, Ottem KF, Handeland S (2006) Nodavirus er vanlig hos marine fisk. Norsk Fiskeoppdrett 31(10): Patel S, Sindre H, Korsnes K, Pedersen J, Bergh Ø, Hellberg H, Nerland AH (2006) Nodavirus i norsk torskeoppdrett. Norsk Fiskeoppdrett 31(9): Scullion FT, Scullion MG, Sparrow D, Rodger HD, Shehan BJ (1996) Encephalitis and mass mortality of farmed salmon smolts in an isolated sea bay in Ireland. Veterinary Record 138: Sommerset I, Lorenzen E, Lorenzen N, Bleie H, Nerland AH (2003) A DNA vaccine directed against a rainbow trout rhabdovirus induces early protection against a nodavirus challenge in turbot. Vaccine 21: Starkey WG, Ireland JH, Muir KF, Jenkins ME, Roy WJ, Richards RH, Ferguson HW (2001) Nodavirus infection in Atlantic cod and Dover sole in the UK. Veterinary Record 149:

18 18 FISKEHELSE - 8. årgang nr. 1, 2006

19 Nye isolater av Vibrio anguillarum isolert fra Atlantisk torsk (Gadus morhua L.); Karakterisering og effekt av vaksinering. Lene-Catrin Martinsen Norges Fiskerihøgskole/Universitetet i Tromsø, 9037 Tromsø e-post: catrinlene@hotmail.com Sammendrag Artikkelen er basert på en masteroppgave utført ved Institutt for marin biokjemi (IMAB) ved Norges fiskerihøgskole, Universitetet i Tromsø og Fiskeriforskning i Tromsø (Martinsen et al. 2005; Martinsen 2006). Til tross for at atlantisk torsk i oppdrett, Gadus morhua L., vaksineres mot klassisk vibriose, er sykdommen fortsatt et problem. Dette antas å være mye av grunnen til økt forbruk av antibiotika i norsk oppdrett de siste årene. I dette studiet ble Vibrio. anguillarum isolert fra vaksinert og uvaksinert torsk i undersøkt med hensyn på biokjemiske, serologiske og genetiske egenskaper, og resultatene viser at en gruppe isolater skiller seg ut fra typiske isolater av Vibrio anguillarum. Disse isolatene fermenterte ikke sorbitol, i tillegg var de enten positiv for uttrykk av lysin dekarboksylase eller negative for produksjon av gelatinase. De samme isolatene hadde serologiske likhetstrekk med serotype O2a, men viste avvikende reaksjon med monoklonale antistoffer og forskjellig LPS-mønster sammenlignet med typiske isolater av serotype O2a. Ved genetiske studier basert på Amplified Fragment Length Polymorphism (AFLP) samlet de avvikende isolatene seg i en klynge separat fra øvrige V. anguillarum serotype O2a- og O2b. Resultatene indikerer at disse isolatene tilhører en tredje undergruppe av serotype O2. Vaksinering med ALPHA MARINE Vibrio gav god beskyttelse mot badsmitte med isolater av V. anguillarum O2a og O2b (RPS > 80), inkludert et isolat homologt med en av vaksinestammene. Derimot hadde vaksinen lav (RPS på 32) eller ingen beskyttende effekt ved smitte med to atypiske V. anguillarum stammer isolert fra syk, vaksinert torsk. Innledning Klassisk vibriose er en verdensomspennende sykdom registrert på svært mange marine arter både i oppdrett og i ville bestander. Sykdommen forårsakes av bakterien Vibrio anguillarum, en meget heterogen bakteriegruppe, og manifesterer seg som en hemorragisk septikemi (Larsen og Pedersen 1999). 23 serotyper av bakterien er beskrevet, men det er i all hovedsak O1, O2 og O3 som er patogene for fisk. (Larsen et al. 1994; Pedersen et al. 1999; oppsummert av Toranzo et al. 2005). Serotype O1 og O2 er vidt utbredt og har et bredt vertsregister. O1 forekommer hyppigst hos laksefisk, mens O2 affiserer både laksefisk og marine arter. Serotype O3 er noe mindre utbredt, og forekommer hovedsakelig hos ål (Anguilla anguilla) og ayu (Plecoglossus altivelis) (Larsen og Pedersen 1999; oppsummert av Toranzo et al. 2005). Til nå er to undergrupper av serotype O2 beskrevet, O2a og O2b, basert på ulike epitoper i bakteriens lipopolysakkarid (LPS). O2a isoleres både fra laksefisk og marin fisk, mens O2b primært isoleres fra marin fisk som torsk. (Rasmussen 1987b, 1987a; Bolinches et al. 1990; Knappskog et al. 1993). De spesifikke forskjellene mellom O2a og O2b er vist å være strukturforskjeller i lipopolysakkaridets O- kjede. Ulike studier har antydet eksistensen av en tredje undergruppe av serotype O2 (Knappskog et al. 1993; Tiainen et al. 1997a), men så langt foreligger ikke studier som beviser dette. Forskjeller mellom serotype O2a og O2b har også vært vist på gennivå illustrert ved DNA fingerprint (Espelid et al. 1991), mens disse ikke kunne skilles fra hverandre ved hjelp av ribotyping (Austin et al. 1995). V. anguillarum som art er svært heterogen, og et studie utført med PFGE (puls field gel electrophoresis) har vist at isolater av serotype O2a er mer heterogen enn isolater av serotype O2b (Colquhoun et al. 2005). Det er allikevel ikke beskrevet variasjoner i biokjemiske egenskaper som kan tilskrives de ulike undergruppene av serotype O2 (Myhr et al. 1991; Knappskog et al. 1993; Austin et al. 1995). Vaksinering mot klassisk vibriose ble tatt i bruk i Norge i 1977, og torsk ble tidligere vaksinert med en vannbasert vaksine utviklet for ørret (Lillehaug et al. 1999). En vaksine basert på V. anguillarum bakteriner har gitt god beskyttelse mot homolog stamme (Mikkelsen et al. 2004). Utfordringen er å produsere en vaksine som beskytter mot alle varianter av V. anguillarum som infiserer torsk i norsk oppdrett, og dagens torskevaksine inkluderer serotype O1, O2a og O2b (Pers. med. Kjersti Gravningen). Til tross for at det meste av oppdrettstorsk i Norge i dag er vaksinert mot klassisk vibriose rapporteres det fortsatt om utbrudd, også på vaksinert fisk (Bricknell et al. 2006; Samuelsen et al. 2006). V. anguillarum isolert fra vaksinert og uvaksiner torsk etter utbrudd av klassisk vibriose ble undersøkt med hensyn på biokjemiske, serologiske og genetiske egenskaper for å se etter avvik fra typiske isolater. I tillegg ble den beskyttende effekten av den kommersielle vaksinen for marin fisk, ALPHA MARINE Vibrio, undersøkt ved badsmitte med ulike V. anguillarum isolert fra vaksinert torsk etter utbrudd av klassisk vibriose. Resultatene viste at en gruppe nye isolater (fra 2003 og 2004) skilte seg ut fra typiske serotype O2 isolater av V. anguillarum. 19

20 Tabell 1: Utvalgte API-20E -tester for Vibrio anguillarum O2 isolater med avvik fra referansen. (Kent 1982; Holt et al. 1994; Alsina og Blanch 1994a). Va-1245a er tatt med som intern kontroll. (+) positiv test, (-) negativ test, gult markerer avvik. De øvrige resultatene var i samsvar med resten av V. anguillarum isolatene, i henhold til referansen (resultater ikke vist). Isolat referanse Va-1245a Va-4299 Va-11 Va-4a Va-7a Va-8a Va-9a Va-10 Status Test torsk Ukjent Uvaksinert uvaksinert Ukjent Ukjent ukjent vaksinert vaksinert Indol Sorbitol Gelatinase Arginin Lysin Ornitin Mannitol Voges-Proskauer Biokjemiske egenskaper Biokjemisk karakterisering av en gruppe Vibrio isolater ble utført med API 20E, som består av 23 standardiserte tester. Metoden er opprinnelig utviklet for karakterisering av enteriske gram negative bakterier, men er etter hvert tilpasset identifisering av Vibrio-arter (Kent 1982; MacDonell et al. 1982; Grisez et al. 1991; Alsina og Blanch 1994a,b). Resultatene ble sammenlignet med referanser fra flere uavhengige kilder (Kent 1982; Holt et al. 1994; Alsina og Blanch 1994a), og 5 av 11 V. anguillarum isolater reagerte forskjellig fra referansen. Forskjellene bestod i negativ test for fermentering av sorbitol (SOR) i tillegg til negativ test for produksjon av gelatinase (GEL) eller positiv test for uttrykk av lysin dekarboksylase (LCD) (tabell 1). På de øvrige testene reagerte disse isolatene som de øvrige isolatene av V. anguillarum i henhold til referansen, med to unntak: alle testet negativt for citrat (ikke vist), og Va- 4299b og Va-11 (definert som O2b, under) testet negativt for indol (tabell 1). ALO-testen (Arginin dihydrolase, Lysin dekarboksylase og Ornithin dekarboksylase) definerer V. anguillarum som ALO + (Alsina og Blanch 1994a, 1994b). Isolatene som var positive for LCD er imidlertid ALO ++, i likhet med V. anguillarum lignende stammer eller andre medlemmer av Vibrionaceae. Fermentering av sorbitol og produksjon av gelatinase er også viktige karakteristiske egenskaper for V. anguillarum (Austin et al. 1995). V. ordalii er nært beslektet med V. anguillarum, og forårsaker vibriose på fisk i Nord-Amerika, Japan, Australia (Oppsummert av Toranzo et al. 2005) og Chile (Colquhoun et al. 2004), og er nylig isolert fra torskeyngel i Norge (Hellberg og Colquhoun 2006). Denne arten er i likhet med de atypiske isolatene negativ for fermentering av sorbitol, men er i samsvar med typiske V. anguillarum definert som lysin dekarboksylase negativ og gelatinase positiv. V. ordalii kan imidlertid skilles fra V. anguillarum ved at den er ALO, negativ for indol, acetonin (VP) og mannitol (Schiewe et al. 1981), noe som tilsier at de atypiske isolatene mest sannsynlig tilhører V. anguillarum. Tabell 2: Tabellen viser et utvalg av V. anguillarum isolatene som ble testet ved hjelp av ELISA og immunoblot med polyklonale kaninantisera (kanin-α-) og monoklonale antistoffer (mab ) der mab-i reagerer med serotype O2b og mab-ii mot serotype O2a og O2b. I ELISA med pab ble sterk reaksjon satt som (+) og svak eller ingen reaksjon som (-). Immunoblot ble utført med kanin-α-o2a, mab-i og mab-ii. Serotype ble bestemt ved sammenligning av testene. Isolat Kanin-α- O2a Kanin-α- O2b ELISA Immunoblot Serotype mab-i mab-ii Kanin-α- O2a mab-i mab-ii Serotype Va-1245a + - O2a - + ND ND ND O2a Va-5a + - O2a O2a Va-6a + - O2a O2a Va-10a + - O2a O2* Va O2a O2* Va-4a + - O2a O2* Va O2a O2* Va O2a O2* Va O2b O2b Va-4299b - + O2b O2b NCIMB 2129-O1 - (+) ND ND ND O1 1 1 V. anguillarum serotype O1 referansestamme *Isolatene ble serotypet til O2a med kaninantisera, men reagerte ikke med mab-ii. De betegnes videre som atypiske serotype O2, og er markert i tabellen med rød ramme. ND: ikke testet 20