formeringsevne fosterutvikling formeringsevne fosterutvikling MEN; Kjønnsmodning Kjønnscelle produksjon

Transkript

1 Regulatorisk toksikologi BIO 4530 Metoder Reproduksjonstoksikologi Christine Bjørge/Richard Wiger Avdeling for kjemikalietoksikologi Nasjonalt folkehelseinstitutt 28 April 2005 Dagens tema Reproduksjons syklusen Hva indikerer svekket formeringsevne? Hva indikere svekket fosterutvikling? Testmetoder for å undersøke formeringsevne Testmetoder for å undersøke fosterutvikling Hva kreves av tester for reproduksjon i Risikovurderinger i EU? Røyking og reproduksjon hos mennesker BIO 4530, 28 April BIO 4530, 28 April Reproduksjon Viktig for opprettholdelse av arten Genetisk mangfold MEN; Det er en kompleks prosess som er svært følsom for blant annet; miljøfaktorer (høyde, kultur-press) eksponering for kjemikalier Center for the Evaluation of Risk to Human Reproduction BIO 4530, 28 April BIO 4530, 28 April Viktige endepunkter i Reproduksjons-syklusen - 1 Kjønnsmodning Kjønnscelle produksjon postnatal produksjon hos hanner produksjon hos hunner i fosterlivet (in utero) Befruktning og tidlig embryo-utvikling Zygote transport fra eggleder til livmor BIO 4530, 28 April BIO 4530, 28 April

2 Viktige endepunkter i Reproduksjons-syklusen - 2 Implantasjon (R 5-6 d, H 6-8 d (90%)) utvikling av placenta, overlevelse av blastocyst Embryo utvikling (R 6-15 d, H d) overlevelse av embryo vekst og differensiering, organ utvikling Foster utvikling (R 15/16 d, H 56 d frem til fødsel) overlevelse av foster vekst og differensiering, funksjon av organer Fødsel (R d, H 270 d) lengde, amming BIO 4530, 28 April Viktige endepunkter i Reproduksjons-syklusen - 3 Post-natal utvikling (før og etter pubertet) overlevelse fødselsvekt og vekst organ- hormon- immun- CNS- perifert NSfunksjon anogenitalavstand utvikling (tid til vaginal åpning, preputial separasjon indikerer kjønnsmodning) nedfall av testis, hypospadier, sperm produksjon BIO 4530, 28 April BIO 4530, 28 April BIO 4530, 28 April Svekket formeringsevne hos hanner/hunner Redusert antall befruktninger og levende avkom forstyrrelser før implantasjonen av foster i livmor *skader på reproduksjonsorgan *effekter på sperm/egg *hormonelle forandringer *parring, befruktning *implantasjon av foster i livmoren BIO 4530, 28 April Svekket fosterutvikling Ikke-arvelige skader i fosterutviklingen opp til pubertet (utviklingsskader - misdannelser) kan skje under embryonal/føtal utvikling (etter implantasjonen) kan skje mellom fødsel og avvenning BIO 4530, 28 April

3 14 uker BIO 4530, 28 April BIO 4530, 28 April Fertilitet BIO 4530, 28 April BIO 4530, 28 April Risikovurderinger i EU - 1 Identifisere kjemikaliets uheldige helse effekter (akutt, irritasjon, sensibilisering, gjentatt eksponering, mutagenitet, kreft) Reproduksjons toksisitet formeringsevne / effekter på reproduksjonsorganer, kjønnsceller, hormonbalansen (voksne individer) utviklingsskader / misdannelser (fra befruktede egg til kjønnsmodne individer) Risikovurderinger i EU - 2 Fastsette NOAEL / LOAEL verdier Human eksponering arbeidere forbrukere (nyfødte, barn, gamle) indirekte via miljøet Iverksette tiltak for å redusere risiko BIO 4530, 28 April BIO 4530, 28 April

4 Testmetoder - 1 Reproduksjontoksiske tester er mangfoldige: Fra standardiserte testmetoder iht. internasjonale aksepterte OECD retningslinjer til mer spesialisert studie design, eksponering i følsomme vinduer (hormonhermere), studere mekanismer... Data fra begge typer testmetoder blir benyttet i risiko vurderinger BIO 4530, 28 April Test-metoder - 2 OECD Guideline Metoder for å studere effekter på formering og/eller reproduksjonsorganer en- og togenerasjons studier (OECD TG 415, 416) 28 eller 90 dager gjentatt eksponering studier (OECD TG 407 eller 408) Screening studier (OECD TG 421 eller 422) BIO 4530, 28 April Test Generation studies Prenatal Developmental Toxicity Study (Teratology study) Developmental Neurotoxicity Study (Behavioural teratology studies) Reproduction/ Developmental toxicity screening test Exposure period Continuously over one, two or several generations Usually during organogenesis Proposal: from implantation to the day before birth During pregnancy and lactation At least 3 dose levels from 2 weeks prior to mating until day 4 postnatally Table 4.2 Overview of in vivo tests for reproductive toxicity testing. Endpoints in offspring Guideline(s) Growth, development and viability Histopathology of sex organs, brain and target organs Fertility Proposal: oestrous cyclicity and sperm quality Resorptions Foetal growth Morphological variations and malformations. Birth and pregnancy length Physical and functional maturation Behavioural changes due to CNS and PNS effects Brain weights and neuropathology Fertility Pregnancy length and birth Foetal and pup growth and survival until day 3 OECD TG 415 Onegeneration Study OECD TG 416 Twogeneration Study OECD TG 414 OECD TG 426 Developmental Neurotoxicity Study (draft 1999) OECD TG 421 and 422 BIO 4530, 28 April OECD 415 En-generasjons studie Gir info om effekter på reproduksjon gjennom en generasjon (range-finding test for 2-gen. studie). Mange av de samme endepunktene som studeres in 2-generasjons studiet blir vurdert. Eksponeringen hos hanner: spermatogenesen pluss transittid i bitestikkel (epididymis), (56 dager i mus og 70 dager i rotte), deretter under parring Eksponering hos hunner: To østrus sykluser (2 uker), under parring, i drektighets- og i die perioden til postnatal dag 21 BIO 4530, 28 April Modified from Hass et al. (1994). OECD To-generasjons studie Dekker hele reproduksjonssyklusen: spermatogenesen, østrus syklus, parring, befruktning, drektighetsperioden, fødsel, dieperioden, pubertet, vekst og utvikling i to generasjoner Eksponering in utero og postnatalt Gir info ang. effekter på fertilitet og effekter på reproduksjonsorganer i 2 (3) generasjoner, og på fosterutvikling BIO 4530, 28 April Systemisk toksisitet? OECD To-generasjonsstudie NOAEL/LOAEL verdier for bruk i risikovurderinger Ulempe -lav følsomhet; Redusere kullene (4/kjønn) postnatal dag 4 Etter pubertet går videre med 1/kjønn for å danne neste generasjon BIO 4530, 28 April

5 OECD revidert Følsomme endepunkter er inkludert, spesielt utvikling/differensiering av repro. systemet: *anogenitalavstand *brystvorter(nipples) hos handyr *vaginal åpning hos hundyr *preputial separasjon *hypospadias *kvalitativ og kvantitativ vurdering av sæd Skal disse danne grunnlag for NOAEL verdier til bruk i risikovurderinger? Sædkvalitet BIO 4530, 28 April BIO 4530, 28 April OECD TG 407: 28 dager gjentatt eksponering OECD TG 408: 90 dager gjentatt eksponerng Gir tilleggs informasjon om effekter på reproduksjons organer/tyroidea (kjønnshormon nivåer, vekt/histopatologi kjønnsorganer) OECD 407 revideres for hormonhermere Ulemper; 28 dagers studiet varer ikke en hele spermatogenesen (48/34 dager rotte/mus) Bruker eldre dyr, ofte er unge dyr mer følsomme (hormonhermere) BIO 4530, 28 April Reproduction/developmental toxicity screening test, OECD TG 421/422 Gir begrenset preliminær info, er ikke noe alternativ til OECD 414, 415 eller 416 indikerer befruktningsevne (effekter på reproorganer) utvikling av embryo/foster. eksponering: 2 uker før parring, hanner 2 uker etter parring, hunner som drektige og til postnatal dag 4. lavt antall dyr (10)/dose gruppe - statistikk? få endepunkter undersøkes BIO 4530, 28 April Test-metoder - 1 OECD Guideline Metoder for å studerer effekter på fosterutvikling (utviklingsskader - misdannelser) Fosterutviklingsstudier (OECD TG 414 og 426?) Screening studier (OECD TG 421 og 422) BIO 4530, 28 April OECD TG 414 Prenatal Developmental Toxicity Study Gir informasjon om hvilke effekter pre-natal eksponering har på fosteret og på moren. Eksponering (20/gruppe, 3 doser/oralt) er vanligvis fra graviditetsdag 6 til 15, men kan utvides fra befruktning til en dag før fødsel Finner NOAEL/LOAEL for effekter på moren og på fosteret BIO 4530, 28 April

6 Forts. OECD TG 414 Moren undersøkes for: mortalitet, kliniske forandringer, vekt, matinntak, og annen åpenbar toksisitet Livmoren/eggstokk undersøkes for: vekt, gulelegemer, implantasjoner, antall resorpsjoner, embryo/føtal død Fosteret undersøkes for: antall, kjønn, vekt, eksterne-, interne- og skjellet forandringer Forts. OECD 414 Et kjemikalie blir betraktet som toksisk for fosteret når det gir embryo/føtale effekter i fravær av tydelig maternell toksisitet i studier utført etter aksepterte retningslinjer (OECD Guidelines) Høyeste dose (av 3 doser) skal gi maternell toksisitet BIO 4530, 28 April BIO 4530, 28 April Draft OECD TG 426 Developmental Neurotoxicity Study Undersøker for funksjonelle og/eller morfologiske forandringer i nervesystemet hos avkommet som skyldes eksponering av moren under drektighet- og die perioden, dvs lenger eksponering og lenger oppfølgingsperiode enn OECD TG 414 Brukes som en tilleggstest når det er mistanke om effekter på nervesystemet BIO 4530, 28 April Maternell toksisitet - 1 Er effekter på foster en primær effekt av kjemikaliet? Er effekter på foster en sekundær effekt som skyldes at kjemikaliet er toksisk for moren? Viktig ved klassifisering av kjemikalier som skadelige for fosterutvikling BIO 4530, 28 April Maternell toksisitet - 2 Er toksisitet hos moren tilstede ved samme doser som er toksisk for avkommet? Hva er den maternell toksisiteten? Redusert vekt (10%)? Redusert matinntak (10 %)? Er effekter funnet i samme dosering (mor/ avkom)? Studere individuelle data BIO 4530, 28 April Maternell toksisitet - 3 Dose-respons; fosterdød ved høye doser kan gjemme en annen effekt hos fosteret Hvordan fosteret er plassert i livmoren, ved siden av hanner eller hunner (hormonhermere)? Statistisk signifikant, ikke alltid relevant (ved sjeldne effekter) vurdere effekter på kullnivå vurderes case by case BIO 4530, 28 April

7 EU sin testing strategi for Reprotoks i henhold til White Paper 1-10 tonn/år in vitro studier (stem cell, whole embryo culture, micromass assay) tonn/år Screening studier OECD TG 421, tonn/år to-generasjons studie OECD 416 developmental toxicity study OECD 414 White paper Ny kjemikalie politikk i EU innen fordi: Dagens system gikk for tregt til å fremskaffe data og vurdere risiko Nye og eksisterende kjemikalier reguleres under felles system: REACH Registration Evaluation Authorisation Chemicals Begrense og erstatte bruk av farlige kjemikalier (POPs og CMR kjemikalier,eds?) Benytte føre var prinsippet og substitusjon Skreddersy testprogram for hvert kjemikalie BIO 4530, 28 April BIO 4530, 28 April Oppsummering Metoder Reproduksjonstoksikologi fertilitet og/eller reproduksjonsorganer fosterutvikling Basert på data ved bruk av internasjonale aksepterte retningslinjer (OECD) Fastsetter NOAEL/LOAEL verdier for bruk i Risiko karakterisering *Hva er kritisk effekt? *Er effekten primær eller sekundær til maternell toksisitet? BIO 4530, 28 April Praktisk Repro-toks: Røykingogreproduksjon Cigarette smoking can affect women s fertility; men s fertility; sexual function in men; pregnant women's health; the health of an unborn child; and the health of young children. Most of the information below is sourced from the British Medical Association report: Smoking and Reproductive Life: velife BIO 4530, 28 April Røyking: Epidemiologisk data - menn For couples receiving ICSI, 38 percent of the women with non-smoking partners became pregnant compared to 22 percent of the women with smoking partners. For the IVF group, only 18 percent of the women with smokers became pregnant versus 32 percent of the women with non-smokers (Zitzmann M et al 2003). Furthermore, the fertilization rate of oocytes in IVF was influenced by female smoking (59.5% in smokers vs. 69.3% in nonsmokers) BIO 4530, 28 April BIO 4530, 28 April

8 FIGURE 1. Unless otherwise stated, results are given as mean ± SD. Levels of statistical significance are given as asterisks (*,**,***) representing P values of <.05, <.01, and <.001, respectively. Percentage of clinical pregnancies in ICSI and IVF cycles comparing smoking with nonsmoking male partners and analyzing the first treatment cycles only. *P<.05; **P<.01 ( 2 test). Filled bars = male smokers; open bars = male nonsmokers.zitzmann. Male smokers and ICSI. Fertil Steril BIO 4530, 28 April Figure 2. Immunoperoxidase staining for BPDE-DNA adducts in the spermatozoa of smokers and nonsmokers. Bar, 7 m. S 1, S 2 = smokers; N 1, N 2 = nonsmokers; C = controls. (Zenzes MT et la. 1999) Figure 1. Immunostaining in embryos according to parental smoking. (A) Both parents smoke; (B) only father smokes; (C) neither parent smokes; (D) negative control. Bar = 30 µm. The separated blastomeres of (A) and the overlapping blastomeres of (D) are artefacts following removal of the zona pellucida. (Zenzes MT et al. 1999) BIO 4530, 28 April Røyking: Epidemiologisk data - kvinner Røykende kvinner tar lengre tid for å bli gravid. R-kvinner (5-9 sigaretter/dag) var 1,8 ganger mer sannsynlig å vente > 1 år enn ikke-røykere Tidligere menopause hos røykende kvinner. In the ovary, PAH exposure is known to cause destruction of oocytes within immature follicles, implying that one function of the AhR is to mediate cell death signaling in the female germ line (Matikainen T 2001) DNA skader/reparasjon i hannlige kjønnsceller hos rotter og menn Nucleotide excision repair (NER) fjerner DNA-addukter som forvrenge DNA-strukturen. Våre forskningsresultater viser at NER fungerer dårlig i hannlige kjønnsceller hos både rotter og mennesker Den vanligste type oksidativ-skade på sædcelle DNA (8-0xoG) fjernes bra hos rotter men dårlig hos menn. Røyking påfører DNA både PAH-addukter (fjernes av NER) og 8-OxoG skader. Konklusjon: Menn er dårlig utstyrt til å fjerne disse typer DNA skader BIO 4530, 28 April BIO 4530, 28 April sigaretter/dag koster kroner årlig. Dette tilsvarer 1-2 uker på en tropisk øy for 2 personer! BIO 4530, 28 April