(12) Oversettelse av europeisk patentskrift

Transkript

1 (12) Oversettelse av europeisk patentskrift (11) NO/EP B1 (19) NO NORGE (1) Int Cl. C12N 1/82 ( ) C12N 9/00 ( ) Patentstyret (21) Oversettelse publisert (80) Dato for Den Europeiske Patentmyndighets publisering av det meddelte patentet (86) Europeisk søknadsnr (86) Europeisk innleveringsdag (87) Den europeiske søknadens Publiseringsdato (30) Prioritet , EP, (84) Utpekte stater AT BE BG CH CY CZ DE DK EE ES FI FR GB GR HR HU IE IS IT LI LT LU LV MC MK MT NL NO PL PT RO SE SI SK SM TR (73) Innehaver BASF Plant Science GmbH, Carl-Bosch-Strasse 38, 6706 Ludwigshafen, DE- Tyskland Bioriginal Food & Science Corporation, 102 Melville Street, Saskatoon, Saskatchewan S7J OR1, CA-Canada (72) Oppfinner BAUER, Joerg, Maxburgstrasse 6, Limburgerhof, DE-Tyskland SENGER, Toralf, Grundelbachstrasse 112b, Weinheim, DE-Tyskland ZANK, Thorsten, Seckenheimer Strasse 4-6, 6816 Mannheim, DE-Tyskland QIU, Xiao, 403 Kendardine Rd., SaskatoonSaskatchewan S7N 3S, CA-Canada WU, Guohai, 2103 Kendardine Road, SaskatoonSaskatchewan S7N 4A9, CA- Canada (74) Fullmektig Bryn Aarflot AS, Postboks 449 Sentrum, 0104 OSLO, Norge (4) Benevnelse Nukleinsyrer som koder for desaturaser og modifisert planteolje (6) Anførte publikasjoner WO-A1-94/111 WO-A2-2004/ WO-A2-200/ WO-A2-2009/ US-A DATABASE NUCLEOTIDE 30 May 2008 ( ), XP retrieved from NCBI Database accession no. XM_ DATABASE UniProt June 2006 ( ), XP retrieved from EBI Database accession no. Q0V3E3

2 NO/EP Den foreliggende oppfinnelse vedrører nukleinsyrer avledet fra Drechslera triticirepentis, Cylindorcarpon herteronema, Diploida natalensis, Microdochium nivalae, Periplaneta americana og Stagonospora nodorum. Oppfinnelsen vedrører også de individuelle kodesekvenser, og vedrører proteiner som kodet for av disse sekvenser i kombinasjon med andre sekvenser, så vel som en fremgangsmåte for å omdanne oleinsyre til linolsyre til linolsyre og fremstillingen av arakidonsyre, eikosapentaensyre og/eller dokosaheksaensyre. Fettsyrer og triacylglyserider har en rekke anvendelser innen matindustrien, i 10 dyrekosthold, innen kosmetikk og innen den farmakologiske sektor. Avhengig av om de er frie mettede eller umettede fettsyrer, eller triacylglyserider med et økt innhold av mettede eller umettede fettsyrer, er de egnet for svært forskjellige anvendelser. Polyumettede fettsyrer, slik som linolsyre og linolensyre, er essensielle for pattedyr, da de ikke kan produseres av sistnevnte. Polyumettede 3 fetsyrer og 6 fettsyrer er 1 derfor en viktig bestanddel i ernæring for dyr og mennesker. I det etterfølgende er polyumettede fettsyrer omtalt som PUFA, PUFA er, LCPUFA eller LCPUFA er (polyumettede fettsyrer, PUFA, langkjede polyumettede fettsyrer, LCPUFA). 20 De forskjellige fettsyrer og triglyserider oppnås hovedsakelig fra mikroorganismer, slik som Mortierella og Schizochytrium, eller fra oljeproduserende planter, slik som soyabønne, raps, alger slik som Crypthecodinium eller Phaeodactylum og andre, hvor de som en regel er oppnådd i form av deres triacylglyserider (= triglyserider = triglyseroler). De kan imidlertid også oppnås fra dyr, slik som f.eks. fisk. De frie 2 fettsyrene fremstilles fordelaktig ved hydrolyse. Svært langkjede polyumettede fettsyrer slik som dokosaheksaensyre (= DHA, C22:6 4,7,10,13,16,19), eikosapentaensyre (= EPA, C20:,8,11,14,17), arakidonsyre (= ARA, C20:4,8,11,14), dihomo- -linolensyre (C20:3 8,11,14) eller dokosapentaensyre (DPA, C22: 7,10,13,16,19) syntetiseres ikke i oljeavlinger, slik som raps, soyabønne, solsikke eller safrantistel. Konvensjonelle 30 naturlige kilder for disse frie fettsyrer er fisk slik som sild, laks, sardin, uer, ål, karpe, ørret, kveite, makrell, gjørs eller tunfisk, eller alger. Avhengig av den tiltenkte anvendelsen, er olje med mettede eller umettede fettsyrer foretrukne. I menneskemat er f.eks. lipider med umettede fettsyrer, særlig 3 polyumettede fettsyrer, foretrukket. De polyumettede 3-fettsyrene sies å ha en positiv effekt på kolesterolnivået i blodet, og således på muligheten av å forhindre hjertesykdom. Risikoen for hjertesykdom, slag eller hypertensjon kan reduseres

3 2 markert ved å tilsette disse 3-fettsyrene til maten. 3-fettsyrene har også en positiv effekt på inflammatoriske, spesifikt på kroniske inflammatoriske prosesser, i forbindelse med immunologiske sykdommer slik som reumatoid artritt. De tilsettes derfor til matvarer, spesifikt til dietetiske matvarer, eller de benyttes i medikamenter. 6-fettsyrer slik som arakidonsyre, har en tilbøyelighet til å ha en negativ virkning på disse lidelsene i sammenheng med disse reumatiske sykdommer på grunn av vårt vanlige kostinntak. 3- og 6-fettsyrer er forløpere av vevshormoner kjent som eikosanoider, slik som 10 1 prostaglandinene, som er avledet fra dihomo- -linolensyre, arakidonsyre og eikosapentaensyre, og av tromboksanene og leukotrienene, som er avledet fra arakidonsyre og eikosapentaensyre. Eikosanoider (kjent som PG 2 -serien) som er dannet fra 6-fettsyrer, fremmer generelt inflammatoriske reaksjoner, mens eikosanoider (kjent som PG 3 -serien) fra 3-fettsyrer har liten eller ingen proinflammatorisk effekt På grunn av de positive egenskapene til de polyumettede fettsyrene, har der tidligere ikke manglet forsøk på å fremstille tilgjengelige gener som er involvert i syntesen av disse fettsyrer eller triglyserider for fremstilling av oljer i forskjellige organismer med et modifisert innhold av umettede fettsyrer. Således beskriver WO 91/13972 og dens US-ekvivalent en 9-desaturase. WO 93/1124 angår en 1-desaturase og WO 94/1116 en 12-desaturase. Ytterligere desaturaser er f.eks. beskrevet i EP-A , WO 94/18337, WO 97/3082, WO 97/21340, WO 9/18222, EP-A , Stukey et al., J. Biol. Chem., 26, 1990: , Wada et al., Nature 347, 1990: eller Huang et al., Lipids 34, 1999: Den biokjemiske karakterisering av de forskjellige desaturasene har imidlertid vært utilstrekkelige til nå da enzymene, som er membranbundne proteiner, gir store problemer når det gjelder deres isolasjon og karakterisering (McKeon et al., Methods in Enzymol. 71, 1981: , Wang et al., Plant Physiol. Biochem., 26, 1988: ). Som en regel er membranbundne desaturaser karakterisert ved at de innføres i en passende organisme, som deretter analyseres for enzymaktivitet ved å analysere utgangsmaterialene og produktene. 6-desaturaser er beskrevet i WO 93/06712, US , US , WO 96/21022, WO 00/217 og WO 99/27111, og søknaden for fremstilling av fettsyrer i transgene organismer er beskrevet i WO 98/46764 og WO 98/4676. I denne forbindelse er ekspresjonen av forskjellige desaturaser og dannelsen av polyumettede fettsyrer også beskrevet og patentsøkt i WO 99/64616 eller WO 98/ Når det gjelder ekspresjons-

4 3 effektiviteten for desaturaser og dens effekt på dannelsen av polyumettede fettsyrer, skal det bemerkes at ekspresjonen av en enkelt desaturase som til nå er beskrevet kun har resultert i lave innhold av umettede fettsyrer/lipider, slik som f.eks. - linolensyre og stearidonsyre. Dessuten ble som regel en blanding av 3- og 6- fettsyrer oppnådd Særlig egnede mikroorganismer for fremstilling av PUFA er er mikroalger, slik som Phaeodactylum tricornutum, Porphiridium-arter, Thraustochytrium-arter, Schizochytrium-arter eller Crypthecodinium-arter, silliater slik som Stylonychia eller Colpidium, sopp slik som Mortierella, Entomophthora eller Mucor og/eller moser slik som Physcomitrella, Ceratodon og Marchantia (R. Vazhappilly & F. Chen (1998) Botanica Marina 41: 3-8; K. Totani & K. Oba (1987) Lipids 22: ; M. Akimoto et al. (1998) Appl. Biochemistry and Biotechnology 73: ). Stammeseleksjon har resultert i utviklingen av en rekke mutante stammer av de aktuelle mikroorganismene som produserer en rekke ønskelige forbindelser som inkluderer PUFA er. Mutasjon og seleksjon av stammer med en forbedret produksjon av et spesielt molekyl, slik som de polyumettede fettsyrene, er imidlertid en tidkrevende og vanskelig prosess. Dette er hvorfor rekombinante metoder som beskrevet ovenfor er foretrukne når det er mulig En rekke syntesespor er blitt diskutert for syntesen av arakidonsyre, eikosapentaensyre (EPA) og dokosaheksaensyre (DHA) (figur 1). Således fremstilles EPA og DHA i marine bakterier slik som Vibrio sp. eller Shewanella sp. via polyketidsporet (Yu, R. et al. Lipids 3: , 2000; Takeyama, H. et al. Microbiology 143: , 1997) En alternativ strategi er den alternerende aktiviteten til desaturaser og elongaser (Zank, T.K. et al. Plant Journal 31: 2-268, 2002; Sakuradani, E. et al. Gene 238: 44-43, 1999). En modifikasjon av det ovenfor beskrevne spor ved 6-desaturase, 6-elongase, -desaturase, -elongase og 4-desaturase er Sprecher-sporet (Sprecher 2000, Biochim, Biophys. Acta 1486: ) i pattedyr. I stedet for 4- avmetningen, gjennomføres et ytterligere elongeringstrinn her for å gi C 24, etterfulgt av en ytterligere 6-avmetning, og til slutt β-oksidasjon for å gi C 22 -kjedelengden. Det som således er kjent som Sprecher-spor (se figur 1), er imidlertid ikke egnet for fremstillingen i planter og mikroorganismer, da de regulerende mekanismer ikke er kjent.

5 4 Avhengig av deres avmetningsspor, kan de polyumettede fettsyrene oppdeles i to store klasser, nemlig 6- eller 3-fettsyrer, som avviker med hensyn til deres metabolske og funksjonelle aktiviteter (figur 1). Utgangsmaterialet for det 6-metabolske sporet er fettsyren linolsyre (18:2 9,12 ), mens 3-sporet foregår via linolensyre (18:3 9,12,1 ). Linolensyre er dannet ved aktiviteten til en 3-desaturase (Tocher et al. 1998, Prog. Lipid Res. 37, ; Domergue et al. 2002, Eur. J. Biochem. 269, ) Pattedyr, og således også mennesker, har ingen tilsvarende desaturaseaktivitet ( 12- og 3-desaturase), og må ta opp disse fettsyrer (essensielle fettsyrer) via maten. Ved å starte med disse forløpere, blir de fysiologisk viktige polyumettede fettsyrer arakidonsyre (= ARA, 20:4,8,11,14 ), en 6-fettsyre, og de to 3-fettsyrene eikosapentaensyre (= EPA, 20:,8,11,14,17 ) og dokosaheksaensyre (DHA, 22:6 4,7,10,13,17,19 ) syntetisert via sekvensen av desaturase- og elongasereaksjoner. Anvendelsen av 3-fettsyrer viser den terapeutiske aktivitet som beskrevet over i behandling av kardiovaskulære sykdommer (Shimikawa 2001, World Rev. Nutr. Diet. 88, ), Entzündungen (Calder 2002, Proc. Nutr. Soc. 61, 34-38) og Arthritis (Cleland og James 2000, J. Rheumatol. 27, ) Elongering av fettsyrer ved hjelp av elongaser med 2 eller 4 C-atomer er av avgjørende betydning for fremstilling av henholdsvis C 20 - og C 22 -PUFA er. Denne prosess foregår via 4 trinn. Det første trinnet er kondensasjonen av malonyl-coa med fettsyreacyl-coa ved ketoacyl-coa-syntase (KCS, herunder omtalt som elongase). Dette følges av et reduksjonstrinn (ketoacyl-coa-reduktase, KCR), et dehydratiseringstrinn (dehydratase) og et siste reduksjonstrinn (enoyl-coareduktase). Det er blitt postulert at elongaseaktivitet påvirker spesifisitet og raten til hele prosessen (Millar og Kunst, 1997 Plant Journal 12: ) Det har vært en rekke forsøk tidligere for å oppnå elongasegener. Milar og Kunst, 1997 (Plant Journal 12: ) og Millar et al (Plant Cell 11: ) beskriver karakteriseringen av planteelongaser for syntesen av monoumettede langkjedefettsyrer (C22:1) og for syntesen av fettsyrer med svært lang kjede for dannelsen av vokser i planter (C 28 -C 32 ). Beskrivelser som vedrører syntesen av arakidonsyre og EPA er f.eks. funnet i WO 01/9128, WO 00/12720, WO 02/ og WO 02/ Syntesen av polyumettede C 24 -fettsyrer er f.eks. beskrevet i Tvrdik et al. 2000, JCB 149: eller WO 02/44320.

6 Høyere planter omfatter polyumettede fettsyrer slik som linolsyre (18:2 9,12 ) og 10 1 linolensyre (18:3 9,12,1 ). ARA, EPA og DHA er ikke funnet i det hele tatt i frøoljen til høyere planter, eller kun i svært små mengder (E. Ucciani: Nouveau Dictionnaire des Huilers Végétales [New Dictionary of Vegetable Oils]. Technique & Documentation Lavoisier, 199. ISBN: ). Produksjonen av LCPUFA er i høyere planter, foretrukket i oljeavlinger slik som raps, linfrø, solsikke og soyabønner, vil imidlertid være fordelaktig, da store mengder av høykvalitet LCPUFA er for næringsmiddelindustrien, for dyrefôr og for farmasøytiske formål kan oppnås på økonomisk måte. I denne hensikt er det fordelaktig å innføre, i oljeavlinger, gener som koder for enzymer i LCPUFA-biosyntesen via rekombinante metoder, og å uttrykke dem deri. Disse gener kan fordelaktig isoleres fra mikroorganismer og lavere planter som produserer LCPUFA er, og man kan innlemme dem i membranene eller triacylglyseridene. Det har således allerede vært mulig å isolere 6-desaturasegener fra mosen Physcomitrella patens og 6-elongasegener fra P. patens og fra nematoden C. elegans. 20 De første transgene planter som omfatter å uttrykke gener som koder for LCPUFAbiosynteseenzymer og som, som en konsekvens, produserer LCPUFA er, ble beskrevet for første gang i f.eks. WO 2003/064638, WO 2003/ (fremgangsmåte for fremstilling av polyumettede fettsyrer i planter). Disse planter produserer imidlertid LCPUFA er i mengder som krever ytterligere optimalisering for å prosessere oljene som er tilstede i plantene. Økninger i PUFA-nivåer ble vist i WO 2004/ for soyabønne og i WO 200/ for Brassica juncea. 2 Skjønt bioteknologi gir en attraktiv rute for produksjon av PUFA, mislykkes nåværende teknikker i å tilveiebringe et effektivt middel for storskalaproduksjonen. Følgelig er der et behov for en forbedret og effektiv metode for fremstilling av PUFA, slik som ARA, EPA og DHA. 30 Det underliggende tekniske problem i forbindelse med den foreliggende oppfinnelse vil kunne ses som å tilveiebringe midler og metoder for å oppfylle de ovennevnte behov. Det tekniske problem løses ved utførelsesformene som er kjennetegnet ved kravene og i det etterfølgende. 3 Den foreliggende oppfinnelse omhandler således prinsipielt nukleinsyremolekyler som koder for nye desaturaser fra soppene Drechslera tritici-repentis, Cylindrocarpon

7 6 heteronema, Diplodia natalensis, Microdochium nivalae, Periplaneta americana og Stagonospora nodorum. Spesielt Drechslera tritici-repentis delta 12-desaturasen, Diplodia natalensis delta 12-desaturasen, Microdochium nivalae delta 12-desaturasen, Periplaneta americana delta 12-desaturasen og Stagonospora nodorum delta 12- desaturasen, og videre er Cylindrocarpon heteronema delta 1-desaturasen og Microdochium nivalae d12-saturasen blitt identifisert. Ytterligere bruk av disse nukleinsyrer i fremgangsmåten for fremstilling av høye nivåer av ARA, EPA og DHA er tilveiebrakt Spesifikt angår den foreliggende oppfinnelse et polynukleotid som omfatter en nukleinsyre valgt fra gruppen som består av: a) en nukleinsyre med en nukleinsyresekvens som vist i SEKV. ID nr. 1; b) en nukleinsyre som koder for et polypeptid med en aminosyresekvens som vist i SEKV. ID nr. 2; c) en nukleinsyre som har en nukleinsyresekvens som er minst 9 % identisk med nukleinsyresekvensen som vist i SEKV. ID nr. 1, hvor nevnte nukleinsyre koder for et polypeptid med 12-desaturaseaktivitet; og d) en nukleinsyre som koder for et polypeptid med en aminosyresekvens som er minst 9 % identisk med aminosyresekvensen som vist i SEKV. ID nr. 2, hvor nevnte nukleinsyresekvens koder for et polypeptid med 12-desaturaseaktivitet. 2 Betegnelsen polynukleotid som anvendt her vedrører nukleinsyremolekyler som enten er DNA eller RNA, så vel som kjemisk modifiserte derivater, f.eks. biotinylerte eller metylerte nukleinsyremolekyler. DNA som anvendt heri inkluderer cdna og genomisk DNA. Polynukleotidene kan være i lineær eller sirkulær form, og kan være enkelttrådet eller dobbelttrådet. 30 I overenstemmelse med den foreliggende oppfinnelse har man funnet at polynukleotidene ifølge foreliggende oppfinnelse som omtalt ovenfor, koder for polypeptider med desaturaseaktivitet, dvs. som er desaturaser. 3 Betegnelsen desaturase refererer til en enzymatisk aktivitet som tillater introduksjon av dobbeltbindinger i karbohydrater generelt. Særlig foretrukket i overenstemmelse med den foreliggende oppfinnelse er desaturaser som innfører en dobbeltbinding i stilling 12 eller 1 i en fettsyre. Mer foretrukket er desaturaseaktiviteten som vist til i overenstemmelse med den foreliggende oppfinnelse derfor en delta 12- eller delta 1- desaturaseaktivitet. Mest foretrukket vil delta 12- eller delta 1-desaturasen tillate

8 7 10 omdannelsen av substrater til produkter som vist i de vedlagte figurene nedenfor. Spesifikt vil polynukleotider som omfatter nukleinsyrer med en nukleinsyresekvens som vist i hvilken som helst av SEKV. ID nr. 1,, 7 eller 31, eller varianter derav som spesifisert ovenfor, foretrukket kode for desaturaser som utviser delta 12- desaturaseaktivitet, mens polynukleotider som omfatter nukleinsyrer med en nukleinsyresekvens som vist i SEKV. ID nr. 3 eller 33, eller varianter derav som spesifisert ovenfor, foretrukket koder for desaturase som utviser delta 1- desaturaseaktivitet. Polynukleotider som koder for polypeptidet i henhold til SEKV: ID nr. 36 eller 38, eller de ovennevnte varianter derav, koder for desaturaseenzymer. Et polypeptid som kodes for av et polynukleotid kan testes for desaturaseaktivitet, foretrukket som beskrevet i de vedlagte eksemplene nedenfor Polynukleotidene ifølge den foreliggende oppfinnelse omfatter også variantpolynukleotider av dem omtalt ovenfor ved hjelp av spesifikke nukleinsyre- eller aminosyresekvenser. Nevnte variant-polynukleotider omfatter homologer, foretrukket alleliske varianter, paraloger eller ortologer. Slike polynukleotidvarianter omfatter foretrukket en nukleinsyresekvens som er karakterisert ved at sekvensen kan avledes fra den ovennevnte spesifikke nukleinsyresekvens som vist i SEKV. ID nr. 1, ved minst én nukleotidsubstitusjon, addisjon og/eller delesjon, hvorved variantnukleinsyresekvensen fremdeles skal kode for et polypeptid med en desaturaseaktivitet som spesifisert ovenfor. Varianter omfatter også nukleinsyremolekyler som omfatter en nukleinsyresekvens som er i stand til å hybridisere til de ovennevnte spesifikke nukleinsyresekvenser, foretrukket under stringente hybridiseringsbetingelser. Disse stringente betingelser er kjent for fagmannen, og man kan finne dem i Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N. Y. (1989), Et foretrukket eksempel angående stringente hybridiseringsbetingelser er hybridiseringsbetingelser i 6 x natriumklorid/natriumsitrat (= SSC) ved omtrent 6 o C, foretrukket etterfulgt av ett eller flere vasketrinn i 0,2 x SSC, 0,1 % SDS ved 0 til 6 o C. Den fagkyndige vet at disse hybridiseringsbetingelser avviker avhengig av typen nukleinsyre og, f.eks. når organiske løsningsmidler er tilstede, med hensyn til temperatur og konsentrasjon av bufferen. Under standard hybridiseringsbetingelser vil f.eks. temperaturen avvike, avhengig av typen av nukleinsyre, mellom 42 o C og 8 o C i vandig buffer, med en konsentrasjon på 0,1 til x SSC (ph 7,2). Dersom et organisk løsningsmiddel er tilstede i den ovennevnte buffer, f.eks. 0 % formamid, er temperaturen under standardbetingelser omtrent 42 o C. Hybridiseringsbetingelsene for DNA: DNA-hybrider er foretrukket 0,1 x SSC og 20 o C til 4 o C, foretrukket mellom 30 o C og 4 o C. Hybridiseringsbetingelsene for DNA:RNA-

9 hybrider er foretrukket 0,1 x SC og 30 o C til o C, foretrukket mellom 4 o C og o C. De ovenfor nevnte hybridiseringstemperaturer bestemmes f.eks. for en nukleinsyre med omtrent 100 bp (= basepar) i lengde og med et G + C innhold på 0 % i fravær av formamid. Den fagkyndige vet hvordan man bestemmer hybridiseringsbetingelsene som er nødvendig ved å referere til lærebøker, slik som læreboken nevnt ovenfor, eller de etterfølgende lærebøker: Sambrook et al., Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory, 1989; Hames og Higgins (red.) 198, Nucleic Acids Hybridization: A Practical Approach, IRL Press ved Oxford University Press, Oxford; Brown (red.) 1991, Essential Molecular Biology: A Practical Approach, IRL Press ved Oxford University Press, Oxford. Alternativt kan nukleinsyremolekylvarianter oppnås ved PCRbaserte teknikker slik som blandet oligonukleotidprimerbasert amplifikasjon av DNA, dvs. ved å anvende degenererte primere mot konserverte domener av polypeptidene ifølge den foreliggende oppfinnelse. Konserverte domener av polypeptidet ifølge foreliggende oppfinnelse kan identifiseres ved en sekvenssammenlikning av nukleinsyresekvensen i nukleinsyremolekylet eller aminosyresekvensen til polypeptidet ifølge den foreliggende oppfinnelse, med andre desaturasesekvenser, se også figur 2 nedenfor. Oligonukleotider egnet som PCR-primere så vel som passende PCRbetingelser er beskrevet i de vedlagte eksempler. Som et templat kan DNA eller cdna fra bakterier, sopp, planter eller dyr anvendes. Videre, vil varianter som inkluderer nukleinsyremolekyl som omfatter nukleinsyresekvensene med minst 9 %, minst 96 %, minst 97 %, minst 98 %, minst 99 % identitet med nukleinsyresekvensen som vist i SEKV. ID nr. 1 bibeholde desaturaseaktivitet. Også omfattet er dessuten nukleinsyremolekyl som omfatter nukleinsyresekvenser som koder for aminosyresekvenser som er minst 9 %, minst 96 %, minst 97 %, minst 98 %, minst 99 % identiske med aminosyresekvensen som vist i SEKV. ID nr. 2, hvor polypeptidet som omfatter aminosyresekvensen bibeholder desaturaseaktivitet. Verdier for prosent identitet beregnes foretrukket av hele aminosyre- eller nukleinsyresekvensregionen. En rekke programmer basert på en rekke algoritmer er tilgjengelig for de fagkyndige for å sammenlikne forskjellige sekvenser. I denne forbindelse gir algoritmene til Needleman og Wunsch eller Smith og Waterman særlig pålitelige resultater. For å gjennomføre sekvensoppstillinger, blir programmet PileUp (J. Mol. Evolution., 2, , 1987, Higgins et al., CABIOS, 1989: 11-13) eller programmene Gap og BestFit (Needleman og Wunsch (J. Mol. Biol. 48; (1970)) og Smith og Waterman (Adv. Appl. Math. 2; (1981))), som er en del av GCG softwarepakken [Genetics Computer Group, 7 Science Drive, Madison, Wisconsin, USA 3711 (1991)], anvendt. Sekvensidentitetsverdiene som angitt ovenfor i prosent (%) skal foretrukket bestemmes ved å anvende programmet GAP over hele

10 9 sekvensregionen med de etterfølgende innstillinger: gap vekt: 0, lengde vekt: 3, gjennomsnittlig match: og gjennomsnittlig mismatch: 0,000, som dersom annet ikke er spesifikt angitt, alltid skal anvendes som standard innstillinger for sekvensoppstillinger Et polynukleotid som koder for et biologisk aktivt fragment av polypeptidet som kodet for av de ovennevnte polynukleotider ifølge oppfinnelsen, dvs. et fragment som utviser desaturaseaktivitet som spesifisert ovenfor, er også omfattet av den foreliggende oppfinnelse. Følgelig kan polypeptidet omfatte eller bestå av domener av polypeptidet ifølge foreliggende oppfinnelse som gir nevnte biologiske aktivitet. Et fragment som ment her, omfatter foretrukket minst 1, minst 20, minst 0, minst 100, minst 20 eller minst 00 påfølgende nukleotider av én av de ovennevnte nukleinsyresekvenser, eller koder for en aminosyresekvens som omfatter minst, minst 10, minst 20, minst 30, minst 0, minst 80, minst 100, eller minst 10 påfølgende aminosyrer av hvilken som helst av de før nevnte aminosyresekvenser. 20 Variant-polynukleotidene som omtalt ovenfor koder foretrukket for polypeptider som bibeholder minst 10 %, minst 20 %, minst 30 %, minst 40 %, minst 0 %, minst 60 %, minst 70 %, minst 80 %, eller minst 90 % av desaturaseaktiviteten utvist ved polypeptidet vist i SEKV. ID nr. 2. Aktiviteten kan testes som beskrevet i de vedlagte eksempler Nukleinsyremolekylene ifølge den foreliggende oppfinnelse består enten i alt vesentlig av de ovennevnte nukleinsyresekvenser, eller omfatter de ovennevnte nukleinsyresekvenser. De kan likeledes inneholde ytterligere nukleinsyresekvenser. Nukleinsyremolekylet ifølge den foreliggende oppfinnelse kan foretrukket omfatte ytterligere ikke-translatert sekvens i 3 - og -terminusen av kodegenregionen: minst 00, foretrukket 200, mer foretrukket 100 nukleotider av sekvensen oppstrøms av - terminusen av koderegionen, og minst 100, foretrukket 0, mer foretrukket 20 nukleotider av sekvensen nedstrøms av 3 -terminusen av kodegenregionen. Videre kan nukleinsyremolekylet ifølge den foreliggende oppfinnelse kode for fusjonsproteiner hvor en del av fusjonsproteinet er et polypeptid som kodet for av en nukleinsyresekvens som angitt ovenfor, og hvor den andre del av fusjonsproteinet er et heterologt polypeptid. Slike fusjonsproteiner kan, som en ytterligere del, omfatte andre enzymer av fettsyre- eller lipidbiosyntesesporene, polypeptider for å måle ekspresjon (f.eks. grønne, gule, blå eller røde fluorescerende proteiner, alkalisk fosfatase, og liknende) eller såkalte tags, som kan tjene som en detekterbar markør,

11 10 eller som et hjelpetiltak for renseformål. Tags for de forskjellige formål er godt kjent innen fagområdet, og omfatter FLAG-tags, 6-histidin-tags, MYC-tags, og liknende Variant-polynukleotider som vist til i overenstemmelse med den foreliggende oppfinnelse kan oppnås ved hjelp av forskjellige naturlige, så vel som kunstige kilder. Nukleinsyremolekyler kan f.eks. oppnås ved in vitro og in vivo mutagenesetilnærminger, ved å anvende de ovenfor nevnte spesifikke nukleinsyremolekyler som en basis. Dessuten kan nukleinsyremolekyler som er homologe eller ortologe oppnås fra forskjellige dyrearter, plantearter eller sopparter. De oppnås foretrukket fra planter slik som alger, f.eks. Isochrysis, Mantoniella, Osterococcus eller Crypthecodinium, alger/diatomer slik som Phaeodactylum eller Thraustochytrium, moser slik som Physcomitrella eller Ceratodon, eller høyere planter slik som Primulaceae, slik som Aleuritia, Calendula stellata, Osteospermum spinescens eller Osteospermum hyoseroides, mikroorganismer slik som sopp, slik som Aspergillus, Thraustochytrium, Phytophthora, Entomophtora, Mucor, Dechslera, Diplodia, Microdochium, Periplaneta, Stagonospora, Cylindrocarpon, Microdochium eller Mortierella, bakterier slik som Shewanella, gjær eller dyr. Foretrukne dyr er nematoder, slik som Caenorhabditis, insekter eller vertebrater. Blant vertebratene kan nukleinsyremolekylene foretrukket være avledet fra Euteleostomi, Actinopterygii; Neopterygii, Teleostei; Euteleostei, Protacanthopterygii, Salmoniformes; Salmonidae eller Oncorhynchus, mer foretrukket fra ordenen Salmoniformes, mest foretrukket familien Salmonidae, slik som slekten Salmo, f.eks. fra slektene og artene Oncorhynchus mykiss, Trutta trutta eller Salmo trutta fario. Nukleinsyremolekylene kan dessuten oppnås fra diatomene, slik som slektene Thallosiosira eller Cryptecodinium Polynukleotidene ifølge den foreliggende oppfinnelse skal foretrukket tilveiebringes enten som et isolert nukleinsyremolekyl (dvs. isolert fra dets naturlige sammenheng, slik som et gen lokus) eller en genetisk modifisert form. Et isolert nukleinsyremolekyl kan f.eks. omfatte mindre enn omtrent kb, 4 kb, 3 kb, 2 kb, 1 kb, 0, kb, eller 0,1 kb av nukleotidsekvenser som naturlig flankerer nukleinsyremolekylet i det genomiske DNA i cellen hvorfra nukleinsyren er avledet. Nukleinsyremolekylet er foretrukket dobbelttrådet eller enkelttrådet DNA, som inkluderer cdna eller RNA. Betegnelsen omfatter enkelttrådede så vel som dobbelttrådede nukleinsyremolekyler. Dessuten er også kjemisk modifiserte nukleinsyremolekyler som inkluderer naturlig forekommende modifiserte nukleinsyremolekyler, slik som glykosylerte eller metylerte

12 11 nukleinsyremolekyler, eller kunstig modifiserte slik som biotinylerte nukleinsyremolekyler, også omfattet. Spesifikt er polynukleotider som koder for polypeptider med 12-desaturase varianter av polynukleotidet som koder for en slik desaturase som vist i SEKV. ID nr. 1, hvor variantene koder for polypeptider med minst 9 % identitet på aminosyrenivået med SEKV. ID nr Dessuten er det beskrevet polynukleotider som koder for polypeptider med 1- desaturase, som er varianter av polynukleotidet som koder for en slik desaturase som vist i SEKV. ID nr. 3, hvor variantene koder for polypeptider med minst 74,1 % identitet på aminosyrenivået med SEKV. ID nr Dessuten er det beskrevet polynukleotider som koder for polypeptider med 12- desaturase, som er varianter av polynukleotidet som koder for en slik desaturase som er vist i SEKV. ID nr., hvor variantene koder for polypeptider som har minst 74,1 % identitet på aminosyrenivået med SEKV. ID nr Dessuten er det beskrevet polynukleotider som koder for polypeptider med 12- desaturase, som er varianter av polynukleotidet som koder for en slik desaturase som vist i SEKV. ID nr. 7, hvor variantene koder for polypeptider med minst 9 % identitet på aminosyrenivået med SEKV. ID nr Dessuten er det beskrevet polynukleotider som koder for polypeptider med 12- desaturase, som er varianter av polynukleotidet som koder for en slik desaturase som vist i SEKV. ID nr. 31, hvor variantene koder for polypeptider med minst 7 % identitet på aminosyrenivået med SEKV. ID nr Dessuten er det beskrevet polynukleotider som koder for polypeptider med 1- desaturase, som er varianter av polynukleotidet som koder for en slik desaturase vist i SEKV. ID nr. 33, hvor variantene koder for polypeptider med minst 7 % identitet på aminosyrenivået med SEKV. ID nr Dessuten er det beskrevet polynukleotider som koder for polypeptider med desaturase, som er varianter av polynukleotidet som koder for en slik desaturase som vist i SEKV. ID nr. 3 eller 37, hvor variantene koder for polypeptider med minst 7 % identitet på aminosyrenivået med henholdsvis SEKV. ID nr. 36 eller 38.

13 12 I studiene som ligger til grunn for den foreliggende oppfinnelse ble polynukleotider fordelaktig identifisert som koder for nye desaturaser fra forskjellige sopp, som kan anvendes for fremstilling av PUFA er og LCPUFA er som spesifisert her. En oversikt over desaturasene er gitt i den etterfølgende tabell: Navn Organisme Aktivitet SEKV. ID nr. D12Des(Dt) Drechslera tritici-repentis D12-desaturase 1 D1Des(Cyh) Cylindrocarpon heteronema D1-desaturase 3 D12Des(Dn) Diplodia natalensis D12-desaturase D12Des(Sn) Stagonospora nodorum D12-desaturase 7 D12Des(Mn) Microdochium nivalae D12-desaturase 31 D1Des(Mn) Microdochium nivalae D1-desaturase 33 dxdes(pa) Periplaneta americana Desaturase 3 dxdes(pa)_2 Periplaneta americana Desaturase Den foreliggende oppfinnelse vedrører også polynukleotidvarianter som er avledet fra polynukleotidene ifølge den foreliggende oppfinnelse, og som er i stand til å interferere med transkripsjonen eller translasjonen av polypeptidene ifølge den foreliggende oppfinnelse. Slike variant-polynukleotider inkluderer anti-sense nukleinsyrer, ribozymer, sirna-molekyler, morfolino-nukleinsyrer (fosfordiamidat-morfolinooligoer), trippel-heliksdannende oligonukleotider, inhiberende oligonukleotider eller mikro-rna-molekyler, som alle spesifikt skal gjenkjenne polynukleotidene ifølge oppfinnelsen. Disse teknikker er vel kjent for den fagkyndige på området. Passende variant-polynukleotider av den ovennevnte typen kan lett designes, basert på strukturen til polynukleotidene ifølge denne oppfinnelse Den foreliggende oppfinnelse beskriver også polynukleotider som koder for acyltransferaser. For ytterligere økning av spesielle fettsyrer slik som ARA, EPA og/eller DHA, eller for økning av total produksjon av nye fettsyrer, er slike acyltransferaser fordelaktige. Disse enzymer er involvert i stokking av forskjellige fettsyrer fra deres respektive produksjonspooler (fosfolipider, acyl-coa), eller ved forestring av de nye fettsyrene til forskjellige molekyler (diacylglyserol, lysofosfatsyre, lysofosfatidylcholin, lysofosfatidyletanolamin, lysofosfatidylglyserol, lysofosfatidylinositol, lysofosfatidylserin, 1-acyl-fosfatidylcholin, osv.). Hvordan anvende nevnte enzymer, er beskrevet i de vedlagte eksempler og i f.eks. WO 2004/ eller WO 2004/

14 Oppfinnelsen beskriver således acyltransferasekodende polynukleotider som omfatter en nukleinsyre som er valgt fra gruppen som består av: a) en nukleinsyre med en nukleinsyresekvens som vist i hvilken som helst av SEKV. ID nr. 102, 104, 106, 108, 110, 112, 13, 137 eller 139; b) en nukleinsyre som koder for et polypeptid med aminosyresekvensen til et polypeptid kodet for av en nukleinsyresekvens som vist i hvilken som helst av SEKV. ID nr. 102, 104, 106, 108, 110, 112, 13, 137 eller 139; c) en nukleinsyre som har en nukleinsyresekvens som er minst 60 % identisk med nukleinsyresekvensen spesifisert i a), hvor nevnte nukleinsyre koder for et polypeptid med acyltransferaseaktivitet; d) en nukleinsyre som koder for et polypeptid som har en aminosyresekvens som er minst 60 % identisk med aminosyresekvensen kodet for av en nukleinsyresekvens som vist i hvilken som helst av SEKV. ID nr. 102, 104, 106, 108, 110, 112, 13, 137 eller 139, hvor nevnte nukleinsyre koder for et polypeptid som har acyltransferaseaktivitet; e) en nukleinsyre som hybridiserer under stringente hybridiseringsbetingelser til nukleinsyren ifølge hvilke som helst av a) til d), hvor nevnte nukleinsyre koder for et polypeptid med desaturaseaktivitet; f) en nukleinsyre som koder for et fragment av et polypeptid kodet for av nukleinsyresekvensen ifølge hvilken som helst av a) til e) med acyltransferaseaktivitet; og g) en nukleinsyre som omfatter minst 1 tilgrensende nukleotider av nukleinsyren ifølge hvilken som helst av a) til f). 2 Definisjonene som utført ovenfor for de desaturasekodende polynukleotider ifølge oppfinnelsen gjelder, med nødvendige eller naturlige endringer, for de acyltransferasekodende polynukleotidene Betegnelsen acyltransferaseaktivitet eller acyltransferase som anvendt her, omfatter alle enzymatiske aktiviteter og enzymer som er i stand til å overføre eller som er involvert i overføringen av PUFA, og særlig; LCPUFA fra acyl-coa-poolen eller membranfosfolipidene til triglyseridene, fra acyl-coa-poolen til membranlipider og fra membranlipider til acyl-coa-poolen ved en omestringsprosess. Det vil forstås at denne acyltransferaseaktivitet vil redusere en økning av LCPUFA forestret til triglyserider i f.eks. frøoljer. Man forestiller seg spesielt at disse acyltransferaser er i stand til å produsere triglyserider med forestret ARA, EPA eller til og med DHA, eller at disse

15 14 acyltransferaser er i stand til å øke syntesen av økt PUFA ved å øke fluksen for spesifikke mellomprodukter av ønsket PUFA mellom acyl-coa-poolen (elongeringsstedet) og membranlipider (det dominerende stedet for avmetning). Spesifikt angår acyltransferaseaktivitet som anvendt her lysofosfolipidacyltransferase (LPLAT) aktivitet, foretrukket lysofosfofatidyletanolaminacyltransferase (LPEAT) aktivitet. Spesifikt vil de acyltransferasekodende nukleinsyresekvensene som vist i SEKV. ID nr. 102, 104, og 106, så vel som 13, 137 og 139, kode for LPLAT-aktivitet. De acyltransferasekodende nukleinsyresekvenser som vist i SEKV. ID nr. 108, 110 og 112 koder for LPEAT-aktivitet Acyltransferase-polynukleotidene som beskrevet her omfatter også variantpolynukleotider av dem som omtalt ovenfor ved spesifikke nukleinsyre- eller aminosyresekvenser. Nevnte variant-polynukleotider inkluderer homologer, foretrukket alleliske varianter, paraloger eller ortologer. Slike polynukleotidvarianter omfatter foretrukket en nukleinsyresekvens som er kjennetegnet ved at sekvensen kan avledes fra de ovennevnte spesifikke nukleinsyresekvenser som vist i SEKV. ID nr. 102, 104, 106, 108, 110, 112, 13, 137 eller 139, ved minst én nukleotidsubstitusjon, addisjon og/eller delesjon hvorved variant-nukleinsyresekvensen fremdeles skal kode for et polypeptid med desaturaseaktivitet som spesifisert ovenfor. Varianter omfatter også nukleinsyremolekyler som omfatter en nukleinsyresekvens som er i stand til hybridisering til de ovennevnte spesifikke nukleinsyresekvenser, foretrukket under stringente hybridiseringsbetingelser. Alternativt kan nukleinsyremolekylvarianter oppnås ved PCR-baserte teknikker som spesifisert annet sted heri. Videre inkluderer varianter nukleinsyremolekyl som omfatter nukleinsyresekvenser som er minst 60 %, minst 7 %, minst 80 %, minst 8 %, minst 86 %, minst 87 %, minst 88 %, minst 89 %, minst 90 %, minst 91 %, minst 92 %, minst 93 %, minst 94 %, minst 9 %, minst 96 %, minst 97 %, minst 98 %, minst 99 % identiske med nukleinsyresekvensene som vist i SEKV. ID nr. 102, 104, 106, 108, 110, 112, 13, 137 eller 139 med beholdt acyltransferaseaktivitet. Dessuten er det også beskrevet nukleinsyremolekyl som omfatter nukleinsyresekvenser som koder for aminosyresekvenser som er minst 60 %, minst 7 %, minst 80 %, minst 8 %, minst 86 %, minst 87 %, minst 88 %, minst 89 %, minst 90 %, minst 91 %, minst 92 %, minst 93 %, minst 94 %, minst 9 %, minst 96 %, minst 97 %, minst 98 %, minst 99 % identiske med aminosyresekvensene kodet for av nukleinsyresekvensene vist i SEKV. ID nr. 102, 104, 106, 108, 110, 112, 13, 137 eller 139, hvor polypeptidet som omfatter aminosyresekvensen beholder acyltransferaseaktivitet.

16 1 Et polynukleotid som koder for et biologisk aktivt fragment av polypeptidet kodet for av de ovennevnte polynukleotider, dvs. et fragment som utviser acyltransferaseaktivitet som spesifisert ovenfor, er også beskrevet. 10 Variant-polynukleotidene som omtalt ovenfor koder foretrukket for polypeptider som bibeholder minst 10 %, minst 20 %, minst 30 %, minst 40 %, minst 0 %, minst 60 %, minst 70 %, minst 80 %, minst 90 % av acyltransferaseaktiviteten som utvist ved polypeptidet som kodet for av en nukleinsyresekvens som vist i SEKV. ID nr. 102, 104, 106, 108, 110, 112, 13, 137 eller 139. Aktiviteten kan testes som beskrevet i de vedlagte eksempler. Den foreliggende oppfinnelse angår en vektor som omfatter polynukleotidet ifølge den foreliggende oppfinnelse (dvs. desaturase- eller acyltransferasekodende polynukleotider) Betegnelsen vektor omfatter foretrukket fag, plasmid, virale eller retrovirale vektorer, så vel som kunstige kromosomer, slik som kunstige kromosomer fra bakterier eller gjær. Dessuten vedrører betegnelsen også målkonstrukter som tillater tilfeldig eller seterettet integrering av målkonstrukten i genomisk DNA. Slike målkonstrukter omfatter foretrukket DNA av tilstrekkelig lengde for enten homolog eller heterolog rekombinasjon som beskrevet detaljert nedenfor. Vektoren som omslutter polynukleotidet ifølge oppfinnelsen omfatter videre foretrukket selekterbare markører for propagering og/eller seleksjon i en vert. Vektoren kan innlemmes i en vertscelle ved hjelp av forskjellige teknikker som er vel kjent innen fagområdet. Dersom introdusert inn i en vertscelle, kan vektoren oppholde seg i cytoplasmaet, eller kan innlemmes i genomet. I det sistnevnte tilfellet skal det forstås at vektoren videre kan omfatte nukleinsyresekvenser som tillater homolog rekombinasjon av heterolog insersjon. Vektorer kan innføres i prokaryotiske eller eukaryotiske celler via konvensjonelle transformasjons- eller transfeksjonsteknikker. Betegnelsene transformasjon og transfeksjon, konjugering og transduksjon, som anvendt i den foreliggende sammenheng, skal omfatte en multiplisitet av tidligere kjente prosesser for å introdusere fremmed nukleinsyre (f.eks. DNA) i en vertscelle, som inkluderer kalsiumfosfat-, rubidiumklorid- eller kalsiumklorid-kopresipitering, DEAEdekstranmediert transfeksjon, lipofeksjon, naturlig kompetanse, karbonbaserte klynger, kjemisk mediert overføring, elektroporering eller partikkelbombardering. Passende metoder for transformasjonen eller transfeksjonen av vertsceller som inkluderer planteceller finner man i Sambrook et al. (Molecular Cloning: A Laboratory

17 16 Manual, 2. utgave, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989) og andre laboratoriemanualer, slik som Methods in Molecular Biology, 199, bind 44, Agrobacterium protocols, red.: Gartland og Davey, Humana Press, Totowa, New Jersey. Alternativt kan en plasmidvektor innføres ved varmesjokk eller elektroporeringsteknikker. Skulle vektoren være et virus, kan det pakkes in vitro ved å anvende en passende pakkecellelinje før anvendelse i vertsceller. Retrovirale vektorer kan være replikasjonskompetente eller replikasjonsdefekte. I det sistnevnte tilfellet, vil viral propagering generelt kun forekomme ved komplettering av vert/celler Vektoren som omtalt her er foretrukket egnet som en kloningsvektor, dvs. replikerbar i mikrobielle systemer. Slike vektorer sikrer effektiv kloning i bakterier, og foretrukket i gjær eller sopp, og muliggjør den stabile transformasjon av planter. De som må nevnes er særlig forskjellige binære og ko-integrerte vektorsystemer som er egnet for den T-DNA-medierte transformasjon. Slike vektorsystemer er, som en regel, kjennetegnet ved at de inneholder minst vir-genene, som er nødvendige for den Agrobacterium-medierte transformasjonen, og sekvensene som avgrenser T-DNA (T- DNA-grense). Disse vektorsystemer omfatter også foretrukket ytterligere cisregulerende regioner slik som promotere og terminatorer, og/eller seleksjonsmarkører med hvilke passende transformerte vertsceller eller organismer kan identifiseres. Mens ko-integrerte vektorsystemer har vir-gener og T-DNA-sekvenser arrangert på den samme vektoren, er binære systemet basert på minst to vektorer, hvorav én bærer vir-gener men ikke noe T-DNA, mens en andre bærer T-DNA men ikke noe vir-gen. Som en følge av dette, er de sistnevnte vektorer relativt små, lette å manipulere og kan replikeres både i E. coli og i Agrobacterium. Disse binære vektorer inkluderer vektorer fra pbib-hyg-, ppzp-, pbecks-, pgreen-seriene. Foretrukket anvendt i overenstemmelse med oppfinnelsen er Bin19, pbi101, pbinar, pgptv og pcambia. En oversikt over binære vektorer og deres anvendelse finner man i Hellens et al., Trends in Plant Science (2000), Videre, ved å anvende passende kloningsvektorer, kan polynukleotidene innføres i vertsceller eller organismer slik som planter eller dyr og kan således anvendes i transformasjonen av planter slik som dem som er publisert og omtalt i: Plant Molecular Biology and Biotechnology (CRC Press, Boca Raton, Florida), kapittel 6/7, sidene (1993); F.F. White, Vectors for Gene Transfer in Higher Plants; i: Transgenic Plants, bind 1, Engineering and Utilization, red.: Kung og R. Wu, Academic Press, 1993, 1-38; B. Jenes et al, Techniques for Gene Transfer, i: Transgenic Plants, bind 1, Engineering and Utilization, red.: Kung og

18 17 R. Wu, Academic Press (1993), ; Potrykus, Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Molec. Biol. 42 (1991), Mer foretrukket er vektoren ifølge den foreliggende oppfinnelse en ekspresjonsvektor. I en slik ekspresjonsvektor er nukleinsyremolekylet operabelt koblet til ekspresjonskontrollsekvenser (også kalt ekspresjonskassett ) som tillater ekspresjon i prokaryotiske eller eukaryotiske celler eller isolerte fraksjoner derav. Ekspresjon av nevnte polynukleotid omfatter transkripsjon av nukleinsyremolekylet, foretrukket til et oversettelsesbart mrna. Regulerende elementer som sikrer ekspresjon i eukaryotiske celler, foretrukket pattedyrceller, er vel kjent innen teknikkens stand. De omfatter foretrukket regulerende sekvenser som sikrer initiering av transkripsjon og eventuelt poly-a-signaler som sikrer terminering av transkripsjon og stabilisering av transkriptet. Ytterligere regulerende elementer kan inkludere transkripsjonsenhancere så vel som translasjonsenhancere. Mulige regulerende elementer som tillater ekspresjon i prokaryotiske vertsceller omfatter f.eks. lac-, trp- eller tac-promoteren i E. coli, og eksempler på regulerende elementer som tillater ekspresjon i eukaryotiske vertsceller er AOX1- eller GAL1-promoteren i gjær eller CMV-, SV40-, RSV-promoteren (Rous sarkomavirus), CMV-enhancer, SV40-enhancer, eller et globin intron i pattedyrceller og andre animalske celler. Dessuten kan induserbare ekspresjonskontrollsekvenser anvendes i en ekspresjonsvektor som er omfattet av den foreliggende oppfinnelse. Slike induserbare vektorer kan omfatte tet- eller lacoperatorsekvenser, eller sekvenser som induseres ved varmesjokk eller andre omgivelsesfaktorer. Passende ekspresjonskontrollsekvenser er velkjente innen teknikkens stand. Foruten elementer som er ansvarlige for initiering av transkripsjon, kan slike regulerende elementer også omfatte transkripsjonstermineringssignaler slik som SV40-poly-A-setet eller tk-poly-a-setet, nedstrøms for polynukleotidet. Ekspresjonsvektoren er også foretrukket en genoverføringsvektor eller målrettingsvektor. Ekspresjonsvektorer avledet fra virus slik retrovirus, vacciniavirus, adenoassosiert virus, herpesvirus eller bovint papillomavirus kan anvendes for å avlevere nukleinsyren eller vektoren ifølge oppfinnelsen til målcellepopulasjonen. Metoder som er velkjent for de fagkyndige på området kan anvendes for å konstruere rekombinante virale vektorer; se f.eks. teknikker som er beskrevet i Sambrook, Molecular Cloning A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1989) N.Y. og Ausubel, Current Protocols in Molecular Biology, Green Publishing Associates og Wiley Interscience, N.Y. (1994).

19 Passende ekspresjonsvektorer er kjent innen teknikkens stand, slik som Okayama- Berg cdna-ekspresjonsvektor pcdv1 (Pharmacia), pcdm8, prc/cmv, pcdna1, pcdna3 (Invitrogen) eller psport1 (GIBCO BRL). Ytterligere eksempler på typiske fusjonsekspresjonsvektorer er pgex (Pharmacia Biotech Inc.; Smith, D.B., og Johanson, K.S. (1988) Gene 67: 31-40), pmal (New England biolabs, Beverly, MA) og prit (Pharmacia, Piscataway, NJ), hvor glutation S-transferase (GST), maltose E- bindingsprotein og protein A henholdsvis er fusjonert med det rekombinante målprotein. Eksempler på passende induserbare ikke-fusjon E. coli ekspresjonsvektorer er blant annet ptrc (Amann et al. (1988) Gene 69: ) og pet 11d (Studier et al., Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 18, Academic Press, San Diego, California (1990) 60-89). Målgenekspresjonen for ptrc-vektoren er basert på transkripsjonen fra en hybrid tap-lac-fusjonspromoter ved hjelp av vert RNA polymerase. Målgenekspresjonen fra pet 11d-vektoren er basert på transkripsjonen av en T7-gn10-lac-fusjonspromoter, som er mediert ved en ko-uttrykt viral RNApolymerase (T7 gn1). Denne virale polymerasen er tilveiebrakt ved vertsstammene BL21 (DE3) eller HMS174 (DE3) fra en resident -profag som huser et T7 gn1-gen under transkripsjonskontrollen av lacuv-promoteren. Den fagkyndige er familiær med andre vektorer som er egnet i prokaryotiske organismer, idet disse vektorer f.eks. er, i E. coli, plg338, pacyc184, pbr-seriene slik som pbr322, puc-seriene slik som puc18 eller puc19, M113mp-seriene, pkc30, prep4, phs1, phs2, pplc236, pmbl24, plg200, pur290, pin-iii113-b1, gt11 ellerpbdcl, i Streptomyces pij101, pij364, pij702 eller pij361, i Bacillus pub110, pc194 eller pbd214, i Corynebacterium psa77 eller paj667. Eksempler på vektorer for ekspresjon i gjæren S. cerevisiae omfatter pyedesaturasec1 (Baldari et al. (1997) Embo J. 6: ), pmfa (Kurjan og Herskowitz (1982) Cell 30: ), pjry88 (Schultz et al. (1987) Gene 4: ) og pyes2 (Invitrogen Corporation, San Diego, CA). Vektorer og prosesser for konstruksjon av vektorer som er egnet for anvendelse i andre sopp, slik som de filamentøse sopp, omfatter dem som er beskrevet detaljert i: van den Hondel, C.A.M.J.J., & Punt, P.J. (1991) Gene transfer systems and vector development for filamentous fungi, i: Applied Molecular Genetics of fungi, J.F. Peberdy et al., red., sidene 1-28, Cambridge University Press: Cambridge, eller i: More Gene Manupulations in Fungi (J.W. Bennett & L.L. Lasure, red., sidene : Academic Press. San Diego). Ytterligere egnede gjærvektorer er f.eks. pag-1, YEp6, YEp13 eller pemblye23. Som et alternativ, kan polynukleotidene ifølge den foreliggende oppfinnelse også uttrykkes i insektceller ved å anvende baculovirus ekspresjonsvektorer. Baculovirusvektorer er tilgjengelig for ekspresjon av proteiner i dyrkede insektceller (f.eks. Sf9-celler) som omfatter pac-seriene (Smith et al. (1983)

20 19 Mol. Cell Biol. 3: ) og pvl-seriene (Lucklow og Summers (1989) Virology 170: 31-39) De etterfølgende promotere og ekspresjonskontrollsekvenser kan foretrukket anvendes i en ekspresjonsvektor ifølge den foreliggende oppfinnelse. Cos-, tac-, trp-, tet-, trp-tet-, lpp-, lac-, lpp-lac-, laclq-, T7-, T-, T3-, gal-, trc-, ara-, SP6-, -PLpromotere er foretrukket anvendt i gram-negative bakterier. For gram-positive bakterier, kan promotere amy og SPO2 anvendes. Fra gjær- eller sopp-promotere blir ADC1, MFα, AC, P-60, CYC1, GAPDH, TEF, rp28, ADH, foretrukket anvendt, eller fra plante kan promoterne CaMV/3S [Franck et al., Cell 21 (1980) ], PRP1 [Ward et al., Plant. Mol. Biol. 22 (1993)], SSU-, OCS-, lib4-, usp-, STLS1-, B33-, noseller ubiquitin- eller faseolin-promoteren nevnes. Også foretrukket i denne sammenheng er induserbare promotere slik som promoterne beskrevet i EP A (benzylsulfonamidinduserbar), Plant J. 2, 1992: (Gatz et al., tetrasyklininduserbar), EP A (abscicinsyreinduserbar) eller WO 93/21334 (etanol- eller sykloheksanolinduserbar). Ytterligere passende plantepromotere er promoteren av cytosolisk FBPase eller ST-LSI-promoteren fra potet (Stockhaus et al., EMBO J. B., 1989, 244), fosforibosylpyrofosfatamidotransferasepromoteren fra Glycine max (Genbank aksesjonsnummer U87999), eller den nodespesifikke promoteren beskrevet i EP-A Foretrukket er særlig promotere som muliggjør ekspresjon i vev som er involvert i biosyntesen av fettsyrer. Også særlig foretrukket er frøspesifikke promotere slik som USP-promoteren i overenstemmelse med praksis, men også andre promotere slik som LeB4, DC3, faseolin- eller napinpromoterne. Ytterligere særlig fordelaktige promotere er frøspesifikke promotere som kan anvendes for monokotyledonplanter eller dikotyledonplanter, og som er beskrevet i US (napinpromoter fra raps), WO 99/4461 (oleosinpromoter fra Arobidopsis, US (faseolinpromoter fra Phaseolus vulgaris), WO 91/13980 (Bce4-promoter fra Brassica), av Baeumlein et al., Plant J., 2, 2, 1992: (LeB4-promoter fra en grønnsak), idet disse promotere er egnet for dikoter. De etterfølgende promoterne er f.eks. egnet for monokoter: lpt-2- eller lpt-1-promoter fra bygg (WO 9/1389 og WO 9/23230), hordeinpromoter fra bygg og andre promotere som er egnet og som er beskrevet i WO 99/ Prinsipielt er det mulig å anvende alle naturlige promotere sammen med deres regulerende sekvenser, slik som dem som nevnt ovenfor, for den nye prosessen. Likeledes er det mulig og fordelaktig å anvende syntetiske promotere, enten i tillegg eller alene, særlig når de medierer en frøspesifikk ekspresjon slik som f.eks. beskrevet i WO 99/16890.