(12) Oversettelse av europeisk patentskrift

Transkript

1 (12) Oversettelse av europeisk patentskrift (11) NO/EP B1 (19) NO NORGE (1) Int Cl. A23C 19/032 (06.01) A21D 8/04 (06.01) C07K 14/19 (06.01) C12N 9/ (06.01) C12P 7/64 (06.01) C12Q 1/48 (06.01) Patentstyret (21) Oversettelse publisert (80) Dato for Den Europeiske Patentmyndighets publisering av det meddelte patentet (86) Europeisk søknadsnr (86) Europeisk innleveringsdag (87) Den europeiske søknadens Publiseringsdato (30) Prioritet , GB, (84) Utpekte stater AT BE BG CH CY CZ DE DK EE ES FI FR GB GR HR HU IE IS IT LI LT LU LV MC MT NL NO PL PT RO SE SI SK TR Utpekte samarbeidende stater AL BA MK RS (73) Innehaver DuPont Nutrition Biosciences ApS, Langebrogade 1 Postboks 17, 01 Copenhagen K., DK-Danmark (72) Oppfinner LARSEN, Niels Erik, Skæring Hedevej 166, DK-8 Egå, DK-Danmark SØE, Jørn Borch, Orøvænget 11, DK-8381 Tilst, DK-Danmark (74) Fullmektig Curo AS, Industriveien 3, 7080 HEIMDAL, Norge (4) Benevnelse Prosess (6) Anførte publikasjoner WO-A-06/00808 US-A NERLAND A H: "THE NUCLEOTIDE SEQUENCE OF THE GENE ENCODING GCAT FROM AEROMONAS SALMONICIDA SSP. SALMONICIDA" JOURNAL OF FISH DISEASES, OXFORD, GB, vol. 19, no. 2, 1 January 1996 ( ), pages 14-, XP ISSN: NERLAND A H: "GLYCEROPHOSPHOLIPID-CHOLESTEROL ACYLTRANSFERASE PRECURSOR" SWISSPROT,, 1 January 1900 ( ), XP

2 1 Beskrivelse HENVISNING TIL RELATERTE SØKNADER [0001] Det foretas referanse til de følgende relaterte søknadene: US , US , WO04/06437, WO04/064987, WO0/066347, WO0/06631, WO06/00808, WO 08/09039 og US OMRÅDET FOR DEN FORELIGGENDE OPPFINNELSEN [0002] Den foreliggende oppfinnelsen vedrører en prosess for fremstilling av UHT-melk, en prosess for enzymatisk behandling av UHT-melk, en enzymatisk behandlet UHT-melk, og anvendelser av et enzym for behandling av UHT-melk for å gi nye og uventede tekniske fordeler. BAKGRUNN FOR DEN FORELIGGENDE OPPFINNELSEN [0003] Lipidacyltransferaser er kjent for å være fordelaktige i matanvendelser. Lipidacyltransferaser har blitt funnet å ha sterk acyltransferaseaktivitet i matvarer. Denne aktiviteten har overraskende fordelaktige anvendelser i fremgangsmåter for fremstilling av matvarer. [0004] For eksempel offentliggjør WO 04/06437 en fremgangsmåte for in situ-produksjonen av en emulgator ved anvendelse av en lipidacyltransferase, og fordelene forbundet med dette. WO 08/09039 beskriver uttrykkingen av lipidacyltransferaser i (heterolog) vertscelle. [000] Varmebehandling i produksjon av produkter med lang levetid kalles ofte "sterilisering". Dette innebærer at produktet utsettes for en slik kraftig varmebehandling at alle relevante mikroorganismer og flesteparten av de varmebestandige enzymene inaktiveres. Slike produkter har utmerkede holdekvaliteter og kan oppbevares over lengre tid ved omgivelsestemperatur. Mange meierier kan derfor distribuere disse produktene over lange avstander og dermed finne nye markeder. [0006] Vanligvis anvendes to fremgangsmåter for fremstilling av sterilisert (ellers kjent som melk med lang levetid til oppbevaring ved omgivelsestemperatur), nemlig i-beholdersterilisering eller UHT-behandling etterfulgt av aseptisk emballering i emballasje som beskytter produktet mot lys og atmosfærisk oksygen. Den foreliggende oppfinnelsen er anvendbar for melk med lang levetid fremstilt ved hvilken som helst fremgangsmåte, f.eks. UHT-melk. [0007] Det er mange fordeler for produsent, forhandler og forbruker hvis produktet ikke krever kjøling og kan oppbevares i lange perioder uten søl. [0008] Disse produktene kalles ofte UHT-produkter, særlig UHT-melk eller UHT-smakssatt melk. [0009] Melk som utsettes for UHT-behandling må være av meget god kvalitet. Det er spesielt viktig at proteinene i råmelken ikke forårsaker termisk ustabilitet, noe som kan være tilfelle dersom råmelken er av dårlig kvalitet. En melk er uegnet for UHT-behandling hvis den er sur, har feil saltbalanse og/eller inneholder for mange serumproteiner, typisk for kolostrum.

3 2 [00] Når melken holdes ved en høy temperatur i lang tid dannes visse kjemiske reaksjonsprodukter, noe som fører til misfarging (bruning). Den erverver også en kokesmak og karamellisert smak, og det er av og til en stor del bunnfall. Disse manglene unngås i stor grad ved varmebehandling ved høyere temperatur i en kort tid. Det er viktig at den optimale tid/temperatur-kombinasjonen velges for å muliggjøre tilfredsstillende sporeødeleggelse, mens man samtidig holder varmeskaden på melken til et minimum. [0011] Det har blitt vist at når melken varmes opp (f.eks. pasteuriseres ved C i - sekunder), blir en effekt kjent som "fløtepluggfenomenet" tydelig. Varmebehandling av melk kan være skadelig for stabiliteten av melken. [0012] De viktigste ingrediensene av melk er vann, fett, proteiner, laktose (melkesukker) og mineraler (salter). Melk inneholder også mindre mengder av andre stoffer, slik som pigmenter, enzymer, vitaminer, fosfolipider (stoffer med fettlignende egenskaper), steroler og gasser. [0013] De mange lipidene i melk, som sammen danner "melkefettet", har en meget komplisert sammensetning og struktur, enda mer komplisert enn de fleste andre naturlig forekommende fettene. Vanligvis består melkefett av triglyserider, di- og monoglyserider, fettsyrer, steroler, karotenoider og vitaminer (A, D, E og K). Andre komponenter inkluderer fosfolipider, lipoproteiner, glyserider, cerebrosider, proteiner, nukleinsyrer, enzymer, metaller og vann. [0014] Fosfolipider er den mest overflateaktive klassen, ettersom de er amfipolare. Ettersom molekylstørrelsen er relativt stor, er de knapt løselige, verken i vann eller i fett. De har en tendens til å danne lamellære bilag i begge væskene. Fosfolipider i melk er generelt sett i nær forbindelse med proteiner, spesielt når de plasseres i membranen(e) av melkefettdråpene. Hoveddelen av fosfolipider i melk er lecitiner, som er overflateaktive ved moderat hydrofilitet. Dermed kan lecitin sees som et suspenderende og dispergerende middel eller som en emulgator for O/W-emulsjoner så vel som for W/O-emulsjoner. [001] Fosfolipider omfatter 0,8-1,0 % av det naturlige melkefettet. Hovedtypene av fosfolipider/lecitin i melk er fosfatidylkolin og fosfatidyletanolamin. [0016] Steroler er svært uløselige i vann og viser meget liten overflateaktivitet. De assosieres lett med fosfolipider. Kolesterolet kan betraktes som en uønsket ingrediens i melk når man vurderer den ernæringsmessige verdien av melk. Kolesterol omfatter 0,3-0,4 % av det naturlige melkefettet. [0017] EP viser anvendelsen av en fosfolipase for å behandle en ostemelk eller en ostemelkfraksjon. [0018] Tanji et al (Res. Bull. Obihiro Univ., 22 (01): 89-94) viser anvendelsen av lipaser for å forbedre smaken i smørolje ved 40 C.

4 3 [0019] JP og JP viser behandlingen av melk for å fremstille gjærede eller sure melkedrikker som anvender fosfolipaser - der den enzymatiske behandlingen gjøres ved 30-4 C. OPPSUMMERTE ASPEKTER AV DEN FORELIGGENDE OPPFINNELSEN [00] Aspekter ifølge den foreliggende oppfinnelsen presenteres i kravene og i den følgende kommentaren. [0021] Det har overraskende blitt funnet at stabiliteten, særlig langtidsstabiliteten, av UHT-melk kan forbedres vesentlig ved å utsette melk eller en del av denne under UHT-melkeproduksjonen for en lipidacyltransferase som definert i dette dokumentet. [0022] Enda mer overraskende har oppfinnerne ifølge den foreliggende oppfinnelsen funnet at den enzymatiske behandlingen kan utføres uten et ekstra oppvarmingstrinn. Dermed kan de negative effektene av å varme opp melken to ganger, dvs. én gang for enzymatisk behandling og deretter igjen for UHT-behandlingen unngås. Dette har mange fordeler som beskrevet nedenfor. DETALJERTE ASPEKTER IFØLGE DEN FORELIGGENDE OPPFINNELSEN [0023] I henhold til et første aspekt ifølge den foreliggende oppfinnelsen er det tilveiebrakt en fremgangsmåte for fremstilling av UHT-melk, der fremgangsmåten omfatter blanding av en lipidacyltransferase og melk eller en fraksjon av denne ved en temperatur og i en inkubasjonstid som er effektiv for å sikre at det er minst % transferaseaktivitet målt ved den molare mengden av kolesterolesteren dannet av acyloverføring fra fosfolipider eller triacylglyserider i melk til kolesterol, i forhold til mengden av kolesterol som opprinnelig er tilgjengelig, beregnet ved hjelp av den følgende ligningen: Transferaseaktivitet = (mol/l kolesterester(t) mol/l kolesterolester(0))x0 mol/l kolesterol(0), der: Kolesterolester (t) = mengden kolesterolester ved tidspunktet t Kolesterolester (0) = mengden kolesterolester ved tidspunktet 0 Kolesterol (0) = mengden kolesterol i melk ved tidspunktet 0; og behandling av den enzymbehandlede melken ved ultravarmebehandling for å fremstille UHTmelk. [0024] "Ultravarmebehandling (UHT)" er en prosess der melken varmes opp til omtrent 130- C og holdes der i noen få sekunder, slik som ett til tre sekunder, fortrinnsvis to sekunder. Begrepene "ultravarmebehandling" og "ultrahøy temperaturbehandling" og "høytemperaturbehandling" anvendes synonymt i dette dokumentet. [002] I én utførelsesform er begrepet "ultravarmebehandling" som anvendt i dette dokumentet ment å omfatte både sterilisering i beholder og/eller UHT-behandling etterfulgt av aseptisk emballering i emballasje som beskytter produktet mot lys og atmosfærisk oksygen.

5 4 [0026] Som en fagperson vil forstå vil UHT-varmebehandlingstiden og temperaturkombinasjonen etableres basert på produktet som skal behandles, og kan variere i en viss grad. [0027] Etter varmebehandling kan UHT-melken sendes til en steril tank for å gi en buffer før fylling. [0028] Fylling gjøres vanligvis i en steril atmosfære der UHT-emballeringsmaskinen spyler pakken med nitrogen og også holder området innenfor fyllehodene oversvømmet med nitrogen for å eliminere eventuell luftforurensning. [0029] I henhold til et andre aspekt ifølge den foreliggende oppfinnelsen er det tilveiebrakt en anvendelse av en lipidacyltransferase ved fremstilling av UHT-melk for å forbedre stabiliteten, spesielt langtidsstabiliteten, av UHT-melken. [0030] Begrepet "forbedring av stabiliteten" som anvendt i dette dokumentet, betyr at det er en reduksjon i mengden av skumming og/eller bunnsetting og/eller flokkulering og/eller faseseparasjon etter oppbevaring (fortrinnsvis etter oppbevaring i minst 24 timer). Hensiktsmessig kan oppbevaringen være ved en temperatur på mellom omtrent C og 3 C. [0031] I én utførelsesform betyr begrepet "forbedring av stabiliteten" som anvendt i dette dokumentet, at det er en reduksjon i mengden av skumming uten dannelse av et bunnlag etter oppbevaring (fortrinnsvis etter oppbevaring i minst 24 timer). Oppbevaringen kan hensiktsmessig være ved en temperatur på mellom omtrent C og 3 C. [0032] Skumming kan måles objektivt av Turbiscan (som beskrevet i dette dokumentet i eksempeldelen) og/eller subjektivt av belastningstesten (som lært i dette dokumentet i eksempeldelen). [0033] Flokkulering kan måles objektivt av Turbiscan (som beskrevet i dette dokumentet i eksempeldelen) og/eller subjektivt av belastningstesten (som beskrevet i dette dokumentet i eksempeldelen). [0034] Bunnsetting kan måles av bunnsettingstesten (som beskrevet i dette dokumentet i eksempeldelen). [003] Faseseparasjon kan måles visuelt eller av Turbiscan (som beskrevet i dette dokumentet i eksempeldelen). [0036] Begrepet "forbedring av langtidsstabiliteten" som anvendt i dette dokumentet, betyr at det er en reduksjon i mengden av skumming (fortrinnsvis uten dannelse av et bunnsettingslag) og/eller bunnsetting og/eller flokkulering og/eller faseseparasjon etter oppbevaring over en lengre tidsperiode (fortrinnsvis etter oppbevaring i omtrent 1-12 måneder, mer foretrukket etter oppbevaring i omtrent 3-12 måneder, fortrinnsvis etter oppbevaring i opptil omtrent 6 måneder, fortrinnsvis etter oppbevaring i opptil omtrent 12 måneder, mer foretrukket etter oppbevaring i

6 minst omtrent 6 måneder). Oppbevaringen kan hensiktsmessig være ved en temperatur på mellom omtrent C og 3 C. [0037] I henhold til et tredje aspekt ifølge den foreliggende oppfinnelsen er det tilveiebrakt en anvendelse av en lipidacyltransferase ved fremstilling av UHT-melk for å forbedre den sensorisk merkbare forskjellen av UHT-melken. Den sensorisk merkbare forskjellen av UHT-melken kan hensiktsmessig måles ved hjelp av "trekanttesten" beskrevet nedenfor i dette dokumentet. [0038] I ett aspekt inkluderer den "sensorisk merkbare forskjellen" forbedret lukt og/eller smak, f.eks. en redusert kokt smak og/eller aroma og/eller en redusert illeluktende smak og/eller aroma. [0039] I henhold til et fjerde aspekt ifølge den foreliggende oppfinnelsen er det tilveiebrakt en anvendelse av en lipidacyltransferase ved fremstilling av UHT-melk for å redusere kolesterolinnholdet i UHT-melken. [0040] En reduksjon i kolesterolet kan måles ved hjelp av tynnsjiktkromatografi (TLC) og/eller gassvæskekromatografi (GLC). [0041] I henhold til et femte aspekt ifølge den foreliggende oppfinnelsen er det tilveiebrakt en anvendelse av en lipidacyltransferase ved fremstilling av UHT-melk for å eliminere eller redusere skumming (fortrinnsvis uten dannelse av et bunnlag) i UHT-melken. [0042] Hensiktsmessig betyr forbedringen i stabiliteten, særlig langtidsstabiliteten, og/eller forbedringen i den sensorisk merkbare forskjellen og/eller forbedringen i lukt og/eller smak og/eller reduksjonen i kolesterolinnholdet, og/eller reduksjonen i skummingen (fortrinnsvis uten dannelse av et sedimentlag) av UHT-melken en forbedring når den enzymatisk behandlede UHTmelken (behandlet med enzymer i samsvar med den foreliggende oppfinnelsen) sammenlignes med UHT-melken, som ikke har blitt enzymatisk behandlet og/eller sammenlignet med UHTmelken som har blitt behandlet med en fosfolipase (nærmere bestemt et fosfolipase-a1-enzym klassifisert som E.C eller et fosfolipase-a2-enzym klassifisert som EC ). [0043] Hensiktsmessig kan forbedringen i stabiliteten, særlig langtidsstabiliteten, og/eller forbedringen i den sensorisk merkbare forskjellen og/eller forbedringen i lukt og/eller smak og/eller reduksjonen i kolesterolinnholdet, og/eller reduksjonen i skummingen (fortrinnsvis uten dannelse av et sedimentlag) av UHT-melken bety en forbedring når den enzymatisk behandlede UHT-melken (behandlet med enzymer i samsvar med den foreliggende oppfinnelsen) sammenlignes med UHT-melken som har blitt behandlet med én eller flere av de følgende fosfolipasene: Fosfolipase A1 fra Fusarium oxysporum (Lipopan F ) og/eller en fosfolipase fra Fusarium heterosporum og/eller en fosfolipase A1 fra Fusarium venenatum (YieldMax ) og/eller en fosfolipase fra Aspergillus niger og/eller en fosfolipase A2 fra Streptomyces violaceoruber og/eller en fosfolipase A2 fra bukspyttkjertelen til gris og/eller en fosfolipase A2 fra Tuber borchii.

7 6 [0044] Hensiktsmessig kan forbedringen i stabiliteten, særlig langtidsstabiliteten, og/eller forbedringen i den sensorisk merkbare forskjellen og/eller forbedringen i lukt og/eller smak og/eller reduksjonen i kolesterolinnholdet, og/eller reduksjonen i skummingen (fortrinnsvis uten dannelse av et sedimentlag) av UHT-melken bety en forbedring når den enzymatisk behandlede UHT-melken sammenlignes med UHT-melken som har blitt behandlet med én fosfolipase A1 fra Fusarium oxysporum (Lipopan F ). [004] Det er fortrinnsvis fordelaktig å blande lipidacyltransferasen med melken eller en del av denne før den gjennomgår behandling med høy temperatur. Med andre ord kan lipidacyltransferasen tilsettes til råmelk eller en del av denne, og den enzymbehandlede råmelken eller en del av denne gjennomgår deretter ultravarmebehandling (som gir UHT-melk eller en del av denne). [0046] I én utførelsesform ifølge den foreliggende oppfinnelsen kan den foreliggende oppfinnelsen tilveiebringe en fremgangsmåte for fremstilling av UHT-melk, der fremgangsmåten omfatter blanding av en lipidacyltransferase og melk eller en fraksjon av denne ved en temperatur og i en inkubasjonstid som er effektiv for å sikre at det er minst % transferaseaktivitet målt ved den molare mengden av kolesterolesteren dannet ved acyloverføring fra fosfolipider eller triacylglyserider i melk til kolesterol, i forhold til mengden av kolesterol som opprinnelig er tilgjengelig, beregnet ved hjelp av den følgende ligningen: Transferaseaktivitet = (mol/l kolesterolester(t) mol/l kolesterolester(0))x0 mol/l kolesterol(0)der: Kolesterolester (t) = mengden kolesterolester ved tidspunktet t Kolesterolester (0) = mengden kolesterolester ved tidspunktet 0 Kolesterol (0) = mengden kolesterol ved tidspunktet 0. [0047] Dessuten beskrives det i dette dokumentet at en lipidacyltransferase kan tilsettes til melken eller en del av denne etter ultra-varmebehandlingen av melken. [0048] Lipidacyltransferasen tilsettes fortrinnsvis til melken og inkuberes med denne ved en temperatur på mindre enn omtrent C, fortrinnsvis mindre enn omtrent C. [0049] Lipidacyltransferasen tilsettes fortrinnsvis til melken og inkuberes med denne ved en temperatur på mindre enn omtrent 1 C og omtrent C, fortrinnsvis mellom mindre enn omtrent 3 C og omtrent 7 C, mer foretrukket omtrent C. [000] Inkubasjonstiden er fortrinnsvis effektiv til å sikre at det er minst % transferaseaktivitet, fortrinnsvis minst % transferaseaktivitet, fortrinnsvis minst 1 %, %, 2 % 26 %, 28 %, 30 %, 40 % 0 %, 60 % eller 7 % transferaseaktivitet.

8 7 [001] Transferaseaktiviteten måles ved den molare mengden av kolesterolesteren dannet ved 1 acyloverføring fra fosfolipider eller triacylglyserider i melk til kolesterol i forhold til mengden av kolesterol som opprinnelig er tilgjengelig Transferaseaktivitet = (mol/l kolesterolester(t) mol(l) kolesterolester(0))x0 mol/l kolesterol (0) [002] der: Kolesterolester(t) = mengden kolesterolester ved tidspunktet t Kolesterolester(0) = mengden kolesterolester ved tidspunktet 0 Kolesterol (0) = mengden kolesterol i melk ved tidspunktet 0 Kolesterol og kolesterolester bestemmes ved GLC Gasskromatografi: [003] Gasskromatografi anvendes til å måle innholdet av kolesterol og kolesterolester i melkeprøvene. [004] Følgende CG-oppsett anvendes: Perkin Elmer Autosystem 9000 kapillær gasskromatograf utstyrt med WCOT-sammensmeltet silikakolonne 12, m x 0,2 mm ID x 0,1 µ filmtykkelse % fenyl-metylsilikon (CP Sil 8 CB fra Chrompack).Bærergass: Helium.Injektor. PSSI kald splittinjeksjon (innledende temp. 0 C oppvarmet til 38 C), volum 1,0 µl Detektor FID: 39 C Ovnsprogram (anvendt siden ): Ovnstemperatur, C Isotermal, tid, min. 1 0 Temperaturhastighet, C/min. 1 4 Fremstilling av melkeprøver for GC-analyse: 2 [00] Melkelipidene ble ekstrahert i henhold til Mojonnier AOAC ved anvendelse av etanol, NH 3, MTBE (metyl-tert-butyleter) og p-eter. Lipidfraksjonen ble løst opp på nytt i heptan/pyridin (2:1) inneholdende heptadekan som indre standard og kolesterol ble målt ved GC. [006] Fremstilling av prøver for kolesterol-estermålinger av Squalane tilsettes som en ekstra indre standard. Lipidfraksjonen løses opp på nytt i heksan og kolesterolestere konsentreres ved hjelp av en NH 2 -bindingselueringskolonne og heksaneluering. Prøvene ble løst på nytt i heptan/pyridin (2:1) og kolesterol-estere ble målt ved CG.

9 8 [007] I fremgangsmåten ifølge den foreliggende oppfinnelsen er kombinasjonen av temperatur og inkubasjonstid effektiv til å sikre at det er minst % transferaseaktivitet, fortrinnsvis minst % transferaseaktivitet, fortrinnsvis minst 1 %, %, 2 %, 26 %, 28 %, 30 %, 40 %, 0 %, 60 % eller 7 % transferaseaktivitet. [008] Inkubasjonstiden kan hensiktsmessig være fra minutter opptil 30 timer, inkubasjonstiden kan hensiktsmessig være fra 4 minutter opptil 30 timer. [009] I én utførelsesform kan inkubasjonstiden være fra rundt timer til rundt 30 timer, fortrinnsvis fra rundt 1 til 2 timer, mer foretrukket rundt timer. [0060] I én foretrukket utførelsesform finner den enzymatiske behandlingen sted ved rundt 3 til rundt C (fortrinnsvis rundt C) i minst timer, fortrinnsvis mellom rundt og 2 timer, fortrinnsvis rundt timer. [0061] Anvendelsen av lavere temperaturer i kombinasjon med effektive inkubasjonstider fører til betydelige fordeler i den foreliggende oppfinnelsen. [0062] I fremgangsmåtene og/eller anvendelsene ifølge den foreliggende oppfinnelsen varmes fortrinnsvis ikke melken (UHT-melken) opp under enzymatisk behandling. [0063] I fremgangsmåtene og/eller anvendelsene ifølge den foreliggende oppfinnelsen varmes melken fortrinnsvis opp bare én gang (når den ultra-varmebehandles for å tilveiebringe en UHTmelk). Derfor gjennomgår melken (f.eks. UHT-melk) i den foreliggende oppfinnelsen fortrinnsvis ikke mer enn ett oppvarmingstrinn under produksjonen sin. [0064] I noen aspekter kan lipidacyltransferasen for anvendelse i hvilken som helst av fremgangsmåtene og/eller anvendelsene ifølge den foreliggende oppfinnelsen omfatte et GDSxmotiv og/eller et GANDY-motiv. [006] Fortrinnsvis karakteriseres lipidacyltransferaseenzymet som et enzym som besitter acyltransferaseaktivitet og som omfatter aminosyresekvensmotivet GDSX, der X er én eller flere av de følgende aminosyrerestene L, A, V, I, F, Y, H, Q, T, N, M eller S. [0066] Nukleotidsekvensen som koder for en lipidacyltransferase eller lipidacyltransferase for anvendelse i hvilken som helst av fremgangsmåtene og/eller anvendelsene ifølge den foreliggende oppfinnelsen kan hensiktsmessig være oppnåelige, fortrinnsvis oppnådd, fra en organisme fra én eller flere av de følgende slektene: Aeromonas, Streptomyces, Saccharomyces, Lactococcus, Mycobacterium, Streptococcus, Lactobacillus, Desulfitobacterium, Bacillus, Campylobacter, Vibrionaceae, Xylella, Sulfolobus, Aspergillus, Schizosaccharomyces, Listeria, Neisseria, Mesorhizobium, Ralstonia, Xanthomonas og Candida. Lipidacyltransferasen er fortrinnsvis oppnåelig, fortrinnsvis oppnådd, fra en organisme fra Aeromonas-slekten. [0067] I noen aspekter ifølge den foreliggende oppfinnelsen koder nukleotidsekvensen som koder for en lipidacyltransferase for anvendelse i hvilken som helst av fremgangsmåtene og/eller

10 9 anvendelsene ifølge den foreliggende oppfinnelsen for en lipidacyltransferase som omfatter en asparaginsyrerest i en posisjon som tilsvarer N-80 i aminosyresekvensen til Aeromonas hydrophilalipidacyltransferasen vist som SEQ ID No. 3. [0068] I noen aspekter ifølge den foreliggende oppfinnelsen er lipidacyltransferasen for anvendelse i hvilken som helst av fremgangsmåtene og/eller anvendelsene ifølge den foreliggende oppfinnelsen en lipidacyltransferase som omfatter en asparaginsyrerest i en posisjon som tilsvarer N-80 i aminosyresekvensen til Aeromonas hydrophila-lipidacyltransferasen vist som SEQ ID No. 3. [0069] I tillegg eller som et alternativ koder nukleotidsekvensen som koder for en lipidacyltransferase for anvendelse i hvilken som helst av fremgangsmåtene og/eller anvendelsene ifølge den foreliggende oppfinnelsen for en lipidacyltransferase som kan omfatte aminosyresekvensen vist som SEQ ID No. 16, eller en aminosyresekvens som har 7 % eller mer homologi med denne. Nukleotidsekvensen som koder for en lipidacyltransferase koder hensiktsmessig for en lipidacyltransferase som kan omfatte aminosyresekvensen vist som SEQ ID No. 16. [0070] I tillegg eller som et alternativ koder nukleotidsekvensen som koder for en lipidacyltransferase for anvendelse i hvilken som helst av fremgangsmåtene og/eller anvendelsene ifølge den foreliggende oppfinnelsen for en lipidacyltransferase som kan omfatte aminosyresekvensen vist som SEQ ID No. 68, eller en aminosyresekvens som har 7 % eller mer homologi med denne. Nukleotidsekvensen som koder for en lipidacyltransferase, koder hensiktsmessig for en lipidacyltransferase som kan omfatte aminosyresekvensen vist som SEQ ID No. 68. [0071] I én utførelsesform har lipidacyltransferasen for anvendelse i hvilken som helst av fremgangsmåtene og/eller anvendelsene ifølge den foreliggende oppfinnelsen en aminosyresekvens vist i SEQ ID No. 16 eller SEQ ID No. 68, eller har en aminosyresekvens som har minst 7 % identitet med denne, fortrinnsvis minst 80 %, fortrinnsvis minst 8 %, fortrinnsvis minst 9 %, fortrinnsvis minst 98 % identitet med denne. [0072] I dette dokumentet betyr begrepet "UHT-melk" enhver melk med lang levetid utformet for omgivelsesoppbevaring. Nærmere bestemt betyr "UHT-melk" enhver melk som har blitt varmebehandlet for å gi melk med lang levetid, dette inkluderer smaksatte og ikke-smaksatte produkter. [0073] Fremgangsmåten kan hensiktsmessig omfatte et trinn med å fjerne enzymet og/eller denaturere enzymet. [0074] Enzymet for anvendelse i den foreliggende oppfinnelsen kan hensiktsmessig være et immobilisert enzym.

11 [007] Melkeproduktet i den foreliggende offentliggjøringen er en UHT-melk eller en UHTsmakssatt melk. [0076] Det er ikke ment å dekke ostemelk i dette dokumentet (dvs. en melk som ikke er en UHTmelk, og som anvendes i den etterfølgende fremstillingen av ost) og/eller ost eller osteprodukter som produseres fra en melk som ikke er UHT-melk. FORDELER [0077] En fordel med den foreliggende oppfinnelsen er at stabiliteten, særlig langtidsstabiliteten, av UHT-melk kan forbedres betydelig. [0078] En ytterligere fordel er at den uønskede fysiske effekten av "skumming" av UHT-melk forhindres og/eller reduseres sammenlignet med UHT-melk, som ikke er enzymatisk behandlet og/eller sammenlignet med UHT-melk, som under fremstillingen er blitt behandlet med en fosfolipase (nærmere bestemt et fosfolipase-a1-enzym klassifisert som E.C eller et fosfolipase-a2-enzym klassifisert som EC ) (i stedet for lipidacyltransferansen som beskrevet i dette dokumentet). [0079] Begrepet "skumming" som anvendt i dette dokumentet betyr den uønskede gravitasjonsøkningen av fettdråper til toppen av melken (f.eks. i en beholder) over tid. [0080] En ytterligere fordel ved den foreliggende oppfinnelsen kan være reduksjonen av overflatespenningen i UHT-melk behandlet i samsvar med den foreliggende oppfinnelsen sammenlignet med UHT-melk som ikke er enzymatisk behandlet og/eller sammenlignet med UHTmelk, som under fremstillingen er blitt behandlet med en fosfolipase (nærmere bestemt enten et fosfolipase-a1-enzym klassifisert som E.C eller et fosfolipase-a2-enzym klassifisert som EC ) (i stedet for lipidacyltransferansen som beskrevet i dette dokumentet). [0081] En ytterligere fordel med den foreliggende oppfinnelsen kan være reduksjonen av forurensing av UHT-anlegget (f.eks. av anleggsrørene og/eller ståloverflatene) ved anvendelse av UHT-melken behandlet i samsvar med den foreliggende oppfinnelsen sammenlignet med UHTmelk, som ikke har blitt enzymatisk behandlet og/eller sammenlignet med UHT-melk, som under fremstillingen er blitt behandlet med en fosfolipase (nærmere bestemt enten et fosfolipase-a1- enzym klassifisert som E.C eller et fosfolipase-a2-enzym klassifisert som EC ) (i stedet for lipidacyltransferansen som beskrevet i dette dokumentet). [0082] En ytterligere fordel med den foreliggende oppfinnelsen kan være en reduksjon i frie fettsyrer i UHT-melk behandlet i samsvar med den foreliggende oppfinnelsen sammenlignet med UHT-melk, som under fremstillingen er blitt behandlet med en fosfolipase (nærmere bestemt enten et fosfolipase-a1-enzym klassifisert som E.C eller et fosfolipase-a2-enzym klassifisert som EC ) (i stedet for lipidacyltransferansen som beskrevet i dette dokumentet).

12 11 [0083] Enda mer overraskende har oppfinnerne av den foreliggende oppfinnelsen funnet at den enzymatiske behandlingen kan utføres uten et ekstra oppvarmingstrinn. Nærmere bestemt kan den enzymatiske behandlingen ved hjelp av lipidacyltransferasen i samsvar med den foreliggende oppfinnelsen utføres ved temperaturer så lave som rundt 1-2 C, fortrinnsvis så lave som rundt 1- C, fortrinnsvis mellom rundt 3 og rundt 7 C, mer foretrukket rundt C. Dermed kan man unngå de negative effektene av å varme opp melken to ganger, dvs. én gang for UHT-behandlingen og deretter igjen for den enzymatiske behandlingen. Dette har mange fordeler, inkludert (at): a) prosessen er mer økonomisk og derfor er fordelaktig for produsenter av UHT-melken; b) oppvarming av melken kan føre til uønskede effekter, slik som et sammenbrudd i stabiliteten av ingrediensene av melken, den foreliggende oppfinnelsen reduserer denne ufordelaktige egenskapen i stor grad; og/eller c) færre endringer i organoleptiske egenskaper. [0084] En ytterligere fordel med den foreliggende oppfinnelsen er et redusert kolesterolinnhold i UHT-melken, som kan ha store helsefordeler. [008] Forbedringen i hvilken som helst av egenskapene beskrevet i dette dokumentet (for eksempel skumming) kan hensiktsmessig sammenlignes med UHT-melk som har blitt behandlet med én eller flere av de følgende fosfolipasene: Fosfolipase A1 fra Fusarium oxysporum (Lipopan F ) og/eller en fosfolipase A1 fra Fusarium venenatum (YieldMax ) og/eller en fosfolipase fra Fusarium heterosporum og/eller en fosfolipase fra Aspergillus niger og/eller en fosfolipase A2 fra Streptomyces violaceoruber og/eller en fosfolipase A2 fra bukspyttkjertelen til gris og/eller en fosfolipase A2 fra Tuber borchii; fortrinnsvis fosfolipase A1 fra Fusarium oxysporum (Lipopan F ). VERTSCELLE [0086] Vertsorganismen kan være en prokaryot eller en eukaryot organisme. [0087] I en utførelsesform ifølge den foreliggende oppfinnelsen uttrykkes lipidacyltransferasen i henhold til den foreliggende oppfinnelsen i en vertscelle, f.eks. bakterieceller, som f.eks. en Bacillus spp-, f.eks. en Bacillus licheniformis-vertscelle. [0088] Alternative vertsceller kan være f.eks. sopp, gjær eller planter. [0089] Det har blitt funnet at anvendelsen av en Bacillus licheniformis-vertscelle fører til økt uttrykking av en lipidacyltransferase når den sammenlignes med andre organismer, slik som Bacillus subtilis. [0090] En lipidacyltransferase fra Aeromonas salmonicida er blitt innført i en rekke konvensjonelle uttrykkingsvektorer, som er utformet for å være optimale for uttrykking i henholdsvis Bacillus subtilis, Hansenula polymorpha, Schizosaccharomyces pombe og Aspergillus tubigensis. Imidlertid ble kun svært lave nivåer detektert i Hansenula polymorpha, Schizosaccharomyces pombe og Aspergillus tubigensis. Uttrykkingsnivåene var under 1 µg/ml, og det var ikke mulig å

13 12 velge celler som ga nok protein til å initiere en kommersiell produksjon (resultater ikke vist). I motsetning til dette var Bacillus licheniformis i stand til å produsere proteinnivåer, som er attraktive for en økonomisk gjennomførbar produksjon. [0091] Det har nærmere bestemt blitt funnet at uttrykking i B. licheniformis er rundt 0 ganger større enn uttrykking i B. subtilis under kontroll av ape-promoteren, eller er omtrent 0 ganger større enn uttrykking i S. lividans under kontroll av en A4-promoter og sammensmeltet til cellulose (resultater ikke vist i dette dokumentet). [0092] Vertscellen kan være hvilken som helst Bacillus-celle forskjellig fra B.subtilis. Fortrinnsvis er vertscellen Bacillus fra én av de følgende artene: Bacillus licheniformis; B. alkalophilus; B. amyloliquefaciens; B. circulans; B. clausii; B. coagulans; B. firmus; B. lautus; B. lentus; B. megaterium; B. pumilus eller B. stearothermophilus. [0093] Begrepet "vertscelle" - i forhold til den foreliggende oppfinnelsen inkluderer hvilken som helst celle som omfatter enten en nukleotidsekvens som koder for en lipidacyltransferase som definert i dette dokumentet eller en uttrykkingsvektor som definert i dette dokumentet og som anvendes i den rekombinante produksjonen av en lipidacyltransferase som har de spesifikke egenskapene som er definert i dette dokumentet. [0094] Vertscellen kan hensiktsmessig være en proteasefattig eller protease-minus-stamme og/eller en α-amylasefattig eller α-amylase-minus-stamme. [009] Begrepet "heterolog" som anvendt i dette dokumentet betyr en sekvens avledet fra en separat genetisk kilde eller arter. En heterolog sekvens er en ikke-vertssekvens, en modifisert sekvens, en sekvens fra en annen vertscellestamme, eller en homolog sekvens fra en annen kromosomal plassering av vertscellen. [0096] En "homolog"-sekvens er en sekvens som finnes i den samme genetiske kilden eller artene, dvs. at den er naturlig forekommende i de aktuelle artene av vertscellen. [0097] Begrepet "rekombinant lipidacyltransferase" som anvendt i dette dokumentet betyr at lipidacyltransferasen er blitt fremstilt ved hjelp av genetisk rekombinasjon. For eksempel har nukleotidsekvensen som koder for lipidacyltansferasen blitt satt inn i en kloningsvektor, som gir en B. licheniformis-celle karakterisert ved nærværet av den heterologe lipidacyltransferasen. REGULATORISKE SEKVENSER [0098] I noen anvendelser kan en lipid-acyltransferasesekvens for anvendelse i fremgangsmåtene og/eller anvendelsene ifølge den foreliggende oppfinnelsen oppnås ved operativt å forbinde en nukleotidsekvens som koder for samme til en regulatorisk sekvens som er i stand til å sørge for uttrykkingen av nukleotidsekvensen, f.eks. av den valgte vertscellen (som f.eks. en B. licheniformis -celle).

14 13 [0099] Som et eksempel kan det anvendes en vektor omfattende nukleotidsekvensen operativt bundet til en slik regulatorisk sekvens, dvs. at vektoren er en uttrykkingsvektor. [00] Begrepet "operativt bundet" betyr en sidestilling der de beskrevne komponentene er i et forhold som tillater dem å fungere på deres tiltenkte måte. En regulatorisk sekvens "operativt bundet" til en kodingssekvens ligeres på en slik måte at uttrykkingen av kodingssekvensen oppnås under forhold som er kompatible med kontrollsekvensene. [01] Begrepet "regulatoriske sekvenser" inkluderer promotere og forsterkere og andre uttrykkingsregulerende signaler. [02] Begrepet "promoter" anvendes i normal forstand av teknikken, f.eks. et RNApolymerasebindingssete. [03] Forsterket uttrykking av nukleotidsekvensen som koder for enzymet som har de spesifikke egenskapene som definert i dette dokumentet, kan også oppnås ved valget av regulerende regioner, f.eks. promoter, utskillelsesleder og termineringsregioner som ikke er regulatoriske regioner for nukleotidsekvensen som koder for enzymet i naturen. [04] Nukleotidsekvensen kan hensiktsmessig bindes operativt til minst én promoter. [0] Nukleotidsekvensen som koder for en lipidacyltranferase kan hensiktsmessig bindes operativt til en nukleotidsekvens som koder for en terminatorsekvens. Eksempler på egnede terminatorsekvenser for anvendelse i hvilken som helst av vektorene, vertscellene, fremgangsmåtene og/eller anvendelser ifølge den foreliggende oppfinnelsen inkluderer: en α- amylaseterminatorsekvens (f.eks. CGGGACTTACCGAAAGAAACCATCAATGATGGTTTCTTTTTTGTTCATAAA - SEQ ID No. 64), en alkalisk proteaseterminatorsekvens (f.eks. CAAGACTAAAGACCGTTCGCCCGTTTTTGCAATAAGCGGGCGAATCTTACATAAAA ATA - SEQ ID No. 6), en glutaminsyre-spesifikk terminatorsekvens (f.eks. ACGGCCGTTAGATGTGACAGCCCGTTCCAAAAGGAAGCGGGCTGTCTTCGTGTAT TATTGT - SEQ ID No. 66), en levanaseterminatorsekvens (f.eks. TCTTTTAAAGGAAAGGCTGGAATGCCCGGCATTCCAGCCACATGATCATCGTTT - SEQ ID No. 67), en subtilisin-e-terminatorsekvens (f.eks. GCTGACAAATAAAAAGAAGCAGGTATGGAGGAACCTGCTTCTTTTTACTATTATTG - SEQ ID No. 119). Nukleotidsekvensen som koder for en lipidacyltranferase kan hensiktsmessig bindes operativt til en α-amylaseterminator, slik som en B. licheniformis α-amylaseterminator. PROMOTER [06] Promotersekvensen som skal anvendes i samsvar med den foreliggende oppfinnelsen kan være heterolog eller homolog med sekvensen som koder for en lipidacyltransferase.

15 14 [07] Promotersekvensen kan være hvilken som helst promotersekvens i stand til å dirigere uttrykking av en lipidacyltransferase i den valgte vertscellen. [08] Promotersekvensen kan hensiktsmessig være homolog med en Bacillus-art, f.eks. B. licheniformis. Promotersekvensen er fortrinnsvis homolog med den valgte vertscellen. [09] Promotersekvensen kan hensiktsmessig være homolog med vertscellen. "Homolog med vertscellen" betyr opprinnelse innenfor vertsorganismen; dvs. en promotersekvens som er funnet naturlig i vertsorganismen. [01] Promotersekvensen kan hensiktsmessig velges fra gruppen bestående av en nukleotidsekvens som koder for: en α-amylasepromoter, en proteasepromoter, en subtilisinpromoter, en glutaminsyrespesifikk proteasepromoter og en levansukrasepromoter. [0111] Promotersekvensen kan hensiktsmessig være en nukleotidsekvens som koder for: LAT (f.eks. alfa-amylasepromoteren fra B. licheniformis, også kjent som AmyL), AprL (f.eks. subtilisin- Carlsberg-promoter), EndoGluC (f.eks. den glutaminsyrespesifikke promoteren fra B. licheniformis), AmyQ (f.eks. alfaamylasepromoteren fra B.amyloliquefaciens-alfaamylasepromoteren) og SacB (f.eks. B. subtilislevansukrasepromoteren). [0112] Andre eksempler på promoterer som er egnet til å dirigere transkripsjonen av en nukleinsyresekvens i fremgangsmåtene ifølge den foreliggende oppfinnelsen inkluderer: promoteren til det alkaliske Bacillus lentus-proteasegenet (aprh); promoteren til Bacillus subtilisalfa-amylasegenet (amye); promoteren til Bacillus stearothermophilus-maltogeneseamylasegenet (amym); promoteren til Bacillus licheniformis-penicillinasegenet (penp); promoterene til Bacillus subtilis xyla- og xylb-genene; og/eller promoteren til Bacillus thuringiensis subsp.tenebrionis- CryIIIA-genet. [0113] I en foretrukket utførelsesform er promotersekvensen en α-amylasepromoter (slik som en Bacillus licheniformis α-amylasepromoter). Promotersekvensen omfatter fortrinnsvis -3- til - -sekvensen av B. licheniformis α-amylasepromoteren - se figurene 3 og. [0114] "-3- til --sekvensen" beskriver posisjonen i forhold til transkripsjonsstartsetet. Både "- 3" og "-" er bokser, dvs. en rekke av nukleotider, hver omfattende 6 nukleotider, og disse boksene er adskilt med 17 nukleotider. Disse 17 nukleotidene refereres ofte til som et "avstandsstykke". Dette er illustrert i figur, der -3- og --boksene er understreket. For å unngå tvil, der "-3- til - -sekvensen" anvendes i dette dokumentet, refererer den til en sekvens fra begynnelsen av -3-boksen til slutten av --boksen, dvs. inkludert både -3-boksen, det 17- nukleotid lange avstandsstykket og --boksen. SIGNALPEPTID

16 1 [011] Lipidacyltransferasen fremstilt av en vertscelle ved uttrykking av nukleotidsekvensen som koder for lipidacyltransferasen, kan skilles ut eller kan inneholdes intracellulært avhengig av sekvensen og/eller vektoren som anvendes. [0116] En signalsekvens kan anvendes til å dirigere utskillelse av de kodende sekvensene/kodingssekvensene gjennom en bestemt cellemembran. Signalsekvensene kan være naturlige eller fremmede for den lipidacyltransferasekodende sekvensen. F.eks. kan den signalpeptidkodende sekvensen oppnås fra et amylase- eller proteasegen fra en Bacillus-art, fortrinnsvis fra Bacillus licheniformis. [0117] Egnede signalpeptidkodende sekvenser kan oppnås fra ett eller flere av de følgende genene: maltogenese-α-amylasegenet, subtilisingenet, beta-laktamasegenet, det nøytrale proteasegenet, prsa-genet og/eller acyltransferasegenet. [0118] Fortrinnsvis er signalpeptidet et signalpeptid av B.licheniformis-α-amylase, Aeromonas acyltransferase (f.eks. mkkwfvcllglialtvqa - SEQ ID No. 21), B. subtilis-subtilisin (f.eks. mrskklwisllfaltliftmafsnmsaqa - SEQ ID No. 22) eller B. licheniformis-subtilisin (f.eks. mmrkksfwfgmltafmlvftmefsdsasa - SEQ ID No. 23). Signalpeptidet kan hensiktsmessig være signalpeptidet til B. licheniformis-α-amylase. [0119] Hvilken som helst signalpeptidkodende sekvens i stand til å dirigere den uttrykte lipidacyltransferasen inn i den utskillende reaksjonsveien til en valgt Bacillus-vertscelle (fortrinnsvis en B. licheniformis-vertscelle) kan anvendes. [01] I noen utførelsesformer ifølge den foreliggende beskrivelsen kan en nukleotidsekvens som koder for et signalpeptid bindes operativt med en nukleotidsekvens som koder for en valgt lipidacyltransferase. [0121] Den valgte lipidacyltransferasen kan uttrykkes i en vertscelle som definert i dette dokumentet som et fusjonsprotein. UTTRYKKINGSVEKTOR [0122] Begrepet "uttrykkingsvektor" betyr et konstrukt i stand til in vivo- eller in vitro-uttrykking. [0123] Fortrinnsvis innføres uttrykkingsvektoren i genomet til organismen, som f.eks. en B. licheniformis-vert. Begrepet "innført" dekker fortrinnsvis stabil innføring i genomet. [0124] Nukleotidsekvensen som koder for en lipidacyltransferase som definert i dette dokumentet, kan være til stede i en vektor, der nukleotidsekvensen bindes operativt til regulatoriske sekvenser, slik at de regulatoriske sekvensene er i stand til å gi uttrykkingen av nukleotidsekvensen av en egnet vertsorganisme (slik som B.licheniformis), dvs. at vektoren er en uttrykkingsvektor. [012] Vektorene kan omdannes til en egnet vertscelle som beskrevet ovenfor for å tilveiebringe uttrykking av et polypeptid som har lipidacyltransferaseaktivitet som definert i dette dokumentet.

17 16 [0126] Ved valget av vektor, f.eks. plasmid, kosmid, virus eller fagvektor, vil genomisk innsetting ofte avhenge av vertscellen som den skal innføres i. Den foreliggende offentliggjøringen kan dekke andre former for uttrykkingsvektorer som tjener ekvivalente funksjoner og som er, eller blir, kjent i teknikken. [0127] Når vektoren er transformert inn i den valgte vertscellen, kan vektoren replikere og fungere uavhengig av vertscellens genom, eller kan integrere i genomet i seg selv. [0128] Vektorene kan inneholde ett eller flere valgbare markørgener - slik som et gen som gir antibiotikaresistens, f.eks. ampicillin-, kanamycin-, kloramfenikol- eller tetrasyklinresistens. Valget kan alternativt utføres ved ko-transformasjon (som beskrevet i WO91/17243). [0129] Vektorene kan anvendes in vitro, f.eks. for produksjon av RNA eller anvendes til å transfektere eller transformere en vertscelle. [0130] Vektoren kan videre omfatte en nukleotidsekvens som gjør det mulig for vektoren å replikere i den aktuelle vertscellen. Eksempler på slike sekvenser er replikeringsopprinnelsene til plasmidene puc19, pacyc177, pub1, pe194, pamb1 og pij702. LIPIDACYLTRANSFERASE [0131] Nukleotidsekvensen som koder for en lipidacyltransferase for anvendelse i hvilken som helst av fremgangsmåtene og/eller anvendelsene ifølge den foreliggende oppfinnelsen kan kode for en naturlig lipidacyltransferase eller en variantlipidacyltransferase. [0132] Lipidacyltransferasen for anvendelse i hvilken som helst av fremgangsmåtene og/eller anvendelsene ifølge den foreliggende oppfinnelsen kan være en naturlig lipidacyltransferase eller en variantlipidacyltransferase. [0133] F.eks. kan nukleotidsekvensen som koder for en lipidacyltransferase for anvendelse i den foreliggende oppfinnelsen kan være en som beskrevet i WO04/06437, WO04/064987, WO0/ ellerwo06/ [0134] Begrepet "lipidacyltransferase" som anvendt i dette dokumentet betyr fortrinnsvis et enzym som har acyltransferaseaktivitet (generelt klassifisert som E.C x, f.eks ), idet enzymet er i stand til å overføre en acylgruppe fra et lipid til ett eller flere akseptorsubstrater, slik som ett eller flere av de følgende: et sterol; en stanol; et karbohydrat; et protein; en proteindelenhet; en sukkeralkohol, slik som askorbinsyre og/eller glyserol - fortrinnsvis glyserol og/eller en sterol, slik som kolesterol. [013] Fortrinnsvis er lipidacyltransferasen for anvendelse i hvilken som helst av fremgangsmåtene og/eller anvendelsene ifølge den foreliggende oppfinnelsen en lipidacyltransferase som er i stand til å overføre en acylgruppe fra et fosfolipid (som definert i dette dokumentet) til en sukkeralkohol, slik som askorbinsyre og/eller glyserol og/eller en sterol, fortrinnsvis glyserol eller en sterol, mest foretrukket en sterol (f.eks. kolesterol).

18 17 [0136] For noen aspekter kan "acylakseptoren" være hvilken som helst forbindelse omfattende en hydroksygruppe (-OH), slik som f.eks. flerverdige alkoholer, inkludert glyserol; steroler; stanoler; karbohydrater; hydroksysyrer, inkludert fruktsyre, sitronsyre, vinsyre, melkesyre og askorbinsyre; proteiner eller en underenhet av denne, slik som aminosyrer, proteinhydrolysater og peptider (delvis hydrolysert protein), f.eks.; og blandinger og derivater av denne. "Acylakseptoren" ifølge den foreliggende oppfinnelsen er fortrinnsvis ikke vann. "Acylakseptoren" ifølge den foreliggende oppfinnelsen er fortrinnsvis en sukkeralkohol, slik som et polyol, mest foretrukket glyserol. For formålet med denne oppfinnelsen anses askorbinsyre også som en sukkeralkohol. [0137] Acylakseptoren er fortrinnsvis ikke et monoglyserid. [0138] Acylakseptoren er fortrinnsvis ikke et diglyserid. [0139] I ett aspekt er lipidacyltransferasen for anvendelse i hvilken som helst av fremgangsmåtene og/eller anvendelsene ifølge den foreliggende oppfinnelsen en lipidacyltransferase som kan, i tillegg til å være i stand til å overføre en acylgruppe fra en lipid til glyserol, i tillegg være i stand til å overføre acylgruppen fra et lipid til ett eller flere av følgende: et karbohydrat, et protein, en proteinunderenhet, sterol og/eller en stanol, den er fortrinnsvis i stand til å overføre til både en sukkeralkohol, slik som askorbinsyre og/eller glyserol, mest foretrukket en sterol slik som kolesterol, og/eller plantesteroler/stanoler. [0140] Fortrinnsvis er lipidsubstratet som lipidacylet opptrer på ett eller flere av de følgende lipidene: et fosfolipid, slik som et lecitin, f.eks. fosfatidylkolin og/eller fosfatidyletanolamin. [0141] Dette lipidsubstratet kan refereres til i dette dokumentet som "lipidacyldonoren". Begrepet lecitin som anvendt i dette dokumentet omfatter fosfatidylkolin, fosfatidyletanolamin, fosfatidylinositol, fosfatidylserin og fosfatidylglyserol. [0142] For noen aspekter er fortrinnsvis lipidacyltransferasen for anvendelse i hvilken som helst av fremgangsmåtene og/eller anvendelsene ifølge den foreliggende oppfinnelsen en lipidacyltransferase som er i stand til, eller i det vesentlige ikke i stand til, å virke på et triglyserid og/eller et 1-monoglyserid og/eller 2-monoglyserid. [0143] For noen aspekter er fortrinnsvis lipidacyltransferasen for anvendelse i hvilken som helst av fremgangsmåtene og/eller anvendelsene ifølge den foreliggende oppfinnelsen en lipidacyltransferase som ikke fremviser triacylglyserollipaseaktivitet (E.C ) eller ikke fremviser betydelig triacylglyserollipaseaktivitet (E.C ). [0144] Muligheten til å hydrolysere triglyerid (E.C aktivitet) som kan bestemmes av lipaseaktivitet bestemmes i henhold til Food Chemical Codex (3. utg., 1981, s ) modifisert til solsikkeolje og ph, i stedet for olivenolje og ph 6,. Lipaseaktiviteten måles som LUS (lipaseenheter solsikke) der 1 LUS er definert som mengden enzym som kan frigjøre 1 [mu]mol

19 fettsyrer per minutt fra solsikkeolje i henhold til analyseforholdene ovenfor. Alternativt kan LUTanalysen som definert i WO98443 anvendes. [014] Lipidacyltransferasen for anvendelse i hvilken som helst av fremgangsmåtene og/eller anvendelsene ifølge den foreliggende oppfinnelsen kan være en lipidacyltransferase som i det vesentlige ikke er i stand til å virke på et triglyserid som kan ha en LUS/mg på mindre enn 00, f.eks. mindre enn 00, slik som mindre enn 300, fortrinnsvis mindre enn 0, mer foretrukket mindre enn 0, mer foretrukket mindre enn 0, mer foretrukket mindre enn, mer foretrukket mindre enn, slik som mindre enn, mindre enn 2, mer foretrukket mindre enn 1 LUS/mg. Alternativt er LUT/mg-aktiviteten mindre enn 00, slik som mindre enn 300, fortrinnsvis mindre enn 0, mer foretrukket mindre enn 0, mer foretrukket mindre enn 0, mer foretrukket mindre enn, mer foretrukket mindre enn, slik som mindre enn, mindre enn 2, mer foretrukket mindre enn 1 LUT/mg. [0146] Lipidacyltransferasen for anvendelse i hvilken som helst av fremgangsmåtene og/eller anvendelsene ifølge den foreliggende oppfinnelsen kan være en lipidacyltransferase som i det vesentlige ikke er i stand til å virke på et monoglyserid. Dette kan bestemmes ved anvendelse av mono-oleat (M776 1-oleoyl-rac-glyserol 99 %) i stedet for solsikkeoljen i LUS-analysen. 1 MGHU er definert som mengden enzym som kan frigjøre 1 [mu]mol fettsyrer per minutt fra monoglyserid under analyseforholdene. [0147] Lipidacyltransferasen for anvendelse i hvilken som helst av fremgangsmåtene og/eller anvendelsene ifølge den foreliggende oppfinnelsen er en lipidacyltransferase som fortrinnsvis i det vesentlige ikke er i stand til å virke på et triglyserid som kan ha en MGHU/mg på mindre enn 000, f.eks. mindre enn 00, f.eks. mindre enn 00, slik som mindre enn 300, fortrinnsvis mindre enn 0, mer foretrukket mindre enn 0, mer foretrukket mindre enn 0, mer foretrukket mindre enn, mer foretrukket mindre enn, slik som mindre enn, mindre enn 2, mer foretrukket mindre enn 1 MGHU/mg. [0148] Lipidacyltransferasen for anvendelse i hvilken som helst av fremgangsmåtene og/eller anvendelsene ifølge den foreliggende oppfinnelsen er hensiktsmessig en lipidacyltransferase som kan fremvise én eller flere av de følgende fosfolipaseaktivitetene: fosfolipase-a2-aktivitet (E.C ) og/eller fosfolipase-a1-aktivitet (E.C ). Lipidacyltransferasen kan også ha fosfolipase-b-aktivitet (EC ). [0149] For noen aspekter kan lipidacyltransferasen hensiktsmessig være i stand til å overføre en acylgruppe fra et fosfolipid til en sukkeralkohol, fortrinnsvis glyserol og/eller askorbinsyre. [0] For noen aspekter kan lipidacyltransferasen hensiktsmessig være i stand til å overføre en acylgruppe fra et fosfolipid til en stanol og/eller sterol, fortrinnsvis kolesterol. [011] For noen aspekter koder fortrinnsvis lipidacyltransferasen for anvendelse i hvilken som

20 19 helst av fremgangsmåtene og/eller anvendelsene ifølge den foreliggende oppfinnelsen for en lipidacyltransferase som er i stand til å overføre en acylgruppe fra et fosfolipid til en sterol og/eller en stanol for å danne minst én sterolester og/eller en stanolester. [012] Lipidacyltransferasen kan være i stand til å overføre en acylgruppe fra et lipid til et polyol, slik som glyserol og/eller et sterol, slik som kolesterol eller plantesterol/stanoler. I en utførelsesform kan dermed "acylakseptoren" ifølge den foreliggende oppfinnelsen være glyserol og/eller kolesterol eller plantesterol/stanoler. [013] Lipidacyltransferaseenzymet kan fortrinnsvis karakteriseres ved anvendelse av de følgende kriteriene: enzymet besitter acyltransferaseaktivitet som kan defineres som esteroverføringsaktivitet hvorved acyldelen til en original esterbinding til en lipidacyldonor overføres til en acylakseptor, fortrinnsvis glyserol eller kolesterol, for å danne en ny ester; og enzymet omfatter aminosyresekvensmotivet GDSX, der X er én eller flere av de følgende aminosyrerestene L, A, V, I, F, Y, H, Q, T, N, M eller S. [014] Fortrinnsvis er X i GDSX-motivet L eller Y. Mer foretrukket er X i GDSX-motivet L. Dermed omfatter fortrinnsvis enzymet i henhold til den foreliggende oppfinnelsen aminosyresekvensmotivet GDSL. [01] GDSX-motivet omfatter fire konserverte aminosyrer. Fortrinnsvis er serinet i motivet et katalytisk serin av lipidacyltransferaseenzymet. Serinet i GDSX-motivet kan hensiktsmessig være i en posisjon som tilsvarer Ser-16 i Aeromonas hydrophila-lipidacyltransferaseenzymet vist i Brumlik & Buckley (Journal of Bacteriology Apr. 1996, bind 178, Nr. 7, s ). [016] For å avgjøre om et protein har GDSX-motivet ifølge den foreliggende oppfinnelsen sammenlignes sekvensen fortrinnsvis med de skjulte markov-modellprofilene (HMM-profiler) av pfam-databasen i samsvar med prosedyrene vist i WO04/06437 ellerwo04/ [017] Lipidacyltransferaseenzymet kan fortrinnsvis sammenstilles ved anvendelse av Pfam0067- konsensussekvensen (for en fullstendig forklaring se WO04/06437 eller WO04/064987). [018] Fortrinnsvis indikerer en positiv match med den skjulte markov-modellprofilen (HMMprofil) av pfam0067-domenefamilien nærvær av GDSL- eller GDSX-domenet ifølge den foreliggende oppfinnelsen. [019] Når lipidacyltransferasen for anvendelse i fremgangsmåtene eller anvendelsene ifølge oppfinnelsen er sammenstilt med Pfam0067-konsensussekvensen, kan den ha minst én, fortrinnsvis flere enn én, fortrinnsvis flere enn to, av de følgende, en GDSx-blokk, en GANDY-blokk, en HPT-blokk. Hensiktsmessig kan lipidacyltransferasen ha en GDSx-blokk og en GANDY-blokk. Enzymet kan alternativt ha en GDSx-blokk og en HPT-blokk. Enzymet omfatter fortrinnsvis minst én GDS-blokk. Se WO04/06437 eller WO04/ for mer informasjon. [0160] Rester av GANDY-motivet velges fortrinnsvis fra GANDY, GGNDA, GGNDL, mest foretrukket