1 KJ2053 Kromatografi (Analytiske metoder II) Lundanes Else, Reubsaet Léon, Greibrokk Tyge, Chromatography, Basic Principles, Sample Preparations and..., Wiley-VCH, 2014. ISBN:978-3-527-33620-3 1.A Retensjonsparametere 1.B Sonespredning / Båndspredning 1
2 1. C. 1. Leddene i / bidragene til den forenklede van Deemter-ligningen: 1.C.1. a. Eddy-diffusjon, H e ( i pakkede kolonner ) 1.C.1. b. Longitudinal diffusjon, H L : 1.C.1. c. Massetransport-termer, H MT : 1.C. 2. van Deemter-kurven (og noen flere varianter av van Deemter-ligningen) 1.C. 3. Noen varianter av van Deemter-likningen (av enda flere) 1.C. 4. Sonesprednings-bidrag fra utenfor kolonnen 2
3 Ulike prosesser / faktorer bidrar til sonespredning: Enklest å analysere i platehøyde-verdier, som er proporsjonale med variansen av t R H = L ( R t R ) 2 fordi sonespredningsbidrag, uttrykt som varians, er additive H = H i i dersom prosessene er uavhengige av hverandre (er stokastiske). H total = H A + H B + H C + H D +.. 3
4 Det er flere parametere i kromatografisystemet som bidrar til spredning (foruten faktorer utenfor kolonna, (jfr. 1.C.3), så som f.eks. injeksjonen, detektoren). Kolonnens bidrag oppsummeres f.eks. i den forenklede van Deemter-ligningen : u = lineær (gjennomsnitts-) hastighet av den mobile fasen Tre additive ledd, hvert med sitt bidrag til variansen fra tre (antatt) uavhengige bidrag til sonespredning. 4
5 NB : Mange ulike varianter av van Deemter-ligninger finnes (på engelsk: ofte samlet kalt (chromatographic) rate equations )... og flere teoretiske tilganger (s.n.; jfr. også lærebøker og KJ3059). eller : J. Hawkes, Modernization of the van Deemter Equation for Chromatographic Zone Dispersion Journal of Chemical Education 60, p. 393-398 (1983): En interessant diskusjon av van Deemter-likningen og dens bakgrunn: Den går en del utover KJ2053- ambisjonene, men er meget opplysende (om enn noe tungt for nykommere; den er pensum i KJ3059). 5
6 1. C. 1. Leddene i / bidragene til den forenklede van Deemter-ligningen: 1.C.1. a. Eddy diffusjon, H e ( i pakkede kolonner / sjikt ) H e = A = c e d p c e = proporsjonalitetsfaktor d p = partikkeldiameter av pakningsmaterialet i kolonna (eller sjiktet) Prosess: Spredning av molekyler i MF-strømmen langs kolonna, fordi ulike individuelle molekyler følger ulike veivalg gjennom pakningsmaterialet, ulike strømningslinjer (= Eddys ). 6
7 1. C. 1. Leddene i / bidragene til den forenklede van Deemter-ligningen: 1.C.1. a. Eddy diffusjon, H e ( i pakkede kolonner ) Prosess: Spredning av molekyler i MF-strømmen langs kolonna, fordi ulike individuelle molekyler følger ulike veivalg gjennom paknings-materialet, ulike strømningslinjer (= Eddys ). Identiske molekyler tilbakelegger ulik lange veistrekninger innen samme tid. (også ulik (gjennomsnits-)hastighet, men den delen er ofte tilordnet en annen term). Molekyler når ulikt langt innen samme tid / bruker ulikt lang tid fra start til et gitt punkt lenger nedstrøms, molekylene sprer seg langs transport-retningen: sonespredning / båndspredning skjer. 7
8 1. C. 1. Leddene i / bidragene til den forenklede van Deemter-ligningen 1.C.1. a. Eddy diffusjon, H e, i pakkede kolonner Prosess: Spredning av molekyler i MF-strømmen langs kolonna, fordi ulike individuelle molekyler følger ulike veivalg gjennom pakningsmaterialet, ulike strømningslinjer (= Eddys ). Sonespredningen fra eddy-diffusjon antas her å være helt uavhengig av u MF (MFhastigheten) - (i de enkleste modellene). Korte eddys (veldig få partikelpasseringer lange): gir meget store ulikheter i tilbakelagt vei / forbrukt tid (regnet i forhold til gjennomsnittet), og lite anledning til statistisk utjevning av ulikheter. Lengre strømningsveier : de samme ulikhetene på korte strekninger som ovenfor - men samlet en større mulighet for (noe) utjevning av de store ulikhetene mellom de korte del-strekningene av eddy ene (delstrekninger i størrelsesorden til partikkel-diameteren), (f. eks. etter de første partikkel-passeringene) 8
9 1. C. 1. Leddene i / bidragene til den forenklede van Deemter-ligningen 1.C.1. a. Eddy diffusjon, H e, i pakkede kolonner Prosess: Spredning av molekyler i MF-strømmen langs kolonna, fordi ulike individuelle molekyler følger ulike veivalg gjennom pakningsmaterialet, ulike strømningslinjer (= Eddys ). (Ved gitt kolonnelengde) : ved mindre partikler (d.v.s. lavere d p ) mindre sonespredning lavere platehøyde Årsak: større muligheter for statistisk utjevning av vei-ulikheter (lengde & fart) gjennom økt antall partikkelpasseringer pr. kolonnelengde (eller, generelt, pr. lengdeenhet). 9
10 1. C. 1. Leddene i / bidragene til den forenklede van Deemter-ligningen 1.C.1. a. Eddy diffusjon, H e, i pakkede kolonner Prosess: Spredning av molekyler i MF-strømmen langs kolonna, fordi ulike individuelle molekyler følger ulike veivalg gjennom pakningsmaterialet, ulike strømningslinjer (= Eddys ). Regelmessig pakning (her med sfæriske mono-disperse partikler): gir like eddys lite spredning. Irregulær/ uregelmessig pakning av partikler øker eddy-diffusjonen: Dårlig pakning og/eller pakning av partikler med ulike størrelser og/eller uregelmessig form (vist her med sfæriske poly-disperse partikler) gir mer variable eddys mer sonespredning. 10
11 1. C. 1. Leddene i / bidragene til den forenklede van Deemter-ligningen 1.C.1. a. Eddy diffusjon, H e, i pakkede kolonner Prosess: Spredning av molekyler i MF-strømmen langs kolonna, fordi ulike individuelle molekyler følger ulike v eivalg gjennom pakningsmaterialet, ulike strømningslinjer (= Eddys ). Tanke-eksperiment (kan også utføres praktisk, f.eks. v.h.a. terningkast) Tegn opp den tilbakelagte veistrekningen (i tilfeldig fastsatte enheter) i MF-retning for 7 molekyler, A-G, av samme stoff som passerer gjennom ulike, tilfeldig valgte, strømningsveger. Dette finnes på It sl. : (Kap.01.C Teori, 'Dice - Rand.Walk' teor. Eksperiment). 11
12 1. C. 1. Leddene i / bidragene til den forenklede van Deemter-ligningen 1. C. 1. b. Longitudinal diffusjon, H L : H L = B/u = cl DM u M D M = Diffusjonskonstant i MF (for analytten) c L = prop.-faktor u M = MF-hastighet Prosess : (Vanlig) molekylær (termisk) diffusjon av (prøve-)molekylene fra områder med høy konsentrasjon av stoffet mot områder med lavere konsentrasjon, ved Kro.: fra sonen med høy konsentrasjon av prøve til den omkring- liggende mobile fasen. 12
13 1. C. 1. Leddene i / bidragene til den forenklede van Deemter-ligningen 1.C.1. b. Longitudinal diffusjon, H L : Prosess : (Vanlig) molekylær (termisk) diffusjon av (prøve-)molekylene fra områder med høy konsentrasjon av stoffet mot områder med lavere konsentrasjon, H L : B / u = cl DM u M Diffusjonen (distansen, sonespredningen) øker proporsjonalt med D MF, diffusjonskonstanten av analytt i MF en, og med diffusjons-tiden: lengre tid - mer diffusjon (lav u MF - lengre tid - mer diffusjon, og omv.) Stor D M Stor spredning, takket være raskere diffusjon. Stor u M kort oppholdstid lite tid til diffusjon og lite spredning. Typiske Diffusjonskonstanter [cm 2 /s] : Væsker (CCl 4 i metanol) : 0,0000192 Gass (n-oktan i N 2 ) : 0,073 13
14 1. C. 1. Leddene i / bidragene til den forenklede van Deemter-ligningen 1. C. 1. b. Longitudinal diffusjon, H L : Prosess : (Vanlig) molekylær (termisk) diffusjon av (prøve-)molekylene fra områder med høy konsentrasjon av stoffet mot områder med lavere konsentrasjon, Longitudinal? (longitudinal = i lengde-retningen, "langs kroppsaksen") Fordi diffusjonen i lengderetningen (retningen av MF-forflyttingen) er - den viktig(st)e for kromatografisk effektivitet - den som har direkte effekt på kromatografisk separasjon mellom soner/topper/bånd/flekker. 14
15 1. C. 1. Leddene i / bidragene til den forenklede van Deemter-ligningen 1. C. 1. c. Massetransport-termer, H MT : (også motstand mot massetransfer = Resistance to Mass Transfer, eller ikke-likevekts-term ) H MT = C u = cmt dp 2 umf D F D xf = Diffusjonskonst. av analytten i aktuell fase dp 2 = Partikkeldiameter av paknigs-materialet el. kolonnediameter for ikke-pakkede kolonner c MT = prop.-faktor u MF = MF-hastighet Prosess : "Resistance to Mass Transfer describes the band broadening caused by transporting the analytes by diffusion and convection from one phase to the other." E. Lundanes & al. : Chro. (2014) : p.7, Ch. 1.3.3. Alternative modeller: (i) Modell basert på molekylære prosesser (ii) Modell basert på konsentrasjonsprofiler (ikke-likevekts-modell): lite brukt i dag ikke diskutert her E. Lundanes & al. : Chro. (2014) : p., Ch.. 15
16 1.C.1. Leddene i / bidragene til den forenklede van Deemter-ligningen 1.C.1. c. Massetransport-termer, H MT : (også motstand mot massetransfer = Resistance to Mass Transfer, eller ikkelikevekts-term ) H MT : C u = cmt dp 2 umf D F Prosess : (i) Modell basert på molekylære prosesser Ad. Mod. (i) : Fordi massetransporten ( molekyl-forflyttingen ) inne i, og mellom fasene tar tid, (ikke er uendelig rask) forblir individuelle molekyler ulikt lenge i MF og i SF (store individuelle forskjell ved hver overgang mellom fasene). En runde SF MF SF tar da ulik lang tid og aktuelle molekyler har forflyttet seg ulike avstander. p.g.a. varierende oppholdstids-andel i MF Sonespredning 16
17 1.C.1. Leddene i / bidragene til den forenklede van Deemter-ligningen 1.C.1. c. Massetransport-termer, H MT : H MT : C u = cmt dp 2 umf D F Prosess : (i) Modell basert på molekylære prosesser Alternativt, mer generelt uttrykt: H MT : C u = c MT R(1-R) t (S M) u MF R = retarderingsfaktor, t (S M) = gjennomsnittlig omløpstid for et molekyl MF SF MF). der t (S M) = prop. d 2 d = sjikt-tykkelse av aktuell(e) fase(r ) D D = Diffusjonskonst. av analytt i aktuell(e) fase(r ) = prop.' ( dmf 2 + dsf 2 ) D MF D SF ( H MT : C u = c MT { (1+k) -1 (1+k) -2 } t (S M) u MF ) 17
18 1. C. 1. Leddene i / bidragene til den forenklede van Deemter-ligningen 1. C.1. c. Massetransport-termer, H MT : H MT : C u = cmt dp 2 umf D F Prosess : (i) Modell basert på molekylære prosesser H MT deles ofte (videre) opp i enkelt-bidrag (platehøyder, varianser) fra delstrekninger av en slik faseovergangs-syklus (SF MF SF) : H MT = H MF + H SF + H smf massetransport i MF : H MF, massetransport i SF : H SF og massetransport i stillestående MF : H smf 18
19 H MT : C u 1. C. 1. Leddene i / bidragene til den forenklede van Deemter-ligningen = cmt dp 2 umf D F 1. C. 1. c. Massetransport-termer, H MT (H MT = H MF + H SF + H smf ) Prosess : (i) Modell basert på molekylære prosesser Massetransport i MF : H MF, Bidrag fra massetransport gjennom MF - variasjoner av transporttiden fra faseovergang inn i MF til faseovergang ut av MF for de enkelte molekyl, pluss bidrag fra variasjon av hastigheten av (analytt-) molekylene innenfor MF ens parabolske laminare strømnings-hastighetsprofil). H MF = H m = = cmt dp 2 um D MF d P = partikkeldiameter (eller kolonnediameter) D MF = Diffusjons-konstant i MF u M = gjennomsnittshastighet av MF I pakkede kolonner brukes d P (n.b. kolonne-diameter er ±irrelevant) I åpne kapillærkolonner (WCOT-kol.) er partikkeldiameter uaktuell: kolonne-diameteren d c erstatter da d P. H MF kan da også utledes teoretisk (Golay-ligning), jfr. Læreboken (E. Lundanes & al.: Chro. (2014): p.7, Ch. 1.3.3.). 19
20 H MT : C u 1. C. 1. Leddene i / bidragene til den forenklede van Deemter-ligningen = cmt dp 2 umf D F 1. C. 1. c. Massetransport-termer, H MT (H MT = H MF + H SF + H smf ) Prosess : (i) Modell basert på molekylære prosesser Massetransport i SF : H SF bidrag fra massetransport inni / gjennom SF H SF = H S = csf df 2 um (for fordelings-kro.) D SF d f = SF-filmtykkelse D SF = Diffusjons-konstant i SF Sonespredning ved fordelings-kromatografi (når SF = væske): ved variasjoner av analytt-molekylers oppholdstid i SF, fra hver (individuelle) faseovergang inn i SF og til faseovergang ut av SF igjen. el. Sonespredning ved adsorpsjons-kromatografi (når SF = fast stoff): utledes fra kinetikken av analytt-molekylers adsorpsjons-/desorpsjons-prosess/-syklus på SF-overflaten. Men det hevdes at den kinetikken normalt er raskt og ikke bidrar noe særlig. 20
21 1. C. 1. Leddene i / bidragene til den forenklede van Deemter-ligningen 1. C. 1. c. Massetransport-termer, H MT (H MT = H MF + H SF + H smf ) Prosess : (i) Modell basert på molekylære prosesser Massetransport i stillestående MF : H smf (bidrag fra transport fra faseovergang til faseovergang i SF som står stille inne i porer o.l.) H smf = H sm = csmf dp 2 um D smf d P = Maks. dybde av stillestående MF i partikkelporene (tvers gjennom). Når et analyttmolekyl må diffundere fra ytre partikkeloverflaten til adsorpsjons-seter inne i porestrukturen i partikkelen (og så ut igjen). Primært relevant når smf = Væske - i porøse rel. store partikler (mindre - lite relevant i HPLC). 21
22 1. C. 1. Leddene i / bidragene til den forenklede van Deemter-ligningen 1. C. 1. c. Massetransport-termer, H MT (H MT = H MF + H SF + H smf ) Bidragene fra de ulike massetransport-prosessene varierer i ulike typer kromatografi (gass-, væske-kromatografi, SFC) for ulike typer dimensjoner i systemene (GLC: tykke / tynne SF-filmer) for ulike analytt-størrelser ("mikro-molekyler" / makromolekyler) 22
23 1. C. 1. Leddene i / bidragene til den forenklede van Deemter-ligningen 1.C. 1. c. Massetransport-termer, Oppsummering av relevante faktorer : u (se v.d.-plott) t (S M S) i C : jo kortere jo bedre! d P : i A : jo mindre jo bedre ( H prop. med dp ) i C : jo mindre jo bedre ( H prop. med dp 1 - dp 2 ) D M i B : jo mindre jo bedre ( H prop. med D M ) i C M : jo større jo bedre ( H. prop m. 1/D M ) d S : jo tynnere SF-sjikt jo bedre (H SF prop. m. d P 2 ) D S : jo større D S jo bedre (H SF prop. m. 1/D S ) R (el. k) i C S : størst bidrag omkring R 0,5 (k 1) 23
24 1. C. 1. Leddene i / bidragene til den forenklede van Deemter-ligningen 1.C. 1. c. Massetransport-termer, Oppsummering av relevante faktorer : Apropos d P : i A : jo mindre jo bedre ( H prop. med d p ) i C : jo mindre jo bedre ( H prop. med d p 1 - d p 2 ) Begrensning hvor langt ned en kan gå med d P : Trykkfallet = Motstand mot gjennomstrømning av MF setter grensen lineær MF-hastighet : u = Dp K 10 8 Dp : trykkfall L K : Kolonnepermeabilitet L : Kolonne-lengde : MF-viskositet K 10 8 dp 2 [mm] 24
25 1. C. 1. Leddene i / bidragene til den forenklede van Deemter-ligningen 1.C. 1. c. Massetransport-termer, Størrelsen av proporsjonalitetsfaktorene (c MT ) bestemmes også av de fysikalske egenskapene av pakningen: -størrelses-fordelingen (dispersjonen) : jo mere dispers, jo mindre homogen, desto dårligere pakningskvalitet og desto større sonespredning -partikkelformen (utvendig og innvendig)... Se mer: Kap. 1.E. 25
26 1. C. 1. Leddene i / bidragene til den forenklede van Deemter-ligningen E. Lundanes & al. : Chromatography,, Wiley-VCH, 2014, p.14-15, Ch. 1.8. " 1.8 Increased Performance Increased performance is usually related to higher speed, higher plate numbers, improved resolution, or higher sensitivity, although all these cannot be improved at the same time. Higher speed will reduce the time of analysis, but will increase the back-pressure and may reduce the plate numbers. In packed columns, small particles are preferred for high-speed purposes, since the van Deemter curve is more flat for small particles. Smaller particles in a packed column will increase the number of plates, but will also increase the backpressure. Longer columns will give higher plate numbers, but will increase the time of analysis and give higher backpressure. Reduced column inner diameter will increase the efficiency of open tubular columns, but not of packed columns. Thin films of stationary phase increase efficiency in GC. Increased temperature may be beneficial for the efficiency and peak shape and give lower backpressure in LC (but higher backpressure in GC). The maximum peak capacity is obtained with two-dimensional systems, at the cost of simplicity and some robustness. " 26
27 1.C. 2. van Deemter-kurven Bidragene og samlet effekt fra de ulike spredningsårsakene kan illustreres v.h.a. van Deemter-kurven 27
28 1.C. 2. van Deemter-kurven Bidragene og samlet effekt fra de ulike spredningsårsakene kan illustreres v.h.a. van Deemter-kurven Vekt av de forskjellige bidrag avhenger av type kromatografi : Sammenlign f.eks. LC og GC 28
29 1.C. 2. van Deemter-kurven Eksperimentell van Deemter kurve (fra tidligere kromatografikurs-lab.-eksperiment): h : x : u : A = B/u = C.u = "Platehøyde", HETP (mm) Eksperimentelle verdier Gasshastighet (ml/min). Bidrag fra "Eddy"-diffusjon Bidrag fra longitudinal diffusjon Bidrag fra motstand mot massetransfer (ikke-likevekt mellom fasene). 29
30 1.C. 3. Noen varianter av van Deemter-likningen (av enda flere) Originalen: Koblet van Deemter-likning : Prøver å ta hensyn til at ofte Eddy-termen A ikke opptrer/bidrar helt uavhengig av MF-hastigheten: H = 1 + B + (C sm + C s ) u (1/A + 1/C m u) u Bidraget av A antas egentlig å avta med minkende u, fordi molekylær diffusjon (på tvers, transversal) gjør at molekyler bytter 'eddy' ofte. Dermed antas at ulikhetene av eddy ene utjevnes statistisk for molekylene mer, enn når transversal diffusjon skjer lite (over alt for kort tid). "Koblingen" er da mellom Eddy-diffusjon og massetransfer i MF. 30
31 1.C. 3. Noen Varianter av van Deemter-likningen (av enda flere) Originalen: van Deemter-likning for åpne (kapillær-) kolonner. Ingen pakning/ ingen partikler er tilstede bidrag fra Eddy-diffusjon og C smf termen faller bort. forenklet : H = B + (C m + C s ) u u (den (forenklede) Golay-likningen) eller mer utformulert : H = 2 D m + q k d 2 f u + (1 + 6k + 11k 2 ) d 2 c u u (1+k) 2 D s 96 (1 + k) 2 D m Disse likningene (for åpne kapillærrør) kalles Golay-likning(er), etter Marcel Golay som var den første til å utlede dem teoretisk for åpne kapillær-kolonner (og den første som lyktes å vise et kapillær-gc-forsøk). 31
32 1.C. 3. Noen Varianter av van Deemter-likningen (av enda flere) Noen (flere) alternative Rate Equations for kromatografi: J.M.Miller (1988), Chromatography, Concepts & Contrasts, p. 30 (Wiley) 32
33 1.C Fysiske årsaker til sonesprednin 1.C. 3. Sonesprednings-bidrag fra utenfor kolonnen Når sonespredning kan summeres av H-bidrag fra ulike stokastiske prosesser kan eksterne bidrag håndteres på samme måte: H = H i = H E + H L + H MT-MF + H MT-SF + H MT-sSF + H ekst Bidrag til H ekst kan være fra: 1. prøve-appliseringen / injeksjonen (selve prøvevolum, eller appliserings-kammeret (injektoren)) 2. transport av MF og prøve utenfor kolonnen (f.eks. ledninger, koblinger). 3. deteksjonen/detektoren, enten 'dødvolum' med re-miksing av soner, eller for stort deteksjonsvolum (med unødig lang oppholdstid, el. plass til flere, separerte, topper samtidig)). 4. signalbehandling, treg elektronikk (bygget slikt) eller feiljustert parameter (for høy signaldemping) longitudinal spredning: ideell ---- ("plugg") reell ------------- (parabolsk) spredning i ledninger som er for vide eller lange. Årsaken for 1.-3. (som regel) : 33