Evaluering av ny metode for deteksjon av leukocytter i blodkomponenter Spesialbioingeniør Maria Johansson Seksjon for komponentfremstilling Avdeling for immunologi og transfusjonsmedisin Oslo universitetssykehus, Ullevål Overlege Geir Hetland, Seksjon for komponentfremstilling Avdeling for immunologi og transfusjonsmedisin, Oslo universitetssykehus, Ullevål Overlege Thomas Larsen Titze, Seksjon for immunhematologi Avdeling for immunologi og transfusjonsmedisin, Oslo universitetssykehus, Ullevål Evaluering av ny metode for deteksjon av leukocytter i blodkomponenter, Macopharma Leucocount (reagens), Puls AS FACS Canto II (flowcytometer), Puls AS Reagens 25 ml Trucount glass 1
Evaluering av ny metode for deteksjon av leukocytter i blodkomponenter Likheter og forskjeller mellom metodene Analyseoppsett Resultater Oppsummering Forskjell Oppstart og vedlikehold Det er ikke noe vedlikehold på instrumentet og det kan brukes noen få minutter etter at det er slått på. Flowcytometer Det må gjøres vedlikehold daglig, ukentlig og månedlig. Instrumentet må varmes opp i flere minutter før det kan brukes. 2
Likhet Prøvemateriale Det kan analysere prøver fra: Leukocyttreduserte erytrocyttkonsentrat Leukocyttreduserte trombocyttkonsentrat Plasma Det brukes 100 ul prøve til hver analysering. Likhet Kontroller Det kan brukes de samme kontrollene: Kommersielle kontroller Egne kontroller Eksterne kontroller 3
Likhet Reagens Det brukes 400 ul reagens per analysering. Reagenset innholder de samme komponentene: Detergent åpner cellemembranene. RNAse bryter ned RNA Propidiumiodid er fluorokromet som fester seg til DNA. Forskjell Reagens Reagensglassene til Leucocount inneholder en kjent konsentrasjon av fluoreserende kuler. r Slide til har et fast volum. 4
Forskjell Inkubasjon av prøven : Leucocount: 4 7 minutter 5 120 minutter Forskjell Analyseringstid av prøven : 2,5 3 minutter Leucocount: 1,5 2 minutter Forskjell Avlesningsprinsipp Flowcytometer 5
Forskjell Analyseringsvolum Volum av den preparerte prøven som analyseres på instrumentet er ca 57 µl. (ca 11,4 µl av primærprøven) Leucocount Volum av den preparerte prøven som analyseres på instrumentet er ca 88 µl. (ca 17,6 µl av primærprøven) Forskjell Innmating av prøver : Manuelt en og en prøve. Leucocount: Karusell med en serie av prøver eller manuelt. 6
Analyseoppsett Det ble målt leukocytter i erytrocyttkonsentrat, trombocyttkonsentrat og plasma. Prøvene ble spiket med leukocytter fra prøver tatt på ACD glass slik at de fikk forskjellige konsentrasjoner. Prøvene ble analysert parallelt ved hjelp av ADAM og Leucocount. Presisjonen ble testet ved at noen prøver ble analysert flere ganger på. Analyseoppsett Prøvene fra erytrocyttkonsentrat og trombocyttkonsentrat ble spiket med leukocytter slik at de fikk en konsentrasjon mellom 0 50 celler/µl. Prøver fra plasma ble spiket med leukocytter slik at de fikk en konsentrasjon mellom 0 120 celler/µl. Det ble i tillegg tatt prøver fra 5 produkter fra vår normale produksjon de aktuelle dagene. 7
Erytrocyttkonsentrat Trombocyttkonsentrat Plasma Leucocount Prøve (celler/mikroliter) (celler/mikroliter) 1 0,00 0,00 2 0,00 0,00 3 0,00 0,00 4 0,00 0,00 5 0,00 0,00 6 1,53 1,20 7 2,22 2,32 8 4,20 3,81 9 7,10 6,11 10 12,61 7,83 11 16,13 12,99 12 19,26 16,70 13 22,04 22,72 14 28,23 25,21 15 32,38 28,14 16 31,81 34,42 17 40,50 34,68 18 42,49 46,12 19 53,28 50,69 20 56,12 56,11 21 0,74 0,51 22 1,82 1,72 23 2,50 1,80 24 2,95 2,15 25 4,03 3,01 26 3,75 3,70 27 4,94 4,04 28 5,74 5,59 29 1,48 1,03 30 2,33 2,23 31 2,95 2,32 32 3,35 2,49 33 4,54 4,64 34 6,13 6,19 35 8,52 6,83 Resultater Leucocount Prøve (celler/mikroliter) (celler/mikroliter) 1 0,45 0,17 2 0,85 0,34 3 1,02 0,94 4 0,00 0,08 5 0,00 0,00 6 1,19 1,63 7 2,39 3,95 8 4,09 4,13 9 5,34 5,76 10 9,20 12,04 11 15,45 16,26 12 19,26 19,88 13 24,37 20,31 14 26,41 30,72 15 31,24 32,01 16 33,17 37,26 17 41,12 44,23 18 47,20 51,89 19 55,49 57,68 20 59,53 64,54 21 1,25 1,47 22 2,39 3,09 23 3,86 4,30 24 4,71 4,64 25 4,94 4,81 26 6,42 6,40 27 8,29 6,45 28 8,18 8,52 29 1,53 1,54 30 2,67 3,63 31 3,12 5,07 32 4,71 5,09 33 6,13 5,68 34 7,84 7,91 35 8,92 9,46 Leucocount Prøve (celler/mikroliter) (celler/mikroliter) 1 4,88 6,36 2 7,33 7,31 3 32,77 30,72 4 13,29 14,45 5 3,07 3,63 6 2,95 3,87 7 6,36 6,71 8 11,81 11,53 9 16,47 20,56 10 22,49 22,46 11 26,75 30,44 12 53,79 48,62 13 57,99 60,07 14 55,66 50,60 15 60,09 63,51 16 69,58 69,62 17 75,66 74,35 18 80,88 83,91 19 99,51 105,16 20 102,52 107,50 21 79,41 84,34 22 83,10 92,43 23 79,41 93,03 24 94,17 97,47 25 99,57 105,94 26 105,70 110,24 27 111,50 114,29 28 90,77 89,67 29 89,29 96,81 30 95,54 96,81 31 99,29 104,04 32 109,68 115,66 33 114,11 120,40 34 117,80 117,73 35 122,92 120,74 Erytrocyttkonsentrat Prøve Leucocount 1 0,74 0,51 2 1,48 1,03 3 1,53 1,20 4 1,82 1,72 5 2,22 2,32 6 2,33 2,23 7 2,50 1,80 8 2,95 2,15 9 2,95 2,32 10 3,35 2,49 11 3,75 3,70 12 4,03 3,01 13 4,20 3,81 14 4,54 4,64 15 4,94 4,04 16 5,74 5,59 17 6,13 6,19 18 7,10 6,11 19 8,52 6,83 leukocytter / mikroliter 9 8 7 6 5 4 3 2 1 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 prøve Leucocount Det er en statistisk forskjell mellom metodene i det aktuelle måleområdet. 8
Presisjon erytrocyttkonsentrat Prøve Analysering 1 Analysering 2 Analysering 3 6 1,20 1,11 1,97 7 2,32 2,58 1,63 8 3,80 4,32 4,47 9 6,11 5,42 6,19 10 7,83 11,18 9,29 Det er ikke noen statistisk 4 forskjell mellom målingene i 3 det aktuelle måleområdet. 2 1 P = 0,947 0 leukocytter / mikroliter 12 11 10 9 8 7 6 5 Analysering 1 Analysering 2 Analysering 3 Prøve 6 Prøve 7 Prøve 8 Prøve 9 Prøve 10 Konklusjon erytrocyttkonsentrat Hvis svarene blir korrigert med en faktor på 1,25 kan brukes til telling av leukocytter i leukocyttreduserte erytrocyttkonsentrater. Den største differansen vi fant mellom metodene var 0,71. Mean for prøvene som ble målt var 3,25. For en prøve som blir målt til 3,25 på må svaret korrigeres med 0,218 (=0,71/3,25) for å få det samme resultatet som om prøven hadde vært målt med Leucocount. Man kan bruke en faktor på 1,25 som er noe høyere en den som ble beregnet for å være sikker på at man ikke overser et resultat som muligens kan være så høyt at et tiltak må igangsettes. 9
Trombocyttkonsentrat Prøve Leucocunt 1 0,45 0,17 2 0,85 0,34 3 1,02 0,94 4 1,19 1,63 5 1,25 1,47 6 1,53 1,54 7 2,39 3,95 8 2,39 3,09 9 2,67 3,63 10 3,12 5,07 11 3,86 4,30 12 4,09 4,13 13 4,71 4,64 14 4,71 5,09 15 4,94 4,81 16 5,34 5,76 17 6,13 5,68 18 6,42 6,40 19 7,84 7,91 20 8,18 8,52 21 8,29 6,45 22 8,92 9,46 23 9,20 12,04 leukocytter / mikroliter 13 12 11 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 prøve Leucocount Det er ikke noen statistisk forskjell mellom metodene i det aktuelle måleområdet. Presisjon trombocyttkonsentrat Prøve Analysering 1 Analysering 2 Analysering 3 3 0,94 1,03 0,94 6 1,63 1,81 1,75 7 3,94 2,60 2,23 8 4,13 4,01 4,04 9 5,76 6,83 7,14 Det er ikke noen statistisk forskjell mellom målingene i det aktuelle måleområdet. leukocytter / mikroliter 8 7 6 5 4 3 2 1 Prøve 3 Prøve 6 Prøve 7 Prøve 8 Prøve 9 P = 0,999 0 Analysering 1 Analysering 2 Analysering 3 10
Konklusjon trombocyttkonsentrat kan brukes til telling av leukocytter i leukocyttreduserte trombocyttkonsentrater. kan brukes til måling av leukocytter i det aktuelle måleområdet uten at svarene blir korrigert med en faktor. Plasma Prøve Leucocount 1 69,58 69,62 2 75,66 74,35 3 79,41 84,34 4 79,41 93,03 5 80,88 83,91 6 83,10 92,43 7 89,29 96,81 8 90,77 89,67 9 94,17 97,47 10 95,54 96,81 11 99,29 104,04 12 99,51 105,16 13 99,57 105,94 14 102,52 107,50 15 105,70 110,24 16 109,68 115,66 17 111,50 114,29 18 114,11 120,40 19 117,80 117,73 20 122,92 120,74 leukocytter / mikroliter 130 120 110 100 90 80 70 60 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 prøve Leucocount Det er en statistisk forskjell mellom metodene i det aktuelle måleområdet. 11
Presisjon plasma Prøve Analysering 1 Analysering 2 Analysering 3 14 50,66 53,45 52,74 15 63,51 63,42 61,18 16 69,62 66,61 71,77 17 74,35 75,67 74,78 18 83,91 81,89 84,40 Det er ikke noen statistisk forskjell mellom målingene i det aktuelle måleområdet. leukocytter / mikroliter 90 85 80 75 70 65 60 55 Prøve 14 Prøve 15 Prøve 16 Prøve 17 Prøve 18 P = 0,994 50 Analysering 1 Analysering 2 Analysering 3 Konklusjon plasma kan brukes til telling av leukocytter i plasma hvis svaret korrigeres med en faktor på 0,94 eller om grensen for kassasjon av plasma endres til 106 celler/µl. Det er mulig å korrigere denne forskjellen ved hjelp av en faktor. Den største differansen vi fant mellom metodene var 5,81. Mean for prøvene som ble målt var 100. For en prøve som blir målt til 100 på må svaret korrigeres med 0,0581 (=5,81/100) for å få det samme resultatet som om prøven hadde vært målt på flowcytometer. Man kan bruke en beregnet faktor på 0,94 for å være sikker på at man ikke overser et resultat som muligens kan være så høyt at et tiltak skal igangsettes. Eller man kan endre tiltaksgrensen fra 100 celler/µl til 106 celler/µl. 12
Oppsummering Erytrocyttkonsentrat Hvis svarene blir korrigert med en faktor på 1,25 kan brukes til telling av leukocytter i leukocyttreduserte erytrocyttkonsentrater. Trombocyttkonsentrat kan brukes til telling av leukocytter i leukocyttreduserte trombocyttkonsentrater. Plasma kan brukes til telling av leukocytter i plasma hvis svaret korrigeres med en faktor på 0,94 eller om grensen for kassasjon av plasma endres til 106 celler/µl. Referanser 1. ADAM rwbc INSTRUCTION MANUAL, NESMU-ARC- 001E, V.3.1 DES 2013 2. Pakkningsvedlegg BD Leucocount KIT, BD Biocsiences, versjon 06/2015 3. BD FACS Canto II Flow Cytometer Reference Manual, BD Biosciences, Rev.A June 2007 4. Forskrift om tapping, testing, prosessering, oppbevaring, distribusjon og utlevering av humant blod og blodkomponenter og behandling av helseopplysninger i blodgiverregistre (blodforskriften), januar 2016 13