Legionellaseminar Brønnøysund 06.11.2014 Prøvetaking, analysemetoder og svartid på Legionellaprøver. v/ Anne Kristin Gussiås, fagansvarlig analytiker mikrobiologi
Disposisjon Laboratoriene, Kvalitetssikring / Akkrediteringsprosessen Prøveuttak Oppbevaring og transport Analysemetoder Erfaringer fra Kystlab-preBIO Oppsummering
Avdelinger som utfører analysen i Kystlab-preBIO AS Avdelingene Kristiansund, Fosen og Namsos Avd. Kristiansund er akkreditert etter ISO 11731-2, Water quality- Detection and enumeration of Legionella - Direct membrane filtration method for waters with low bacterial counts. Avd. Fosen utfører etter samme metode, men uakkreditert. Avd. Namsos utfører PCR-metode. Metoden er utviklet av SINTEF v/ Catrine Ahlèn. Semikvantitativ metode for Legionella spp. Kvalitativ metode for Legionella pneumophila
Kvalitetssikring / Akkrediteringsprosess Parallellkjøring med annet akkreditert laboratorium Internkontroll med anerkjente legionellastammer Analyse av RM, referansemateriale Deltagelse i SLP, sammenlignende laboratorieprøvinger Søknad til NA, Norsk Akkreditering Bedømming, gjennomgang av metoden av teknisk bedømmer mikrobiologi Godkjent og analysen akkreditert fra 2011 for avd. Kristiansund Avd. Fosen har utført analysen siden 2012 Avd. Namsos har utført analysen siden 2004 Løpende kontroller
Prøvetaking - Legionella Hvilke prøvepunkt velger man? Man bør foreta en risikovurdering og finne de punktene der det er størst sannsynlighet for oppvekst av Legionella. Prøvested bør lokaliseres nærmest mulig områder der den tekniske og prosessmessige gjennomgangen indikerer at vekstbetingelsene for legionellabakterien kan være tilstede. Installasjoner som danner aerosol. Kilde: Vannrapport 118 fra Folkehelseinstituttet
Prøvetaking - Legionella Hvor? F. eks. tappepunkt (dusjer) som sjelden er i bruk eller som ikke er i bruk i det hele tatt i nærheten av blindrør tappepunkt lengst unna varmtvannsbereder Boblebad Bilvaskeanlegg, høytrykkspylere. Fontener, osv Når? Rutinemessig, kartlagt i risikovurderingen Ved mistanke om utbrudd
Prøvetaking - Legionella Prøvetaking vannprøver Utstyr: steril vannprøveflaske m/natriumtiosulfat, helst 1000 ml Dusj/servantbatteri: Fyll flasken nesten helt opp uten å la vannet renne først Skal ha med det vannet som er i dusjhodet Ikke berør kork eller flaskemunning innvendig
Prøvetaking - Legionella Varmtvannsbereder/-beholder: Ta prøve gjennom tappe- eller sikkerhetsventil Prøv å få med slamholdig vann fra bunnen av beholderen
Prøvetaking - Legionella Kjøletårn: Tas fortrinnsvis fra toppen av kjøletårnet Hvis ikke i drift, tas vannet fra bassenget i bunnen Bør tas prøve av belegget innvendig i kjøletårnet Er det mistanke om utbrudd, ta prøve før desinfeksjon av anlegget blir gjort OBS! bruk maske med filter, beskyttelsesklasse P3 (CE-klasse EN 143)
Prøvetaking - Legionella Prøvetaking biofilm Utstyr: Steril svaberpinne Skru av dusjhodet og ta prøve av synlig grums/belegg vha svaberpinnen Dersom synlig grums/belegg ikke finnes, føres svaberpinnen med roterende bevegelser over de indre flatene av f. eks dusjhodet/-slangen Etter prøvetaking stikkes svaberpinnen ned i røret med transportmedium
Oppbevaring og transport av prøver - Legionella Transport/levering av prøven: Prøven(e) leveres raskes mulig til laboratoriet Tid fra uttak til analysestart: Snarest, helst innen 1 døgn. Men tillatt inntil 48 timer fra prøvetaking. Oppbevaring/transport: Kjølig, 5 C ± 3 C, unngå sollys Varmtvannsprøver kjøles ned etter uttak
Følgeskjema - Legionella Følgeskjema med riktige opplysninger er viktig! - Kunde - Prøvetaker - Dato / kl. - Prøvemerking - Svar- og fakturaadr.
Analysemetoder og svartid - Legionella Analysemetoder Dyrkningsmetoden ISO 11731 og ISO 11731-2 Vannprøver filtreres, 10-1000 ml, vanligvis 500 ml Syrebehandler filteret for å hemme uønsket vekst Skylling med nøytral løsning Overføre filteret til en agarskål Agarskålen inkuberes ved 36 + 2 C i inntil 10 døgn Avlesning første gang etter 3-4 døgn Sekundær dyrkning, verifisering
Analysemetoder og svartid - Legionella Fordeler - Dyrkningsmetode Påviser levende bakterier Kan identifisere spesifikk legionellaart/serogruppe Bedre referansegrunnlag mht tolking av analyseresultat Ulemper - Dyrkningsmetode Bekreftet svar tar lang tid (Men; oftest vekst etter 3-4 dager på positive prøver) Tap av bakterier ved filtrering Andre bakterier undertrykker legionellavekst
Analysemetoder og svartid - Legionella Svartid - Dyrkningsmetode 5 10 dager, kan ta inntil 12 dager ved negativt svar
Analysemetoder og svartid - Legionella Analysemetoder PCR (Polymerase Chain Reaction) Vannprøven konsentreres (Filtrering eller sentrifugering) Alt arvestoff (DNA) i vannprøven isoleres Evt Legionella DNA påvises med PCR-teknologi
Analysemetoder og svartid - Legionella Fordeler - PCR Hurtig Svar samme dag hvis prøven startes om morgenen. Følsom, kan påvise lave konsentrasjoner av legionellabakterier. Nyttig for å kontrollere om rengjøring og desinfeksjon har vært effektivt
Analysemetoder og svartid - Legionella Ulemper - PCR Påviser også døde bakterier Kan ikke gi informasjon om hvilken serogruppe legionellabakterien tilhører Kan ikke benyttes alene ved smittesporing Enkelte prøver kan inneholde stoffer som inhiberer PCR-reaksjonen Tolke analyseresultat
Analysemetoder og svartid - Legionella Ulike PCR metoder Real time PCR kan kvantifisere den opprinnelige mengden DNA i prøven Reverse-Transcriptase (RT) PCR kan bestemme om bakterien er levende eller død. RT PCR baseres på analyse av RNA, som finnes bare i levende bakterieceller. Oppgis som GU/l (genomisk enhet), som er arvematerialet fra en bakterie.
Analysemetoder og svartid - Legionella Svartid PCR Analysetid 1-2 dager, avhenger av når på dagen prøven kommer inn til laboratoriet. Ved positivt resultat med PCR metoden må dyrkningsmetoden startes i etterkant for å finne hvilken serogruppe Legionellene tilhører. Ved utbrudd der man skal sammenligne legionellastammer fra miljø- og pasientprøver, må dyrkningsmetoden benyttes.
Analysemetoder og svartid Kimtall 36 Kimtall 36 C (totalantall bakterier og sopp) Omtalt i FHIs veileder Forebygging av legionallasmitte En veiledning Metode: NS-EN ISO 6222 Innstøpningsteknikk Analysetid: 2 døgn Gir ingen informasjon om det er legionellabakterier i systemet Kan anses som en generell hygieneparameter
Analyserapporten Analyserapporten Laboratoriet opplever at mange kunder synes det er vanskelig å tolke resultatene Analyserapporten gir ingen opplysninger om grenseverdier eller anbefalte verdier Det finnes ingen nasjonale grenseverdier Se på hvor mange prøver det er påvist Legionella i
Bruk av resultatene Analyserapporten For kimtallsanalysen kan kunden danne seg et bilde over tid for hva som er normalverdier for sitt anlegg og om det viser en trend (voksende/synkende) Ved stabile resultater over tid kan man vurdere å gå ned på antall prøver pr. år
Prøvetaking, analysemetoder og svartid - Legionella Aftenbladet.no 23.5.2014
Erfaring fra avd. Namsos Majoriteten av innleverte prøver er fra dusjer fra kommunale bygg, f.eks skoler. 2014: Funn av Legionella spp. i 50 % av prøvene (semikvant. metode) 2014: Ingen funn for Legionella pneumophila (kvalitativ metode)
Erfaring fra avd. Kristiansund Majoriteten av innleverte prøver er fra dusjer i offentlige dusjanlegg, institusjoner og skip. 2011: Funn av Legionella i 19 % av prøvene 2012: Funn av Legionella i 34 % av prøvene 2013: Funn av Legionella i 19 % av prøvene 2014: Funn av Legionella i 11 % av prøvene (pr.27.oktober) I tillegg er det analysert noen svaberprøver fra innretninger som har dyser som sprer aerosol.
Erfaring fra avd. Kristiansund Fordelingen av antall cfu/ 500 ml fra de positive prøvene Legionella cfu/500 ml 2011 2012 2013 2014 0 cfu <resultat < 10 cfu 53% 16% 28% 33% 10 cfu < resultat < 100 cfu 29% 29% 31% 38% 100 cfu < resultat < 1000 cfu 16% 40% 38% 27% 1000 cfu < resultat 3% 16% 3% 1%
Erfaring fra avd. Kristiansund 2012 Diagram Legionella / Kimtall 36 C Dusjvann 18000 16000 14000 12000 10000 8000 6000 4000 2000 7000 6000 5000 4000 3000 2000 1000 kim/ ml legio nella /500 ml 0 0 10 20 30 40 50 60 70 0
Hva kjennetegner dusjanlegg med problemer Gjentagende påvisninger (fra 1 1000 cfu/500 ml) Ingen klar sammenheng mellom påvisning av Legionella og høye verdier av totalantall bakterier. Gjerne langt rørstrekk etter innblanding av kaldt vatn. Ikke mulig å stille temperatur på dusjene (ca 38 C ut).
Erfaring fra Kystlab-preBIO Kunnskap om legionellabakterien Hvor den kan etablere seg Hvordan den smitter Bedre opplæring av prøvetakere Metode for prøvetaking Riktig emballasje Velge et representativt antall prøvepunkt Kunnskap om tiltak når det påvises legionellabakterier i prøven Fokus på å utføre prøvetaking for å verifisere effekten av tiltak
Kontaktinformasjon Kystlab-preBIO AS tlf.: 71 25 05 00 Avd. Namsos tlf.: 74 21 24 40 Axel Sellægs vei 3 e-post: namdal@prebio.no 7800 Namsos Avd. Brønnøysund tlf.: 75 00 98 00 Lenningsveien 27 e-post: helgeland@prebio.no 8900 Brønnøysund
Kontaktinformasjon Kystlab-preBIO AS tlf.: 71 25 05 00 Avd. Fosen tlf: 73 85 62 10 7113 Husbysjøen e-post: fosen@prebio.no Avd. Kristiansund tlf.: 92 47 92 92 Wilhelm Dallsvei 50 e-post: 6511 Kristiansund kystlab.kristiansund@kystlab.no
Oppsummering Riktig prøvetaking på riktig prøvepunkt Transporteres kjølig til lab, helst innen 24 timer Analyseres for Legionella spp. Avd. Kristiansund finner Legionella i ca. 20% av prøvene de analyserer Kan supplere med Kimtall 36 C, anse den som generell hygieneparameter Kimtall er ingen indikatorparameter for om det finnes Legionella bakterier De mikrobiologiske analysene er et supplement til kunnskapen om tekniske og prosessmessige forhold. Takk for meg!