Hormonmålinger Analyseprinsipper, kvalitetskontroll og referanseområder Bjørg Almås, Dr. scient, FoU-leder Hormonlaboratoriet (HUS) 1
Hormonlaboratoriet, Laboratoriebygget Haukeland Universitetsykehus 2
Hormonlaboratoriet, Haukeland Universitetsykehus Landets eldste Hormonlaboratorium Ca 50 forskjellige analyser Rutineanalyser: Seksjon for automat- og spesialanalyser Seksjon for kromatografiske analyser og massespektrometri FoU Hormoner og brystkreft Fedme og metabolisme Molekylær endokrinologi Vitamin D, osteoporose og hyperparathyroidisme Massespektrometri og steroidhormoner Utvikling av massespektrometriske analyser (LCMSMS). 3
Hormoner proteiner og peptider Det endokrine system biogene aminer (aminosyreanaloger), metabolitter lipider; steroider, vitamin D 4
Analyseprinsipper, metoder Immunokjemiske metoder Analyse av: Proteiner, peptidhormoner, steroider HPLC-metoder (high performance liquid chromatography) Analyse av: Biogene aminer og metabolitter, steroider 5
Analytter Komponenter i immunokjemiske teknikker hormoner proteiner, enzymer, vitaminer, medikamenter, tumormarkører, virus og bakterier Antistoffer polyklonale (Pab) monoklonale (Mab) rekombinante 6
Produserer kjemiluminescens Enzym: peroxidase eller alkalisk fosfatase 7
Immunoassay for intakt PTH (sandwich-metode) Coated Bead PTH PTH PTH * * Chemiluminescence Label antibody antibody * 8
Kompetitiv metode Konsentrasjonen av antistoffet er begrensende Merket tracer antigen tilsettes, bindingsetene på antistoffet mettes Umerket antigen (prøve) tilsettes; konkuranse mellom merket tracer og umerket antigen Mengde tracer bundet til antistoff minker med økende konsentrasjon av umerket antigen 9
Immunokjemiske analyser Automatiserte analyser(immulite) Benkemetoder (RIA, ELISA) F.eks fertilitet F.eks 1,25 (OH) 2 vitamind, TRAS, AMH 10
Immunokjemiske metoder + Kan ofte måles direkte i prøve Automatisering og kort analysetid Godt antistoff = god analyse!! Indirekte måleletode Kryssreaksjoner (nedsatt spesifisitet) Bindingsaffinitet til antistoff kan påvirkes av flere faktorer 11
Kromatografiske metoder Kromatografisk separasjon av analytter gjennom kolonne Figur: Kromatografisk separasjon av komponenter i blekk Analyttene vil ha ulik vandringshastighet gjennom kolonnen, avhengig av deres kjemiske egenskaper Forbehandling av prøven er ofte nødvendig
HPLC-system HPLC: High Performance Liquid Chromatography 13
MS/MS Tandem Mass Spectrometry MS 1 MS 2 + + + + + + + + + + Multiple Reaction Monitoring (MRM) Kollisjonsquadrupol Nitrogen M + F + Bare forbindelser med overgangen M + F + blir detektert 14
Syntese av steroidhormoner i binyrebark 15
Kromatogram Steroidmetode LCMSMS Paal Methlie sept 2010 16
Rutinemetoder LCMSMS Nåværende metoder Kortisol spytt (2008) Kortisol urin (2008) Serum: 25(OH) VD (2009) Testosteron (2011) Androstendion (2012) 11-DOC (2013) 17-OH-progesteron (2013) Progesteron (2013) Kortisol (2013) Planlagt Østradiol Aldosteron Steroidpanel i spytt Katekolaminer Metanefriner (urin, plasma) 5-HIAA (døgnurin)
LCMSMS-metoder ++ Direkte målemetode Gullstandard!! Svært sensitiv og spesifikk Standardisering mellom laboratorier Kan ofte måle flere analytter i samme «run» (multipleksing, metabolomics) Dyrt utstyr Lang metodeutvikling, ressurskrevende Kompleks metode (fire trinn, kan være tidkrevende) Kompetansekrevende Økt kvalitet, pasientsikkerhet!!!! 18
Hva kan påvirke analysesvaret? Interferens: : samspill mellom to eller flere bølgebevegelser Effekten av en substans som finnes i det analytiske systemet og som forårsaker et avvik av målt verdi fra sann verdi. Hook-effekt Kryssreaktivitet Heterofile antistoffer/autoantistoffer Matrix-effekt Immunologiske metoder mest utsatt 19
Matriks-effekter Matriks = omgivelser, miljø Matrikseffekt kan bl.a. forårsakes av: Reagenser i målesystemet Proteiner i blodprøven Medikamentbruk (naturpreparater) Antikoagulanter Hemolyse, lipemi Kosthold 20
Bindingsproteiner Mange hormoner foreligger i serum bundet til spesifikke transport/bindingsproteiner Øker løselighet av hormonet, modulerer levetid og biologisk effekt Kan interferere med assay og tolkning! Den frie, ubundne fraksjonen er den biologisk aktive (sant eller usant.?)
Hormonanalyse: beregning eller måling av fri fraksjon Beregning av fri fraksjon: Eks: Testosteron/SHBG Beregner indeks: ratio analytt/bindingsprotein Direkte måling av fri fraksjon: Eks: ft4 Immunologisk assay for måling av FT4 Formler som tar utgangspunkt i bindingsaffinitet (bindingskonstanter) mellom analytt og bindingsprotein Måling i spytt?
Kvalitetssikring av hormonanalyser «Hormonlaboratoriet skal tilstrebe optimal kvalitet på de tjenestene som utføres, gjennom et systematisk og kontinuerlig arbeide med kvalitetsstyring og kvalitetssikring.» Kvalitetssystemer, kvalitetsmål (akkreditering) Kalibratorer Kontroller (daglige, langtids) Kontrolregler Eksterne kontroller, Labquality Statistikk, historiske data Validering av prøvesvar Obs: de fleste feil i analysesvar skyldes preanalytiske forhold!
Referanseområder Framkommer ved analyse av antatt friske personer. Vanligst: det sentrale persentilintervallet som omfatter 95% av verdienes fordeling. Ved normalfordeling av analyseresultatene kan grensene settes som ± 2 SD 24
Bimodal/flermodal fordeling av måleverdier kan reflektere forskjeller mellom kjønn, alder, kosthold, døgn, årstid, etniske grupper, BMI.. Innen subgruppen kan verdiene være normalt distribuerte 25
Hvordan etableres et Anbefalt: 120 personer i hver distinkte subgruppe Forenklet: 60 personer i hver distinkte subgruppe referanseområde? Omfattende og ressurskrevende prosess!! 26
Pediatriske referanseområder overførte referanseområder benyttes ofte pga vansker med å innhente nok prøver til å etablere eller verifisere referanseområdet Vanskelig å innhente prøver fra friske barn Mange subgrupper (alder, kjønn) Volumproblematikk større frekvens av hemolyse i prøver Annen sammensetning av matrix (bilirubin, lipider), voksne referanseområder bør ikke brukes uten videre OBS! Mange referanseområder i bruk, spesielt for barn kan være utarbeidet på foreldete metoder!!!! 27
What is CALIPER? CALIPER = Canadian Laboratory Initiative on Paediatric Reference Intervals Database A national initiative coordinated by clinical laboratories at The Hospital for Sick Children (SickKids, Toronto) and Children's Hospital of Eastern Ontario (CHEO, Ottawa). A research project among children s hospitals across Canada including Toronto, Ottawa, Hamilton, Montreal, St. John s, Saskatoon, and Vancouver. CALIPER purpose The purpose of the project is to establish a current and accurate database of reference intervals (normal values) that represent Canada s children and youth - multi-ethnic, males and females, from birth to 18 years.
A sensitive and rapid mass spectrometric method for the simultaneous measurement of eight steroid hormones and CALIPER pediatric reference intervals L. Kyriakopoulou, M. Yazdanpanah, D.A. Colantonio, M.K. Chan, C.H. Daly, K. AdeliClinical Biochemistry Volume 46, Issues 2013 642-651 http://dx.doi.org/10.1016/j.clinbiochem.2013.01.002 Age- and sex-specific trends in pediatric reference values for steroid hormones. Scatter plots showing age-related distribution of androstenedione, corticosterone, 11-deoxycortisol, 17- hydroxyprogesterone, 21- hydroxyprogesterone and cortisol.
Rekvirering av prøver Kliniske opplysninger viktig for validerende leger!!!!! 30
Takk for meg!!! 31