Er laboratorieanalyserne sikre?

Transkript

1 HORMONLABORATORIET - AKER UNIVERSITETSSYKEHUS - OSLO Er laboratorieanalyserne sikre? Forskerseminar om dopingforskning Odense, Peter Hemmersbach Hormonlaboratoriet Aker universitetssykehus og Farmasøytisk institutt Universitet i Oslo

2 HORMONLABORATORIET - AKER UNIVERSITETSSYKEHUS - OSLO Laboratorieanalyserne skal være sikre!!

3 HORMONLABORATORIET - AKER UNIVERSITETSSYKEHUS - OSLO Disposisjon Analytiske bevis muligheter og begrensninger Forbedring av analysemetoder Testosteron, erytropoietin, veksthormon Intern og ekstern kvalitetskontroll på laboratoriene WADA akkreditering

4 HORMONE LABORATORY - AKER HOSPITAL, OSLO, NORWAY Viktige spørsmålsord når dopingsaker undersøkes, vurderes og avgjøres: Hva? Hvorfor? Når? Hvordan? Hvor mye?

5 HORMONE LABORATORY - AKER HOSPITAL, OSLO, NORWAY Viktige spørsmålsord når dopingsaker undersøkes, vurderes og avgjøres: Hva? Hvorfor? Når? Hvordan? Hvor mye?

6 HORMONE LABORATORY - AKER UNIVERSITY HOSPITAL - OSLO - NORWAY Milepæl i antidopingarbeidet

7 HORMONLABORATORIET - AKER UNIVERSITETSSYKEHUS - OSLO Dopinglisten Dopingmidler som øker muskelvekst og styrke Anabol androgene steroider (testosteron, stanozolol) Veksthormon Dopingmidler som øker utholdenheten Stimulerende midler (amfetamin, efedrin) Midler som fører til økt antall røde blodlegemer (Erytropoietin [EPO], NESP, kunstig hemoglobin, bloddoping) Dopingmidler som virker som maskeringsmidler Hydroxyetylstivelse (HES) Vanndrivende midler

8 HORMONLABORATORIET - AKER UNIVERSITETSSYKEHUS Dopingmidler Kroppsegen Kroppsfremmed OH H N N H OH CH 3 HO O S H 2 N O Cl O H N O O Testosteron Stanozolol Furosemid OH NH 2 Amfetamin O R R = O HO R O O HO O HO O HO O R HO CH 2 CH 2 OH O OH HO O R O HO O Hydroxyetylstärke (HES) O HOO HO OH O R O

9 HORMONLABORATORIET - AKER UNIVERSITETSSYKEHUS Analyse av dopingprøver Analysematriks (blod og urin) Screening (ingen falske negative) Bekreftelse (ingen falske positive) A- og B-prøve Kromatografisk separasjon Massespektrometrisk deteksjon

10 HORMONLABORATORIET - AKER UNIVERSITETSSYKEHUS Gasskromatografi- Massespektrometri (GC-MS) Separasjonskolonne for gasskromatografi MS GC

11 HORMONLABORATORIET - AKER SYKEHUS Stimulantia og steroider: GC-MS påvisning Amfetamin Metandienon-M Amfetamin-M

12 HORMONLABORATORIET - AKER UNIVERSITETSSYKEHUS - OSLO Beta-blokkere og diuretika: LC-MS påvisning Massespektrum av diuretikumet Ethothiazid etter negativ electrospray-ionisasjon Massespektrum av beta-blokkeren propranolol etter positiv electrospray-ionisasjon W. Schänzer, M. Thevis. Chem. unserer Zeit 2004, 38,

13 HORMONLABORATORIET - AKER UNIVERSITETSSYKEHUS Gasskromatografi kombinert med høyoppløselig massespektrometri Screening: R = Bekreftelse: R = 20000

14 HORMONLABORATORIET - AKER UNIVERSITETSSYKEHUS Clenbuterol-funn c = 0,1 ng/ml ; R = Micromass, Autospec

15 HORMONLABORATORIET - AKER UNIVERSITETSSYKEHUS Identifikasjonsgrense En konsentrasjon på 0,1 ng/ml (300 pmol/l) tilsvarer 1/10 av en sukkerbit (0,25g) løst opp i et olympisk svømmebasseng.

16 HORMONLABORATORIET - AKER UNIVERSITETSSYKEHUS Welcome home! Første gang at kvinner konkurrerte under Olympiske leker på dette stedet (kule) Første gullmedaljevinner ble tatt for doping med stanozolol Korzhanenko, Russland

17 HORMONLABORATORIET - AKER UNIVERSITETSSYKEHUS Positive prøver under OL i Athen Russland Hviterussland Moldova Ukraina Ungarn Usbekistan Hellas Turkia Land Marokko Kenya India Myanmar Puerto Rico Idretter Baseball Boksing Bryting Friidrett Kajakk Vektløfting

18 Mean of place HORMONE LABORATORY - AKER UNIVERSITY HOSPITAL - OSLO - NORWAY The testing for anabolic steroids 21,00 20,50 20,00 19,50 19,00 has become more effective Results Shot Put Female *) Boycott of East European Countries **)Including disqualified athlete ( )* Olympic Games World wide signal for out-of-competition testing **

19 HORMONLABORATORIET - AKER SYKEHUS Identifikasjon av et dopingmiddel Analytisk funn i urin eller blod Bekreftet og identifisert ved hjelp av gass/væske kromatografi kombinert med massespektrometri Sammenlignet med referansestoff i samme matriks Basert på farmakologisk kunnskap Positiv dopingprøve??

20 HORMONLABORATORIET - AKER UNIVERSITETSSYKEHUS Interpretasjon av funnet Direkte bevis for inntak av et forbudt stoff Påvisning av kroppsfremmede stoffer f. eks. amfetamin, stanozolol, furosemid, HES, THG Indirekte bevis for inntak av et forbudt stoff Analyseresultater for kroppsegne stoffer f. eks. testosteron, nandrolon, erythropoietin, veksthormon.

21 HORMONLABORATORIET - AKER UNIVERSITETSSYKEHUS Forbedring av sikkerheten ved indirekte bevis Fastsettelse av en grenseverdi Nandrolon-metabolitter (2 ng/ml) (Cannabis) Testosteron (T/E>6 T/E/4)

22 HORMONLABORATORIET - AKER UNIVERSITETSSYKEHUS - OSLO Testosteron/epitestosteron Ratio (T/E) Distrbution of 3667 urinary T/E values collected during routine controls from male athletes. C. Ayotte et al. J. Chromatography B 687 (1996)

23 HORMONLABORATORIET - AKER UNIVERSITETSSYKEHUS Rettssikkerhet må ivaretas Fastsettelse av en grenseverdi Nandrolon-metabolitter Cannabis Testosteron Longitudinal oppfølging (Testosteron)

24 HORMONLABORATORIET - AKER UNIVERSITETSSYKEHUS - OSLO

25 HORMONLABORATORIET - AKER UNIVERSITETSSYKEHUS Rettssikkerhet må ivaretas Fastsettelse av en grenseverdi Nandrolon-metabolitter Cannabis Testosteron Longitudinal oppfølging (Testosteron) Videreutvikling av analysemetodikken

26 HORMONLABORATORIET - AKER UNIVERSITETSSYKEHUS Endogene steroider OH OH O Testosteron O Epitestosteron 1,1% av alle C-atomer har massetall 13, dvs 6 protoner og 7 neutroner. 20% av alle testosteronmolekyler inneholder en 13 C.

27 HORMONLABORATORIET - AKER SYKEHUS 12 C / 13 C forhold i testosteron δ13c = (R prøve - R PDB) / R PDB * C / 13 C forhold i endogent testosteron gjenspeiler dette forholdet i all mat vi spiser (δ 13 C -24 til -28) 12 C / 13 C forhold i syntetisk testosteron gjenspeiler dette forhold i utgangsproduktet for syntesen : soja (δ 13 C -30) PDB (Pee Dee belemnitt, Kalsiumkarbonat frasouth Carolina,i dag erstattet av CO 2 standard NBS 19.

28 HORMONLABORATORIET - AKER SYKEHUS MS deteksjon for bestemmelse av isotopforhold Finnigan MAT, 1998

29 HORMONLABORATORIET - AKER UNIVERSITETSSYKEHUS - OSLO Påvisning av testosteronmisbruk ved hjelp av Isotope Ratio Mass Spectrometry (IRMS) δ 13 C verdier for pregnandiol (o) og testosteronmetabolitter (, ) etter applikasjon av testosteronenantat. Shackleton, C. H. L.; Phillips, A.; Chang, T.; Li, Y., Steroids 1997, 62,

30 The Physiology of EPO maturation of red blood cells tissue hypoxia erythroblast increase stimulation reticulocyte Bone marrow reticulocyte Blood erythrocyte EPO in the kidneys decrease increase tissue oxygenation

31 HORMONE LABORATORY - AKER UNIVERSITY HOSPITAL - OSLO - NORWAY Visuell fremstilling av glykoproteiner

32 HORMONE LABORATORY - AKER UNIVERSITY HOSPITAL - OSLO - NORWAY Isoelektrisk fokusering (IEF) ph IEF-pattern of rhepo uhepo and NESP in urine

33 HORMONLABORATORIET - AKER UNIVERSITETSSYKEHUS Rettssikkerhet må ivaretas Fastsettelse av en grenseverdi Nandrolon-metabolitter Cannabis Testosteron Longitudinal oppfølging (testosteron, blodprofil) Videreutvikling av analysemetodikken Differensering mellom kroppens eget testosteron og tilført testosteron nandrolon og tilført nandrolon erytropoietin og tilført EPO

34 HORMONLABORATORIET - AKER UNIVERSITETSSYKEHUS Interpretasjon av positiv dopingprøve Direkte bevis for inntak av et forbudt stoff Påvisning av kroppsfremmede stoffer f. eks. amfetamin, stanozolol, furosemid, HES, NESP, THG Indirekte bevis for inntak av et forbudt stoff Analyseresultater for kroppsegne stoffer f. eks. testosteron, nandrolon, erythropoietin, veksthormon.

35 HORMONE LABORATORY - AKER UNIVERSITY HOSPITAL OSLO NORWAY Improving oxygen carrier properties Autologous and non-autologous blood transfusions 1980 s rhepo (Recombinant human erythropoietin) 1986 Darbepoietin eller NESP (Novel Erythropoiesis Stimulating Protein) Synthetic hemoglobin (HBOC) Dynepo -?? CERA (Continuous Erythropoiesis Receptor Activator) -?? ph IEF

36 HORMONLABORATORIET - AKER UNIVERSITETSSYKEHUS - OSLO Påvisning av kroppsfremmed protein Påvisning av kunstige oksygenbærere ved hjelp av LC-MS: Syntetisk hemoglobinpreparat (Hemopur) W. Schänzer, M. Thevis. Chem. unserer Zeit 2004, 38,

37 HORMONE LABORATORY - AKER UNIVERSITY HOSPITAL OSLO NORWAY A peptide hormone challenge endogenous hgh recombinant hgh 22 kda-hgh and different other forms only 22 kda-hgh Strasburger et al.

38 HORMONE LABORATORY - AKER UNIVERSITY HOSPITAL OSLO NORWAY Direct indication for hgh administration quotient assay 1/assay Strasburger et al sample no. treated with recomb. hgh only pituitary hgh

39 HORMONE LABORATORY - AKER UNIVERSITY HOSPITAL OSLO NORWAY Påvisning av misbruk med kroppsegne proteinhormoner Stoffene finnes i kroppen naturlig Et smalt tidsvindu for direkt påvisning Treningskontroller uten advarsel er påbudt Indirekte blodparametre mangler spesifisitet til å bestå i retten

40 HORMONLABORATORIET - AKER UNIVERSITETSSYKEHUS Olympic Movement Antidoping Code 2004 World Antidoping Code * *) World Anti Doping Agency

41 HORMONLABORATORIET - AKER UNIVERSITETSSYKEHUS WADA s mandate Laboratory Accreditation Prohibited List

42 HORMONLABORATORIET - AKER UNIVERSITETSSYKEHUS Intern og ekstern kvalitetskontroll WADA-akkreditering ISO akkreditering Høy teknisk standard Strenge kriterier for identifikasjon Daglig intern kvalitetskontroll A- og B-analyse

43 HORMONLABORATORIET - AKER UNIVERSITETSSYKEHUS Konklusjon Sikkerheten ved laboratorieanalysene gis høyeste prioritet gjennom: State-of-the-art analyseteknologi Strenge analysekriterier Streng intern og ekstern kvalitetskontroll Omfattenede vurderinger av utøverens rettssikkerhet