HPV DNA- tes,ng på cervikale celler innsamlet i SurePath konserveringsvæske (BD Diagnos,cs- TriPath) Ole Herman Ambur, PhD. Seksjon for Forsking og

HPV DNA- tes,ng på cervikale celler innsamlet i SurePath konserveringsvæske (BD Diagnos,cs- TriPath) Ole Herman Ambur, PhD. Seksjon for Forsking og utvikling

Disposisjon Bakgrunn Mini- metodevurdering SurePath og HPV- tescng Funn Klinisk vurdering av SP Holdbarhet, DNA og ekstraksjon i SP Konklusjoner Metodevalidering SurePath Cobas 4800 på Ahus Oppsummering og konklusjoner Forkortelser: SP = SurePath TP=Thinprep/Preservcyt

Bakgrunn 1 Artikkel publisert i 2003

Bakgrunn 1 forts. Påvisning av degradering av humant DNA i TPmedium over tid. (15% ble β-globin-negative etter 5 år). Ikke påviselig degradering av HPV-DNA! Lang oppbevaring av væskebasert cytologiske prøver er kanskje ikke optimalt for langvarige prospektive studier av cervixcancer som er avhengig av arkivert materiale Castle et al., 2003

Bakgrunn 2 SurePath leverandør

Bakgrunn 3

Bakgrunn oppsummering I 2003 påvist degradering av humant DNA i væskebaserte cytologiske prøver (TP) når disse oppbevares over lang tid (5 år!). Ikke påvist degradering av HPV DNA. (Castle et al., 2003) I 2012 i USA advarsel fra leverandør av SP (BD) om at HPV-testing med HC2 fra SP-medie ikke er FDA-godkjent og at det under visse betingelser kan gi falske negative. Dannet et inntrykk fra flere hold at degradering av DNA er et problem for HPV DNA-testing fra SP-mediet.

Mini- metodevurdering På oppdrag fra Helsedirektoratet undersøke sikkerhet og effekt av HPV- tescng på SurePath- mediet gjennom liueratursøk og rapport med fagfellevurdering UWørt ved Ahus i 2013 Tilgjengelig på Kunnskapssenteret med CUel: HPV DNA- tes,ng på cervikale celler innsamlet i SurePath konserveringsvæske (BD Diagnos,cs- TriPath)

LiFeratursøk Databaser: Clinical Evidence, Cochrane library, NCBI PubMed i samarbeid med Medisinsk bibliotek Ahus. 12 relevante primærstudier om emnet: HPV og/eller SurePath og/eller ThinPrep

Klinisk studie 1, Ko 2006 Pilot: 108 kasus hvorav 20 LSIL, 8 HSIL, 58 negative, 21 ASC og 1 inkonklusiv à resultat: 100% sensitivitet for HSIL og LSIL 2006 Oppfølging: 2319 ASC-US hvorav 625 m/biopsi. SP: Klinisk sensitivitet (CIN2+): 93.4% Klinisk spesifisitet (CIN2+): 25.1% PPV CIN2+ = 17.5% NPV CIN2+ = 95.7% TP: Til sammenlikning: ALTS Klinisk sensitivitet: 95% PPV CIN2+ = 20% NPV CIN2+ = 99% Konklusjon: ALTS=ASC-US/LSIL Triage Study Artikkelen konkluderer med at HPV-testing med HC2 på SP har tilsvarende kliniske egenskaper som HC2 på TP. Studien baserer seg på sammenlikning med publiserte verdier (ALTS) fra FDA-godkjent metode.

Klinisk studie 2, Siddiqi 2009 Design: Sammenlikning av HPV-positivitetsrater fra refleks HC2-test på TP (N=4145) og SP (4235) etter ASC-US Pap-resultat med oppfølgingsbiopsier (684). Resultat: HPV DNA ble detektert i 2915 (68.8%) SP-prøver og 2640 (66.7%) TP-prøver. Positivitetsraten var ikke signifikant forskjellig i SP- og TP-gruppene (P=0.37). Aldersstratifisering av kohortene viste at positivitetsratene var sammenliknbare for de to metodene i der kvinnene var 20 år. OBS: I aldersgruppen 19 år var positivitetsraten signifikant (P=0.001) lavere for SP-gruppen enn TPgruppen. Deteksjonsrate for CIN2+ og CIN3+ var sammenliknbare for TP (21,4%, 3,1%) og SP (15,4%, 4,2%). 2009 Flere prøver var uten sikker bestemmelse (equivocal) med HC2-testing i SP-gruppen (484, 11,4%) enn i TP-gruppen (134, 3.2%) (P<0,001). Antall prøver uten tilstrekkelig residualvolum for HC2-testing var 185 (4.4%) i TP-gruppen og 0 i SP-gruppen (P<0,001). Konklusjon: HC2 positivitetsratene og CIN2-3-ratene var sammenliknbare for SP- og TP-systemene og underbygger bruken av SP for HC2-testing.

Klinisk studie 3, Kelly 2011 Design: 6 laboratorier undersøkte prøver fra 10051 kvinner i alder 25-64 år fra rutineinnkalling eller innkalling til gjentatt cytologisk prøve med bakgrunn i rapport om grenseverdi (borderline) eller mild dyskaryosis i første prøve. Resultater: HPV positivitetsrate 53,7% for borderline cyt og 83,9% for mild dyskaryosis. PPV 16,3% for CIN2+ og 6,1% for CIN3+ Konklusjon: Store variasjoner i HPV-positivitetsrater (34.8%-73.3%) mellom laboratorier som kun benyttet TP tyder på varierende praksis for rapportering av cytologisvar mellom laboratoriene. Det er også usikkerhet knyttet til sammenliknbarheten av pasientgrunnlaget for de forskjellige laboratoriene. Det er intet som antyder at SP-mediet er mindre egnet til DNA-basert HPV test enn TP. At HPV-positivitetesratene er like i for TP (61%) og SP (63%) i samme laboratorium understreker dette.

Klinisk studie 4, Zhao 2011 Design: 2005 kvinner; 1033 kvinner testet med TP og 972 med SP. Resultat: Sammenliknbar presisjon av HC2 for deteksjon av CIN2+ i hhv. TP og SP-medium. Sammenliknbar presisjon av kombinasjon av væskebasert cytologi OG HC2 for deteksjon av CIN2+ i hhv. TP og SP-medium. Konklusjon: Begge metodene (SP og TP) oppdaget signifikante cervikale lesjoner med tilsvarende gyldighet. SP-prøver gav riktignok både flere tilfredsstillende slides til cytologisk analyse samt tilstrekkelig residualvolum for HC2-testing enn TP-prøver.

Holdbarhet SurePath-medium SP holdbarhet ved romtemperatur er lengre enn leverandørens anbefaling og opp til 4 uker

Holdbarhet SurePath medium AMPLICOR HPV Test kan trygt utføres på DNA ekstrahert fra SP som har vært oppbevart i minst 21 dager.

Holdbarhet SurePath-medium slide Utbytte av RNA var uanfektet av lagring i TP-medium, men lagring i SP-medium forårsaket signifikant redusert utbytte (mellom 10 4 og 10 8 ganger reduksjon avhengig av ekstraksjonsmetode). Utbytte av DNA var uanfektet av lagring i TP-medium og ekstraksjonsmetode. Utbytte av DNA fra SP-medium påvirkes negativt ved bruk av TRIzol som ekstraksjonsmetode Utbytte av DNA fra SP-mediet påvirkes ikke ved bruk av QIAamp ekstraksjonsmetode.

Hvordan Powell 2006 har blif sitert: Upon exposure to SurePath media, recovery of both DNA and ribonucleic acid rapidly diminished. (Naryshkin and AusCn, 2012) storage in SurePath diminishes the recovery of both DNA and RNA rapidly (Arbyn et al., 2010; Methods in Biobanking, Methods in Molecular Biology, vol. 675) Det er utelau at utbyue av DNA fra SP med en av metodene ikke avtar. Menneskelig nær faglig sterk

Holdbarhet SurePath-medium DNA stabilt i både SP og TP over flere år. Det er følgelig intet som antyder at HPV DNA degraderes i disse mediene i et slikt omfang at det affiserer egnethet for DNAbasert HPV-testing innen den undersøkte tidsrammen (2.6 år) eller derav innenfor den leverandøranbefalte lagringstid (6 mnd v 2-8 C for SP-prøver).

Ringtest- sammenfatning, 2013

Denne rapporten fremhever viktigheten av gode protokoller og rutiner for prøvehåndtering. Rapporten viser at SP-mediet er egnet for HPVtesting dersom gode rutiner er etablert. At SPmediet gjør det bedre gjennom perioden viser at de svakere resultater i begynnelsen av studiet (2008) ikke kan tilskrives DNA degradering da man ikke kan anta at graden av dette ville ha endret seg fra 2008 til 2010. HPV-testavhengige resultater der cut-off er diskusjonstema.

Konklusjoner mini- metodevurdering Studiene peker i retning av at SP- mediet har like kliniske egenskaper som TP- mediet mht. HPV DNA- tescng (Ko, Siddiqi, Kelly og Zhao). Flere studier har undersøkt stabilitet av DNA og finner at DNA i SP- mediet er stabilt: ved romtemperatur over 21 dager (Dixon); ut over leverandørens anbefalinger (Hardie), like stabilt som i TP- mediet (Powell, Kelly og Agreda) og oppcl 2.6 år ved (2-8⁰C) (Agreda). Flere av studiene og rapportene har belyst behovet for nødvendig og adekvat prøvebehandling og laboratorieerfaring (Powell, Naryshkin, Nance (ikke inkl.), Nance (ikke inkl.) og Moriarty). Spesielt har DNA- ekstraksjonsmetode vist seg avgjørende for utbyfe av DNA (Powell 2006). Mini- metodevalidering har bidrau Cl å øke bevissthet om betydningen av ekstraksjonstrinnet i HPV- tescng på væskebaserte celleprøver. DNA synes ikke å forsvinne selv euer flere års oppbevaring i SP (eller FFPE for den saks skyld) og varmebehandling/proteinase K er nødvendig for ekstraksjon.

Diskusjon mini- metodevurdering Powell 2006 diskuterer om redusert cellelysering kan være årsak Cl at SP- mediet er mer sensicvt Cl ekstraksjonsmetode enn TP- mediet. Referanselaboratoriet anser at denne effekt evt. også/heller kan ha sammenheng med at SP- mediet i motsetning Cl TP- mediet inneholder små mengder formalin som kryssbinder DNA med proteiner. Slik kryssbinding er reversibel ved varme og behandling med proteinase K. Cobas 4800 protokoll med varme og proteinase K blir brukt i den validerte prosedyren som følges ved HPV referanselaboratoriet på Ahus og som er CE- merket for HPV tescng på SP- prøver. Valideres årlig med ringtest QCMD. Adekvat oppvarmingstrinn synes nødvendig for ekstraksjon av DNA fra SP

Hva har skjedd efer at mini- metodevurederingen ble ferdig? DNA stabilt i SP opptil 10 uker ved romtemp. for Cobas 4800 HPV-test

Menneskelig nær faglig sterk

Metodevalidering av Cobas 4800 (Roche) HPV DNA test på hhv. TP og SP (Preservcyt) Protokoll: Design: To stk. LBC- prøver fra hver kvinne. Første prøvetaking allcd Cl TP, andre Cl SP. Væskebasert cytologi SP SP og TP analysert fortløpende på Cobas 4800 101 Clfeldig valgte kvinner og 29 euer henvisning er hiql testet Kobling mellom HPV- test og Cyt- svar gjenstår.

Midler,dige resultater validering Ahus n= 130 TP SP Pos Neg Inko Pos 14 5 0 Neg 0 110 0 Inko 0 1 0 Resultat: 100% samsvar mellom TP og SP der TP er positiv. SP fanger opp 5 flere positive enn TP i 125 analyserte til tross for at SP er gitt ulempe ved å være andre prøve. De 5 SP+TP- har høy CT-verdi. Konklusjon: Ingen indikasjon på at Cobas 4800-test på SP-mediet gir falske negative prøvesvar.

Oppsummering og konklusjoner HPV DNA- tescng på SP og TP synes å ha Clsvarende klinisk oppførsel i flere studier DNA er holdbart i væskebaserte prøver i flere år Adekvat DNA ekstraksjon (varme) nødvendig for SP Metodevalidering ved HPV referanselaboratoriet på Ahus viser at Cobas4800 detekterer HPV DNA fra SP minst like bra som fra TP

Takk til Irene K. ChrisCansen Mona Hansen Ellen Myrvang Alexander Eieland Roger Meisal Nermin Zecic Thu Hoang Nguyen Truls Leegaard Merete Holth Avd. Patologi Torill Sauer Bente Ekeberg Ying Chen Medisinsk bibliotek Åse Marit Hammersbøen Menneskelig nær faglig sterk