(12) Translation of european patent specification

Transkript

1 (12) Translation of european patent specification (11) NO/EP 23 B1 (19) NO NORWAY (1) Int Cl. C12N /077 (.01) C12N /073 (.01) Norwegian Industrial Property Office (21) Translation Published (80) Date of The European Patent Office Publication of the Granted Patent (86) European Application Nr (86) European Filing Date (87) The European Application s Publication Date () Priority , PT, 3847 (84) Designated Contracting States: AT BE BG CH CY CZ DE DK EE ES FI FR GB GR HR HU IE IS IT LI LT LU LV MC MT NL NO PL PT RO SE SI SK TR (73) Proprietor Laboratorio Medinfar-produtos Farmacêuticos, S.a., Rua Manuel Ribeiro De Pavia Nº 1-1º, Amadora, PT-Portugal (72) Inventor GANCHAS SOARES, Rita Isabel, ECBIOAvenida da RepúblicaQuintado Marquês BAPTISTA COELHO, Maria Constança, Avenida da RepúblicaQuinta domarquês SILVA SANTOS, Jorge Miguel, Avenida da RepúblicaQuinta domarquês MARTINS, José Paulo, ECBIO S.A.Avenida da RepúblicaQuinta do Marquês BASTO, Vera Alexandra, ECBIO S.A.Avenida da RepúblicaQuinta do Marquês ESTILITA MONTEIRO DA CRUZ, Pedro, ECBIO S.A.Avenida da RepúblicaQuinta do Marquês EANEdifício ITQB/IBETLaboratório 4.11, P Oeiras, PT- Portugal SOARES DA CRUZ, Helder Joaquim, ECBIO S.A.Avenida da RepúblicaQuinta do Marquês EANEdifício ITQB/IBETLaboratórios 4.11, P Oeiras, PT-Portugal (74) Agent or Attorney Onsagers AS, Postboks 1813 Vika, 0123 OSLO, Norge (4) Title OPTIMISED AND DEFINED METHOD FOR ISOLATION AND PRESERVATION OF PRECURSON CELLS FROM HUMAN UMBILICAL CORD (6) References Cited: WEISS MARK L ET AL: "Human umbilical cord matrix stem cells: preliminary characterization and effect of transplantation in a rodent model of Parkinson's disease." STEM CELLS (DAYTON, OHIO) MAR 06, vol. 24, no. 3, March 06 (06-03), pages , XP ISSN: CAN ALP ET AL: "Concise review: human umbilical cord stroma with regard to the source of fetus-derived stem cells." STEM CELLS (DAYTON, OHIO) NOV 07, vol., no. 11, 9 August 07 ( ), pages , XP ISSN: Retrieved from the Internet: URL: /reprint//11/2886.pdf> cited in the application LU LU-LU ET AL: "Isolation and characterization of human umbilical cord mesenchymal stem cells with hematopoiesis-supportive function and other potentials" HAEMATOLOGICA, FONDAZIONE FERRATA STORTI, ROME, IT, vol. 91, no. 8, 1 August 06 ( ), pages 17-26, XP ISSN:

2 Enclosed is a translation of the patent claims in Norwegian. Please note that as per the Norwegian Patents Acts, section 66i the patent will receive protection in Norway only as far as there is agreement between the translation and the language of the application/patent granted at the EPO. In matters concerning the validity of the patent, language of the application/patent granted at the EPO will be used as the basis for the decision. The patent documents published by the EPO are available through Espacenet ( or via the search engine on our website here:

3 1 PATENTKRAV 1. Seleksjonsmetode for å isolere celler fra human navlestrengsmatriks, karakterisert ved at den omfatter de følgende trinnene: 3 40 a) et gjenvinningstrinn der den humane navlestrengen transporteres til laboratoriefasilitetene i en steril lukket resipient, enten tørr eller nedsenket i en steril bufferløsning, med eller uten antibiotika, fortrinnsvis inneholdende 186 μg/ml CaCl 2 2H 2 O, 400 μg/ml KCl, 60 μg/ml KH 2 PO 4, 0 μg/ml MgSO 4 7H 2 O, 8000 μg/ml NaCl, μg/ml NaHCO 3, 90 μg/ml NaH 2 PO 4 7H 2 O, 00 μg/ml glukose, U/ml penicillin og μg/ml streptomycin, fortrinnsvis ved romtemperatur dersom behandlet innen en periode på 72 timer eller mellom 2 og 8 C, fortrinnsvis ved 4 C dersom behandlet innen en periode på mellom 48 og 144 timer etter innsamling; b) tre navlestrengvasketrinn med en steril saltløsning, fortrinnsvis inneholdende 186μg/ml CaCl 2 2H 2 O, 400μg/ml KCl, 60μg/ml KH 2 PO 4, 0μg/ml MgSO 4 7H 2 O, 8000μg/ml NaCl, μg/ml NaHCO 3, og 90μg/ml NaH 2 PO 4 7H 2 O; c) et ytre amnionmembran fjerningstrinn, hvor amnionmembranen blir fjernet ved hjelp av sterile pinsetter; d) et fraksjoneringstrinn der navlestrengen blir transversalt fraksjonert langs sin lengdeakse ved hjelp av en skalpell for å fremstille fraksjoner på 2,cm (2,g); e) et eliminasjonstrinn for blodpropp fra fraksjonene som resulterer fra d), der snitt blir gjort ved hjelp av en skalpell på stedet der blodproppene ble identifisert, og fra hvilke blodproppene blir eliminert; f) et grupperingstrinn der fraksjoner som resulterer fra e) blir brakt sammen i grupper på 7 som vil bli behandlet uavhengig i de følgende trinnene; g) et dissosiasjonstrinn for hver gruppe av 7 fraksjoner som resulterer fra f) utført i en steril og forseglet kolbe som inneholder en digestionsløsning med bufret ph, ved den kombinerte virkningen av collagenase II og trypsin der collagenase II er i en konsentrasjon mellom 0,37 % og 0,07 % (vekt/digestionsvolum) og trypsin er i en konsentrasjon på 0,1 % (vekt/digestionsvolum); opprettholdelse av et konstant forhold mellom vevsmengde (gram), bunnoverflatearealet av kolben (cm 2 ), digestionsvolum

4 (ml), og det totale beholdervolumet (ml) ved omtrent 1:2:2:37; og der kolben blir inkubert under definerte betingelser for inkubasjonstid, temperatur, varmefordeling, omgivende luftfuktighet og agitering; mer spesifikt, som starter fra en gruppe på 7 navlestrengsfraksjoner med omtrent 2, g hver, frigjort fra blodpropper, som bruker et volum av digestionsløsning på 3 ml; i en ikke-ventilert og lukket dyrkningskolbe, slik at T 17 med et total volum på 60 ml, og headspace under digestion på 6 ml minus neddykkingsvolumet av de 7 fraksjonene under digestion; og der digestionsløsningen foruten enzymene består av 186 μg/ml CaCl 2 2H 2 O, 400 μg/ml KCl, 60 μg/ml KH 2 PO 4, 0 μg/ml MgSO 4 7H 2 O, 8000 μg/ml NaCl, μg/ml NaHCO 3, 90 μg/ml NaH 2 PO 4 7H 2 O, 00 μg/ml glukose, og 76 μg/ml (0,260mM) EDTA; opprettholdelse av ph ved 6,4 eller høyere; og der den enzymatiske reaksjonen blir inkubert i en periode på 4 timer; ved en konstant temperatur på 37 C; i en lukket tørr inkubator; under omrøring ved en konstant hastighet på enten 0 eller 140 svingninger min -1 (opm), fortrinnsvis 0 opm, h) et første cellegjenvinningstrinn der celler som er dissosiert fra vevet, som beskrevet i g), blir gjenvunnet ved en statisk horisontal inkubasjon av kolben der digestion fant sted i en tidsperiode på til 0 minutter, fortrinnsvis minutter ved romtemperatur etterfulgt av å overføre digestionssupernatanten ved å pipetere løsningen - og unngå enhver oppsuging av ikke-digerert vev, inn i et 0 ml sentrifugerør, som i sin tur blir fulgt av fjerningen av ikke-digerert vev fra digestionskolben; til hvilken et 3 ml volum av basalmediet supplert med deoksyribonukleosider, ribonukleosider, glutamin, % føtalt kalveserum (Foetalt Bovint Serum, FBS) og antibiotika blir tilsatt; og i hvilken den ikke-ventilerte kolbekorken blir erstattet med en filterinneholdende ventilert kork; etterfulgt av inkubasjon ved 37 C i en fuktet atmosfære som inneholder 7 % CO 2 ; og bytter dyrkingsmediet hver 72 time for å fremme adhesjon og cellevekst/ celleformering inntil maksimum overflatesammenløpning er oppnådd; i) et andre cellegjenvinningstrinn der celler som er dissosiert fra vevet, som beskrevet i g), og inneholdt i digestionssupernatanten oppnådd som beskrevet i h), blir gjenvunnet ved å sentrifugere 0 ml sentrifugerøret fra h) ved g i minutter ved romtemperatur; overføre det 3 ml supernatantvolumet etter sentrifugeringen til en stasjonær dyrkningskolbe slik som en T 17 med en filterinneholdende ventilert kork; tilsettes til den samme dyrkningskolben 3 ml av basaldyrkingsmediet supplert med deoksyribonukleosider, ribonukleosider, glutamin, % føtalt kalveserum (FBS) og antibiotika; inkubere dyrkningskolben ved 37 C i en fuktet atmosfære som inneholder 7 % CO 2 ; og bytter dyrkingsmediet hver 72 time for å fremme adhesjon og cellevekst/ celleformering inntil maksimum

5 3 overflatesammenløpning er oppnådd; j) et tredje cellegjenvinningstrinn der celler som er dissosiert fra vevet, som beskrevet i g), blir gjenvunnet som en cellepellet oppnådd ved sentrifugering av digestionssupernatanten som beskrevet i i), resuspendert i 2 ml av løsningen som består av føtalt kalveserum (FBS) og % dimetylsulfoksid (DMSO), kryokonservert ved bruk av en kontrollert frysehastighet med en temperatur avtagende hastighet på 1 C min -1 ned til - 80 C, i en 2, ml steril kryoampulle som inneholder 2 ml av cellesuspensjonen og 0, ml headspace; k) et kryokonserveringstrinn for cellepopulasjonene oppstått som beskrevet i h) og i) etter at cellekulturer oppnådde maksimum overflatesammenløpning, bestående i den direkte kryokonserveringen, i dampfasen av flytende nitrogen, av en blanding av 0, ml av cellesuspensjonen og 0, ml av en løsning av føtalt kalveserum (FBS) og % dimetylsulfoksid (DMSO), slik at den endelige celletettheten etter kryokonserveringen er omtrent 3x 6 celler/ml, i en steril 1, ml steril kryoampulle, som til slutt inneholder 1,0 ml cellesuspensjon og 0, ml headspace. 2. Seleksjonsmetoden ifølge foregående krav, hvori utbyttet ved slutten av den første adhesjon og ekspansjonssyklus (P0) er på omtrent 8,6 (± 0,1) x celler per gram av navlestreng. 3. Seleksjonsmetoden beskrevet i kravene 1-2 for fremstillingen eller produksjonen av celleterapisammensetninger. 4. Seleksjonsmetoden beskrevet i krav 3, hvori terapien er autolog.. Seleksjonsmetoden beskrevet i kravene 1-2 for anvendelse i produksjon av cellelag i cellekulturstøtter. 6. Seleksjonsmetoden beskrevet i kravene 1-2 for dannelsen av cellebanker. 3