(12) Oversettelse av europeisk patentskrift

Transkript

1 (12) Oversettelse av europeisk patentskrift (11) NO/EP B1 (19) NO NORGE (1) Int Cl. A61K 38/00 (06.01) C07K 14/9 (06.01) Patentstyret (21) Oversettelse publisert (80) Dato for Den Europeiske Patentmyndighets publisering av det meddelte patentet (86) Europeisk søknadsnr (86) Europeisk innleveringsdag (87) Den europeiske søknadens Publiseringsdato () Prioritet , EP, , US, 4424 P (84) Utpekte stater AT BE BG CH CY CZ DE DK EE ES FI FR GB GR HR HU IE IS IT LI LT LU LV MC MK MT NL NO PL PT RO SE SI SK TR (73) Innehaver Ferring B.V., Polaris Avenue 144, 2132 JX Hoofddorp, NL-Nederland (72) Oppfinner COTTINGHAM, Ian, Ferring International Center SAChemin de la Vergognausaz 0, CH-1162 St Prex, GB-Storbritannia PLAKSIN, Daniel, Ferring International Center S.A.Chemin de la Vergognausaz 0, 1162 Saint-Prex, CH-Sveits WHITE, Richard, Boyd, 1348 Sutter Street, San DiegoCA 923, US-USA (74) Fullmektig Oslo Patentkontor AS, Postboks 7007 Majorstua, 06 OSLO, Norge (4) Benevnelse Rekombinant FSH innbefattende alfa-2,3- og alfa-2,6-sialylering (6) Anførte publikasjoner WO-A-03/03686 FLACK M R ET AL: "Increased biological activity due to basic isoforms in recombinant human follicle-stimulating hormone produced in a human cell line." THE JOURNAL OF CLINICAL ENDOCRINOLOGY AND METABOLISM SEP 1994, vol. 79, no. 3, September 1994 ( ), pages , XP ISSN: X HORSMAN G ET AL: "A biological, immunological and physico-chemical comparison of the current clinical batches of the recombinant FSH preparations Gonal-F and Puregon" HUMAN REPRODUCTION 00 GB, vol. 1, no. 9, 00, pages , XP ISSN: OLIJVE W ET AL: "Molecular biology and biochemistry of human recombinant follicle stimulating hormone (Puregon)." MOLECULAR HUMAN REPRODUCTION MAY 1996, vol. 2, no., May 1996 (1996-0), pages , XP ISSN: DALPATHADO DILUSHA S ET AL: "Comparative glycomics of the glycoprotein follicle stimulating hormone: glycopeptide analysis of isolates from two mammalian species." BIOCHEMISTRY 18 JUL 06, vol. 4, no. 28, 18 July 06 ( ), pages , XP ISSN: JONES D ET AL: "High level expression of recombinant IgG in the human cell line PER.C6" BIOTECHNOLOGY PROGRESS, XX, XX, vol. 19, 1 January 03 ( ), pages , XP ISSN: Renato De Leeuw ET AL: "Recombinat hormones: Structure-function relationship of recombinant follicle stimulating hormone (Puregon )", Molecular Human Reproduction, vol. 2, no., 1 May 1996 ( ), pages , XP , ISSN: , DOI:

2 .93/molehr/ COMBARNOUS YVES: "Structure and structure-function relationships of human recombinant FSH", M-S (MEDECINE SCIENCES), vol. 1, no. 2, February 1999 ( ), pages , ISSN: Angela Amoresano ET AL: "Structural Characterisation of Human Recombinant Glycohormones Follitropin, Lutropin and Choriogonadotropin Expressed in Chinese Hamster Ovary Cells", European Journal of Biochemistry, vol. 242, no. 3, 1 December 1996 ( ), pages , XP00468, ISSN: , DOI:.1111/j r.x

3 1 Beskrivelse Foreliggende oppfinnelse vedrører gonadotropiner for anvendelse ved behandling av infertilitet. Spesielt angår den follikkel-stimulerende hormon (FSH). Gonadotropinene er en gruppe heterodimere glykoprotein-hormoner som regulerer gonade-funksjon hos menn og kvinner. De innbefatter follikkelstimulerende hormon (FSH), luteiniserende hormon (LH) og chorionisk gonadotropin (CG). FSH blir naturlig utskilt av den bakre hypofysekjertel og fungerer til å støtte follikulær utvikling og ovulering. FSH omfatter en 92 aminosyrers alfa subenhet som også er vanlig for de andre glykoproteinhormoner LH og CG samt en 111 aminosyrers beta-subenhet som er enestående for FSH og som gir den biologiske spesifisitet til hormonet (Pierce and Parsons, 1981). Hver subenhet blir posttanslatorisk modifisert ved tilsetning av komplekse karbohydrat-residuer. Begge subenheter bærer 2 seter for N-tilknyttet glykan-binding, alfa-subenheten ved aminosyrer 2 og 78 og beta-subenheten ved aminosyreresiduer 7 og 24 (Rathnam and Saxena, 197, Saxena and Rathnam, 1976). FSH blir således glykosylert til omkring % tørr masse (Dias and Van Roey, 01. Fox et al, 01). FSH renset fra post-menopausal human urin har blitt brukt i mange år i infertilitetsbehandling, både for å fremme ovulering i naturlig reproduksjon samt for å gi oocytter for assistert reproduksjonsteknologi. To rekombinante versjoner av FSH, Gonal-F (Serono) og Puregon (Organon) ble tilgjengelige i midten av tallet. Disse blir begge uttrykt i kinesisk hamster (CHO) ovarieceller (Howles, 1996). Det finnes vesentlig heterogenitet assosiert med FSH-preparater som angår forskjeller i mengdene av de forskjellige isoformer som er til stede. Individuelle FSH-isoformer oppviser identiske aminosyresekvenser, men er forskjellige angående utstrekningen som de er post-translatorisk modifisert; spesielle isoformer er særpreget ved heterogenitet i karbohydrat kjedestrukturer og forskjellige mengder av inkorporert sialinsyre (et terminalt sukker), hvorav begge synes å påvirke den spesifikke isoform-bioaktiviteten. Glykosylering av naturlig FSH er meget kompleks. Glykanene i naturlig avledet hypofyse-fsh kan inneholde en lang rekke strukturer som kan innbefatte kombinasjoner av bi-, tri- og tetra-antenneglykaner (Pierce and Parsons, 1981, Ryan et al., 1987, Baenziger and Green, 1988). Glykanene kan bære videre modifikasjoner: kjernefukosylering, todelende glukosamin, kjeder forlenget med acetyllaktosamin, delvis eller fullstendig sialylering, sialylering med α2,3- og α2,6- bindinger og sulfatert galaktosamin substituert for galaktose (Dalphatado et al.,

4 ). Videre finnes det forskjeller mellom fordelingene av glykanstrukturer ved de individuelle glykosyleringsseter. Et sammenlignbart nivå av glykan-kompleksitet har blitt funnet i FSH avledet fra serum fra individer og fra urin fra postmenopausale kvinner (Wide et al., 07). Glykolsyleringen av rekombinante FSH-produkter reflekterer mengden av glykosyl-transferaser som er til stede i vertscellelinjen. Eksisterende rfshprodukter er avledet fra manipulerte kinesisk hamster ovarieceller (CHO-celler). Området for glykan-modifikasjoner i CHO-avledet rfsh er mer begrenset enn dem funnet i de naturlige produkter, enten avledet fra hypofyseekstrakter eller urin. Eksempler på redusert glykan-heterogenitet funnet i CHO-avledet rfsh innbefatter en mangel på oppdelende glukosamin og et redusert innhold av kjerne-fukosylering og acetyl-laktosamin-forlengelser (Hard et al., 1990). I tillegg er CHO-celler kun i stand til å legge til sialinsyre ved å bruke α2,3-bindingen (Kagawa et al., 1986, Takeuchi et al., 1988, Svensson et al., 1990). Dette er forskjellig fra naturlig dannet FSH som inneholder glykaner med en blanding av α2,3- og α2,6-bundet sialsyre. Det har blitt vist at et rekombinant FSH-preparat (Organon) er forskjellig i mengdene av FSH med et isoelektrisk punkt (pi) på under 4 (i betraktning av de sure isoformer) når sammenlignet med hypofyse, serum eller post-menopausal urin FSH (Ulloa-Aguirre et al., 199). Mengden av sure isoformer i urinpreparatene var mye høyere enn de rekombinante produkter, Gonal-f (Serono) og Puregon (Organon) (Andersen et al., 04). Dette må reflektere et lavere molart innhold av sialsyre i rfsh siden innholdet av negativt ladet glykan modifisert med sulfat er lav i FSH. Det lavere sialsyreinnhold i forhold til naturlig FSH, er et trekk ved begge kommersielt tilgjengelige FSH-produkter og må følgelig reflektere en begrensning i fremstillingsprosessen (Bassett and Driebergen, 0). Det finnes en stor mengde vitenskapelig arbeid som analyserer og forsøker å forklare variasjonene i FSH-glykosylering mellom individer og endringer over forløpet av en ovuleringscyklus. En av hoveddiskusjonene angår observasjonen at FShkonsentrasjonen og sialsyreinnholdet begge synker under den pre-ovulatoriske fase av cyklusen. Det senkede sialsyreinnhold resulterer i en mer basisk FSH som bli fjernet raskere og, i det minste in vitro, er mer virksom ved målreseptoren (Zambrano et al., 1996). Spørsmålet angående den biologiske relevans av disse endringer og hvordan de kan være involvert i utvelgelse av den dominante follikkel forblir uløst (oversikt av Ulloa-Aguirre, 03). Den sirkulatoriske levetiden til FSH har blitt dokumentert for materiale fra en mengde kilder. Enkelte av disse materialer har blitt fraksjonert på bais av total molekylladning, som karakterisert ved sin pi hvor mer syre tilsvarer høyere negativ

5 ladning. Som tidligere angitt er hovedtilførselen av negativ molekylær ladning det totale sialinnhold av hvert FSH-molekyl. For eksempel har rfsh (Organon) et sialsyreinnhold på omkring 8 mol/mol, mens urin-avledet FSH har et høyere sialsyreinnhold (de Leeuw et al, 1996). Den tilsvarende plasmaklareringshastighet hos rotte er 0,34 og 0,14 ml/min (Uolla-Aguirre et al, 03). I et annet eksempel hvor en prøve av rekombinant FSH ble delt opp i høye og lave pi-fraksjoner, var in vivoeffekten av den høye pi (lavere sialsyreinnhold) minsket og den hadde en kortere halveringstid i plasma (D Antonio et al., 1999). Dert har også blitt rapportert at den mer basiske FSH som sirkulerer under de siste stadier av ovuleringscyklusen, er grunnet nedreguleringen av α2,3 sialyl-transferase i den bakre hypofyse og som blir forårsaket av økende nivåer av østradiol (Damian-Matsumara et al., Ulloa-Aguirre et al., 01). Resultater for α2,6 sialyl-transferasen har ikke blitt rapportert. Det totale sialsyreinnhold av FSH og rfsh kan ikke sammenlignes direkte siden sialsyrer vanligvis er bundet på to måter. Hypofyse/serum/urin-FSH inneholder både α2,3 og α2,6-bundet sialsyre, hvor mest av førstnevnte. Imidlertid inneholder CHO celle-avledet rekombinante versjoner kun α2,3 (Kagawa et al., 1988, Takeuchi et al., 1988, Svensson et al., 1990). Dette er en annen forskjell mellom naturlige og aktuelle rekombinante produkter i tillegg til det lavere totale sialsyreinnhold av sistnevnte. CHO-celler blir vanligvis brukt for fremstilling av farmasøytiske humane rekombinante proteiner. Strukturanalyse har vist sialsyre er utelukkende bundet via en α2,3-binding (Kagawa et al., 1988, Takeuchi et al., 1988, Svensson et al., 1990). Mange humane glykoproteiner inneholder en blanding av både α2,3- og α2,6-bindinger. Følgelig vil rekombinante proteiner som blir uttrykt ved å bruke CHO-systemet, være forskjellige fra sine naturlige motstykker i sin type av terminale sialsyrebindinger. Dette er et viktig poeng. Ved fremstilling av biologiske materialer for farmasøytisk anvendelse siden karbohydratenhetene kan medvirke tilde farmasøytiske trekk ved molekylet. Det er ønskelig å ha et rfsh-produkt som nærmere replikerer eller etteraper den fysiokjemiske og farmakokinetiske profil av produktet som lages fra human urin. Det er ønskelig å ha et rfsh-produkt som har forbedret farmakokinetiske egenskap eller egenskaper i forhold til det kjente rekombinante produkt. I henhold til foreliggende oppfinnelse er det fremskaffet rekombinant FSH («rfsh» eller «recfsh») innbefattende α2,3-sialylering og α2,6-sialylering hvor 60% eller mer av den totale sialylering er α2,3-sialylering og fra til 40% av den totale sialylering er α2,6-sialylering, hvor det rekombinante FSH har et sialsyreinnhold [uttrykt som et forhold av mol sialsyre til mol protein] på mol/mol til 1

6 mol/mol. rfsh (eller rfsh-preparat) ifølge oppfinnelsen kan ha % eller mindre av den totale sialylering til å være α2,8-sialylering, f.eks. 0,1-4% av den totale sialylering kan være α2,8-sialylering. Søkerne har funnet at typen av sialsyrebinding, α2,3 eller α2,6, kan ha en dramatisk innvirkning på biologisk fjerning av FSH. Humane cellelinjer kan, i motsetning til CHO cellelinjer, uttrykke rekombinant FSH med sialsyrer bundet med både α2,3- og α2,6-bindinger. I eksempel 4 ble en rekombinant FSH cellelinje fremstilt som uttrykte FSH inneholdende glykaner med lave nivåer av både α2,3- og α2,6-bundet sialsyre (figur 6). Dette basiske materiale med begrenset sialsyreinnhold (figur 4) ble fjernet svært raskt fra sirkuleringen hos rotte slik som ville bli forventet (figur 7). Denne cellelinjen ble så utsatt for et andre manipuleringstrinn med tillegg av genet som koder for α2,6-sialyl-transferase (eksempel ). Det resulterende rfsh var høyt sialylert og som oppviser et sialsyreinnhold og pifordeling som k an sammenlignes med urin-fsh (figur ). Imidlertid ble dette materialet fjernet meget raskt fra sirkulasjonen hos rotter ved en hastighet som kan sammenlignes med det opprinnelige materialet som hadde lavt sialsyreinnhold (figur 8). Dette var en uventet observasjon siden det er kjent at en del av sialsyre på naturlig og biologisk aktivt FSH er α2,6-bundet. Fjerningen av det α2,6-sialylerte rfsh ble funnet å bli mediert av asialoglykoprotein-reseptoren (ASGP) funnet i leveren (eksempel 9). Dette ble vist med en midlertidig blokkering av ASGPreseptorene ved å bruke et overskudd av et annet substrat for reseptoren. Med reseptoren blokkert av asialofetuin ble den forventede fjerning av det høytsialylerte materiale restaurert (figur 9). Dette ble opprettholdt i flere timer inntil blokkeringen ble overvunnet og det α2,6-bundne høysialylerte rfsh gjenopptok sin aske fjerning. Rekombinant FSH med en blanding av både α2,3- og α2,6-bundet sialsyre ble leget ved å manipulere en human cellelinje til å uttrykke begge rfsh og α2,3 sialyltransferase (eksempel 4 og ). Det uttrykte produkt er sterkt surt og bærer en blanding av både α2,3- og α2,6-bundne sialsyrer; hvor sistnevnte er fremskaffet ved den endogene sialyltransferase-aktivitet (figur 6). Dette har to fordeler i forhold til rfsh uttrykt i konvensjonelle CHO-celler: for det første er materialet sterkere sialylert grunnet de kombinerte aktiviteter av de to sialyltransferaser og for det andre likner materialet mer det naturlige FSH. Dette er antatt å være biologisk mer gunstig i forhold til CHO-celle-avledete rekombinante produkter som har dannet kun α2,3-bundet sialsyre (Kagawa et al., 1988, Takeuchi et al., 1988, Svensson et al., 1990) og har minsket sialsyre-innhold (Ulloa-Aguirre et al., 199, Andersen et al., 04).

7 1 2 3 Søkerne har overraskende funnet at rfsh ifølge oppfinnelsen kan replikere eller etterape nærmere den fysiokjemiske og farmakokinetiske profil av det naturlige humane urinprodukt enn andre rekombinante produkter. Med andre ord kan rfsh ifølge oppfinnelsen være nærmere det «naturlige» rfsh. Dette kan ha store fordeler med hensyn til dosering etc. Videre kan et mer «naturlig» eller mer «humant» produkt være mer gunstig for pasienten som kan ønske behandling, selv om å være på en måte kunstig allikevel å være s «naturlig» som mulig. Det kan eksistere andre fordeler (f.eks. farmakokinetiske fordeler) med et rekombinant produkt som har karbohydrat (f.eks. glykan)-struktur som er nærmere naturlig (f.eks. humant urin) FSH enn andre rekombinante produkter. Oppfinnelsen angår således en rekombinant versjon av FSH som bærer en blanding av α2,3 og α2,6 sialsyre og som følgelig likner nærmere naturlig FSH. Det er ventet at anvendelse av denne forbindelsen for kontrollert ovariestimulering i IFV-teknikker og ovulasjonsinduksjon vil resultere i en mer naturlig stimulering av ovarien i forhold til eksisterende rekombinante produkter. Ifølge foreliggende oppfinnelse er det fremskaffet rekombinant FSH («rfsh» eller «recfsh») innbefattende α2,3 og α2,6 sialylering hvor 60% eller mer av den totale sialylering er en α2,3-sialylering og fra til 40% av den totale sialylering er α2,6-sialylering, hvor det rekombinante FSH har et sialsyreinnhold (uttrykt som et forhold av mol av sialsyre til mol av protein) på mol/mol til 1 mol/mol. rfsh eller rfsh-preparatet kan eventuelt ytterligere innbefatte α2,8 sialylering. I utførelsesformer av oppfinnelsen kan rfsh-materialet være til stede som en enkel isoform eller som en blanding av isoformer. rfsh-materialet ifølge oppfinnelsen har et sialsyreinnhold [uttrykt som et forhold mellom mol sialsyre til mol protein] på mellom mol/mol og 1 mol/mol, f.eks. mellom mol/mol og 14 mol/mol, f.eks. mellom 11 mol/mol og 14 mol/mol, f.eks. mellom 12 mol/mol og 14 mol/mol, f.eks. mellom 12 m ol/mol og 13 mol/mol. rfsh-materialet ifølge oppfinnelsen kan bli fremstilt eller uttrykt i en human cellelinje. rfsh (eller rfsh preparatet) ifølge oppfinnelsen har 60% eller mer hvor den totale sialylering er α2,3 sialylering. For eksempel kan 70, 80 eller 90% eller mer av den totale sialylering kan være α2,3-sialylering. rfsh kan inkludere α2,3- sialylering i en mengde som er fra 6 til 8% av den totale sialylering, f.eks. fra 70 til 80% av den totale sialylering, f.eks. fra 71 til 79% av den totale sialylering. rfsh ifølge oppfinnelsen kan ha fra til 40% av den totale sialylering til å være α2,6-sialylering. rfsh materialet kan innbefatte α2,6-silaylering i en mengde som er fra 1 til 3% av den totale sialylering, f.eks. fra til % av den totale sialylering, f.eks. fra 21 til 29% av den totale sialylering. rfsh-materialet ifølge oppfin-

8 nelsen kan ha % eller mindre av den totale sialylering til å være α2,8-sialylering. For eksempel kan 2,% eller mindre av den totale sialylering være α2,8-sialylering. rfsh-materialet kan innbefatte α2,8-sialylering i en mengde som er fra 0,1 til 4% av den totale sialylering, f.eks. fra 0, til 3% av den totale sialylering, f.eks. fra 0, til 2,% av den totale sialylering. Med sialylering menes mengden av sialsyreresiduer som er til stede på FSH karbohydratstrukturene. α2,3-sialylering betyr sialylering ved 2,3-posisjonen (slik som er velkjent innen faget) og α2,6-sialylering ved 2,6-posisjonen (også velkjent innen faget). Således refererer «% av den totale sialylering kan være α2,3-sialylering» til %-andelen av det totale antall sialsyreresiduer som er til stede i FSH-materialet som er sialylert i 2,3-posisjonen. Uttrykket «% av den totale sialylering er α2,6-sialylering» refererer til %-andelen av det totale antall sialsyreresiduer som er til stede i FSH-materialet som er sialylert i 2,6- posisjonen. Rekombinant FSH uttrykt i kinesisk hamster ovarieceller (CHO) innbefatter utelukkende α2,3-sialylering (Kagawa et al., 1988, Svensson et al., 1990). rfsh ifølge oppfinnelsen kan bli fremstilt eller uttrykt i en human cellelinje. Dette kan forenkle (og gjøre mer effektiv) fremstillingsmetoden fordi manipulering og kontroll av f.eks. cellevekstmediet for å opprettholde sialylering kan være mindre kritisk enn med kjente prosesser. Metoden kan også være mer effektiv fordi det blir dannet lite basisk rfsh i forhold til fremstilling av kjente rfsh-produkter, mer surt rfsh blir dannet og separasjon/fjerning av basisk FSH er mindre problematisk. rfsh-materialet kan bli dannet eller uttrykt i en Pr.C6 cellelinje, en Per.C6-avledet cellelinje eller en modifisert Per.C6 cellelinje. Cellelinjen kan bli modifisert ved å bruke α2,3-sialyltransferase. Cellelinjen kan bli modifisert ved å bruke α2,6- sialyltransferase. Alternativt eller i tillegg kan det aktuelle rfsh innbefatte α2,6- bundete sialsyrer (α2,6 sialylering) fremskaffet av endogen sialyltransferaseaktivitet (av cellelinjen). Det aktuelle rfsh kan bli fremstilt ved å bruke α2,3- og/eller α2,6- sialyltransferase. Det aktuelle rfsh kan bli fremstilt ved å bruke α2,3- sialyltransferase. Det aktuelle rfsh kan innbefatte α2,6-bundne sialsyrer (α2,6 sialylering) fremskaffet av endogen sialyltransferase-aktivitet. Ifølge foreliggende oppfinnelse blir det i et ytterligere aspekt fremskaffet en fremgangsmåte for fremstilling av rfsh som beskrevet heri (i henhold til aspekter av oppfinnelsen) omfattende trinnet md å fremstille eller uttrykke det aktuelle rfsh i en human cellelinje, f.eks. en Per.C6 cellelinje, en Per-C6-avledet cellelinje eller en modifisert Per.C6 cellelinje, f.eks. en cellelinje som har blitt modifisert ved å bruke α2,3-sialyltransferase.

9 rfsh-strukturen inneholder glykan-enheter. Forgrening kan inntreffe med det resultat at glykanet kan ha 1, 2, 3, 4 eller flere terminale sukker-residuer eller antenner, slik som er velkjent innen faget. Det aktuelle rfsh ifølge oppfinnelsen kan ha glykaner med sialylering til stede på mono-antenne- og/eller di-antenneog/eller tri-antenne- og/eller tetra-antenne-strukturer. Det aktuelle rfsh kan foretrukket innbefatte mono-sialylerte, di-sialylerte, tri-sialylerte og tetra-sialylerte glykanstrukturer med relative mengder som følger: 9-1% mono-sialylerte, 27-% di-sialylerte, -36% trisialylerte og 2-29% tetra-sialylerte (f.eks. som vist ved WAX-analyse av ladete glykaner, som angitt i eksempel 8 c). I henhold til foreliggende oppfinnelse er det i et ytterligere aspekt fremskaffet en farmasøytisk sammensetning omfattende rfsh innbefattende α2,3-sialylering og α2,6-sialylering hvor 60% eller mer av den totale sialylering er α2,3-sialylering og fra til 40% av den totale sialylering er α2.6-sialylering, og som har et sialsyreinnhold (uttrykt som et forhold mellom mol sialsyre til mol protein) på mol/mol til 1 mol/mol. Den farmasøytiske sammensetningen kan videre omfatte hcg og/eller LH. hcg kan bli oppnådd på enhver måte som er kjent innen faget. hcg som benyttet heri, innbefatter human-avledet og rekombinant hcg. Human-avledet hcg kan bli renset fra enhver passende kilde (f.eks. urin og placenta) ved enhver metode som er kjent innen faget. Metoder for å uttrykke og rense rekombinant hcg er velkjent innen faget. LH kan bli oppnådd på enhver måte som er kjent innen faget. LH, som benyttet heri, innbefatter human-avledet og rekombinant LH. Human-avledet LH kan bli renset fra enhver passende kilde (f.eks. urin) ved enhver metode som er kjent innen faget. Metoder for å uttrykke og rense rekombinant LH er kjent innen faget. Den farmasøytiske sammensetning kan være for behandling av ufruktbarhet, f.eks. for anvendelse i f.eks. assisterte reproduksjonsteknikker (ART), ovuleringsinduksjon eller intrauterin inseminasjon (IUI). Den farmasøytiske sammensetningen kan bli brukt f.eks. i medisinske indikasjoner hvor kjente FSH-preparater blir brukt. Foreliggende oppfinnelse fremskaffer også anvendelsen av rfsh beskrevet heri (i henhold til aspekter av oppfinnelsen) for, eller ved fremstilling av et medikament til behandling av ufruktbarhet. De farmasøytiske sammensetningene ifølge foreliggende oppfinnelse kan bli formulert til velkjente sammensetninger for enhver rute av medikamentadministrasjon, f.eks. oral, rektal, parenteral, transdermal (f.eks. plasterteknologi), intravenøs, intramuskulær, subkutan, intravaginal, intraperitoneal, lokal (pulvere, salver eller dråper) eller som en bukkal eller nasal spray. En typisk sammensetning omfatter et farmasøytisk akseptabelt bæremiddel så som en vandig oppløsning, ikketoksiske eksipienter innbefattende salter og preserveringsmidler, buffere og liknen-

10 de som beskrevet i Remingtons Pharmaceutical Sciences femtende utgave (Matt Publishing Company, 197) på side 140 til 1412 og , samt the national formulary XIV fjortende utgave (American Pharmaceutical Association, 197) blant andre. Eksempler på passende vandige og ikke-vandige farmasøytiske bæremidler, fortynningsmidler, oppløsningsmidler eller vehikler innbefatter vann, etanol, polyoler (så som glyserol, propylenglykol, polyetylenglykol og liknende), karboksymetylcellulose samt egnede blandinger derav, vegetabilske oljer (så som olivenolje) samt injiserbare organiske estere så som etyloleat. Sammensetningene ifølge foreliggende oppfinnelse kan også inneholde additiver så som, men ikke begrenset til preservativer, fuktemidler, emulgeringsmidler og dispergeringsmider. Antibakterielle og antifungale midler kan bli innbefattet for å forhindre vekst av mikrober og innbefatter f.eks. paraben, klorbutanol, fenol, sorbinsyre og liknende. Videre kan det være ønskelig å innbefatte isotone midler så som sukkere, natriumklorid og liknende. I enkelte tilfeller for å forlenge virkningen, er det ønskelig å forsinke absorpsjonen av FSH (og andre aktive ingredienser om de er til stede) fra subkutan eller intramuskulær injeksjon. Dette kan bli oppnådd ved anvendelse av en flytende suspensjon av krystallinsk eller amorft materiale med dårlig vannoppløselighet. Absorpsjonsgraden av FSH avhenger da av dens oppløsningshastighet som i sin tur kan avhenge av krystallstørrelse og krystallinsk form. Alternativt blir forsinket absorpsjon av en parenteralt administrert FSH-kombinasjonsform oppnådd ved å løse opp eller suspendere FSH-kombinasjonen i en oljevehikkel. Injiserbare depotformer kan bli laget ved å danne mikroinnkapselbare matriser av FSH-materialet (og andre midler, om til stede) i bionedbrytbare polymerer så som polylaktid-polyglykolid. Avhengig av forholdet mellom FSH og polymer og naturen av den spesielle polymer som benyttes, kan graden av FSH-frigjøring bli kontrollert. Eksempler på andre bionedbrytbare polymerer innbefatter polyvinylpyrrolidon, poly(ortoestere), poly(anhydrider), etc. Injiserbare depotformuleringer blir også fremstilt ved å innfange FSH-materialet i liposomer eller mikroemulsjoner somer kompatible med kroppsvev. Injiserbare formuleringer kan bli sterilisert f.eks. ved filtrering gjennom et bakterie-tilbakeholdende filter eller ved å innbefatte steriliseringsmidler i form av sterile faste sammensetninger som kan bli oppløst eller dispergert i sterilt vann eller annet sterilt injiserbart medium like før bruk. Injiserbare formuleringer kan bli tilført i enhver passende beholder, f.eks. ampulle, forhåndsfylt sprøyte, injeksjonspatroner og liknende.

11 9 1 Injiserbare formuleringer kan bli presentert som et produkt som har farmasøytiske sammensetninger inneholdende FSH (eventuelt med hcg, LH, etc.) og dersom det finnes mer enn en aktiv ingrediens (dvs. FSH og f.eks. hcg eller LH), kan disse være egnet for administrasjon separat eller sammen. Om administrert separat, kan administrasjonen være sekvensiell. Produktet kan bli presentert i enhver passende forpakning. For eksempel kan et produkt inneholde et antall forhåndsfylte sprøyter inneholdende enten FSH, hcg eller en kombinasjon av både FSH og hcg, hvor sprøyten er pakket i en blisterpakning eler på annen måte for å opprettholde sterilitet. Et produkt kan eventuelt inneholde instruksjoner for å bruke FSH- og hcg-formuleringene. ph og nøyaktig konsentrasjon av de forskjellige komponenter av den farmasøytiske sammensetningen justeres i samsvar med rutinemessig praksis innen området. Se GOODMAN og GILMANs THE PHARMACOLOGICAL BASIS FOR THERAPEU- TICS, 7. utg. I en foretrukket utførelsesform blir sammensetningene ifølge oppfinnelsen presentert som sammensetninger for parenteral administrasjon. Generelle metoder for fremstillingen av de parenterale formuleringer er kjent innen faget og er beskrevet i REMINGTON, THE SCIENCE AND PRACTICE OF PHARMACY, ovenfor, side De parenterale sammensetningene kan bli presentert i flytende formulering eller som et faststoff som vil bli blandet med et sterilt injiserbart medium like før administrasjon. I en spesielt foretrukket utførelsesform blir de parenterale sammensetninger presentert i enhetsdoseform for enkelhet ved administrasjon og doseuniformitet. Detaljert beskrivelse av oppfinnelsen 2 Foreliggende oppfinnelse vil nå bli beskrevet i større detalj under henvisning til de følgende eksempler og de medfølgende figurer hvor: 3 Figur 1 viser et plasmidkart av pfshalfa/beta ekspresjonsvektoren; Figur 2 viser α2,3-sialyltransferase (ST3GAL4) ekspresjonsvektoren; Figur 3 viser α2,6-sialyltransferase (ST6GAL1) ekspresjonsvektoren; Figur 4 viser isoelektrisk fokusering av rekombinant FSH dannet av Per.C6- celler som stabilt uttrykker FSH; Figur viser eksempel på kloner som er analysert med isoelektrisk fokusering av rekombinant FSH dannet av Per.C6-celler som stabilt uttrykker FSH etter manipulering med α2,3- eller α2,6-sialyltransferase; Figur 6 viser analyse av sialsyre med bindinger av Per.C6 FSH; Figur 7 viser metabolske fjerningshastigheter (MCR) av Per.C6 FSH-prøver;

12 Figur 8 viser MCR av α2,6-sialyltransferase-manipulerte Per.C6 FSh-prøver; Figur 9 viser MCR av α2,6-sialyltransferase-manipulerte Per-C6 FSH-prøver; Figur viser MCR av α2,3-sialyltransferase-manipulerte Per-C6 FSHprøver; Figur 11 viser ovarial vektøkning med Per.C6 rfsh-kloner av parentalt Per.C6 rfsh i henhold til fremgangsmåten til Steelman og Pohley (193); Figur 12 viser ovarial vektøkning med Per-C6 rfsh-kloner av manipulert (α2,6-sialyltransferase) Per.C6 rfsh; og Figur 13 viser ovarial vektøkning med Per-C6 rfsh-kloner og manipulert (α2,3-sialyltransferase) PerC6 rfsh. Sekvensutvelgelse Human FSH 1 Det kodende område av genet for FSH alfa-polypeptid ble brukt i henhold til Fiddes og Goodman (1981). Sekvensen er angitt som AH og ved tiden for konstruksjon fantes det ingen andre varianter av denne proteinsekvensen. Sekvensen blir referert til heri som SEQ ID 1. Det kodende område av genet for FSH beta-polypeptid ble brukt i henhold til Keene et al. (1989). Sekvensen er angitt som NM_000 og ved tiden for konstruksjon fantes det ingen andre varianter av denne proteinsekvensen. Sekvensen er referert til heri som SEQ ID 2. 2 Sialyltransferase α2,3-sialyltransferase Det kodende område av genet for beta-galaktosid alfa-2,3-sialyltansferase 4 (α2,3-sialyltansferase, ST3GAL4) ble brukt i henhold til Kitagawa og Paulson (1994). Sekvensen er angitt som L23767 og er referert til heri som SEQ ID 3. α2,6-sialyltransferase Det kodende område av genet for betagalaktosamid alfa-2,6-sialyltarnsferase 1 (α2,6-sialyltansferase, ST8GAL1) ble brukt i henhold til Grundmann et al. (1990). Sekvensen er angitt som NM_0032 og er referert til heri som SEQ ID 4. 3

13 11 EKSEMPLER Eksempel 1 Konstruksjon av FSH ekspresjonsvektoren Den kodende sekvens av FSH alfa-polypeptid (AH007338, SEQ ID 1) og FSH beta polypeptid (NM_0032, SEQ ID 2) ble amplifikert med PCR ved å bruke henholdsvis primer-kombinasjonene FSHa-fw og FSHa-rev og FSHb-fw og FSHb-rec. FSHa-fw -CCAGGATCCGCCACCATGGATTACTACAGAAAAATATGC-3 FSHa-rev -GGATGGCTAGCTTAAGATTTGTGATAATAAC-3 FSHb-fw -CCAGGCGCGCCACCATGAAGACACTCCAGTTTTTC-3 FSHb-rev -CCGGGTTAACTTATTATTCTTTCATTTCACCAAAGG-3 1 Det resulterende amplifikerte FSH beta-dna ble spaltet med restriksjonsenzymer AscI og HpaI og satt inn i AscI- og HpaI-setene på den CMV-drevne pattedyr ekspresjonsvektor som bærer en neomycin utvelgelsesmarkør. På liknende måte ble FSH alfa-dna spaltet med BamHI og NheI og satt inn i BamHI- og NheI-setene på ekspresjonsvektoren som allerede FSH beta polypeptid-dna. Vektor DNA-materialet ble brukt til å transformere DHα-stammen av E. coli. Seksti kolonier ble utvalgt for amplifikasjon og femtisyv inneholdt vektoren inneholdende både FSH alfa og beta. Tyve av disse ble valgt ut for sekvensering og alle inneholdt de korrekte sekvenser i henhold til SEQ ID 1 og SEQ ID 2. Plasmid pfsh A+B#17 ble valgt ut for transfeksjon (Figur 1). 2 Eksempel 2 Konstruksjon av ST3 ekspresjonsvektoren Den kodende sekvens av beta-galaktosidase alfa-2,3-sialyltransferase 4 (ST3, L23767, SEQ ID 3) ble amplifikert med PCR ved å bruke primerkombinasjonen 2,3STfw og 2,3Strev. 2,3STfw -CCAGGATCCGCCACCATGTGTCCTGCAGGCTGGAAGC-3 2,3STrev -TTTTTTTCTTAAGTCAGAAGGACGTGAGGTTCTTG-3 3 Det resulterende amplifikerte ST3 DNA ble spaltet med restriksjonsenzymene BamHI og AflII og satt inn i BamHI- og AflII-setene på CMV-drevet pattedyr eskpresjonsvektoren som bærer hygromycin resistensmarkøren. Vektoren ble amplifikert som tidligere beskrevet og sekvensert. Klon pst3#1 (figur 2) inneholdt den korrekte sekvens ifølge SEQ ID 3 og ble valgt ut for transfeksjon.

14 12 Eksempel 3 Konstruksjon av ST6 ekspesjonsvektoren Den kodende sekvens av beta-galaktosamid alfa-2,6-sialyltransferase 1 (ST6, NM_0032, SEQ ID 4) ble amplifikert med PCR ved å bruke primerkombinasjonen 2,6STfw og 2,6Strev. 2,6STfw -CCAGGATCCGCCACCATGATTCACACCAACCTGAAG-3 2,6STrev -TTTTTTTCTTAAGTTAGCAGTGAATGGTCCGG-3 Det resulterende amplifikerte ST6 DNA ble spaltet med restriksjonsenzymene BamHI og AflII og satt inn i BamHI- og AflII-setene på den CMV-drevne pattedyr ekspresjonsvektoren som bærer en hygromycin resistensmarkør. Vektoren ble amplifikert som tidligere forklart og sekvensert. Klon pst6#11 (Figur 3) inneholdt den korrekte sekvens ifølge SEQ ID 4 og ble valgt ut for transfeksjon. 1 Eksempel 4 Stabil ekspresjon av pfsh A+B i Per-C6-celler. Transfeksjonsisolasjon og utvelgelse av kloner 2 3 Per.C6-kloner som danner FSH ble generert ved å uttrykke begge polypeptidkjeder av FSH fra et enkelt plasmid (se eksempel 1). For å oppnå stabile kloner, ble det anvendt et liposom-basert transfeksjonsmiddel med pfsh A+B-konstruktet. Stabile kloner ble valgt ut i VPRO supplementert med % FCS og inneholdende G418. Tre uker etter transfeksjon vokste G418-resistente kloner ut. Et totale av kloner ble valgt for isolasjon. De isolerte kloner ble dyrket i seleksjonsmedium inntil 70-80% konfluente. Supernatanter ble undersøkt for FSH-proteininnhold ved å bruke et FSH-selektivt ELISA og farmakologisk aktivitet ved FSH-reseptoren i konet cellelinje ved å bruke et camp akkumuleringsassay. Kloner (98) som uttrykte funksjonelt protein ble ført videre til kulturekspansjon til 24 brønners, 6 brønners og T80-flasker. Studier for å bestemme produktiviteten og kvaliteten av materialet fra syv kloner ble initiert i T80-flasker for å generere tilstrekkelig materiale. Produktivitet ble bestemt ved å bruke FSH-selektivt ELISA. Den isoelektriske profil av materialet ble bestemt (Eksempel 6). Representative prøver er vist i Figur 4. Informasjonen fra IEF-forsøket ble brukt for å velge ut kloner for metabolsk fjerningshastighetsanalyse (Eksempel 9). Kloner (00, 4, 179, 223, 144) med tilstrekkelig produktivitet og kvalitet ble valgt ut for sialyltransferase-manipulering.

15 13 Eksempel Sialyleringsnivå er øket i celler som overuttrykker α2,3- eller α2,6-sialyltransferase. Stabil ekspresjon av pst3 eller pst6 i FSHoveruttrykkende Per.C6-celler. Transfeksjon isolasjon og utvelgelse av kloner 1 2 Per-C6-kloner som danner høyt sialylert FSH ble dannet ved å uttrykke α2,3 sialyltransferase eller α2,6 sialyltransferase fra separate plasmider (se Eksempel 2 og 3) i Per.C6-celelr som på forhånd uttrykker begge polypeptidkjeder av FSH (se Eksempel 4). Fire koner dannet fra PER.C6 -celler som angitt i Eksempel 4, ble valgt ut for sine karakteristika innbefattende produktivitet, god vekstprofil, produksjon av funksjonelt protein og produsert FSH som inkluderte noe sialylering. Stabile kloner ble generert som tidligere beskrevet i Eksempel 4. Et totale på 2 kloner fra α2,3-sialyltransferase-programmet og 2 kloner fra α2,6- sialyltransferase-programmet ble isolert, ekspandert og undersøkt. Den endelige kloneantall for α2,3-studien var 12 og for α2,6-studien. α2,3-sialyltransferase-klonene ble tilpasset serumfritt medium og suspensjonsbetingelser. Som tidligere ble kloner undersøkt ved å bruke en FSH-selektiv ELISA, funksjonell respons i en FSH-reseptor cellelinje, IEF (Eksempel 6), metabolsk fjerningshastighet (Eksempel 9) og Steelman Pohley-analyse (Eksempel ). Resultater ble sammenlignet med en kommersielt tilgjengelig rekombinant FSH (Gonal-f, Serono) og de parentale FSH Per.C6 cellelinjer. Representative prøver er vist i Figur. Enkelte kloner viste ikke noen økning i sialylering, men det kan bli observert at FSH dannet av de fleste av klonene hadde vesentlig øket sialylering (dvs. gjennomsnittlig mer FSH isoformer med høye antall sialsyrer) i forhold til FSH uttrykt uten α2,3- eller α2,6-sialyltransferase. Som konklusjon resulterer ekspresjon av FSH sammen med sialyltransferase i Per-C6-celler i økede nivåer av sialylert FSH i forhold til celler som uttrykker FSH alene. Eksempel 6 Analyse av pi av Per-C6-fremstilt FSH-isoformer med isoelektrisk fokusering 3 Elektroforese er definert som transporten av ladete molekyler gjennom et oppløsningsmiddel med et elektrisk felt. Mobiliteten av et biologisk molekyl gjennom et elektrisk felt vil avhenge av feltstyrken, netto ladning på molekylet, størrelse og form av molekylet, ionestyrken og egenskapene av mediet gjennom hvilket molekylet migrerer.

16 14 1 Isoelektrisk fokusering (IEF) er en elektrofortisk teknikk for separasjon av proteiner basert på deres pi. pi er den ph hvor et protein ikke har noen ladning og ikke vil migrere i et elektrisk felt. Sialsyreinnholdet av FSH isoformer endrer litt pipunktet for hver isoform, noe som kan bli utnyttet ved å bruke denne teknikken til å visualisere Per.C6 FSH-isoformene fra hver klon. De isoelektriske punkter av Per.C6-produsert FSH-isoformer i cellekultursupernatanter ble analysert ved å bruke isoelektrisk fokusering. Cellekulturmedia fra Per-C6 FSH-kloner ble fremstilt som beskrevet i Eksempel 4 og. Per.C6 FSH-prøver ble separert på Novex IEF-geler inneholdende % polyakrylamid under native betingelser på en ph 3,0-7,0-gradient i en amfolyttoppløsning ph 3,0-7,0. Proteiner ble overført på støttet nitrocellulose og visualisert ved å bruke et primært anti-fshα monoklonalt antistoff, sekundært anti-mus IgG alkalisk fosfatase-konjugert antistoff og -brom-4-klor-3-indolyl-fosfat (BCP) og nitro-blå tetrazolium (NBT)-reagens for å visualisere båndene. Som vist i Figur 4 og representerer båndene isoformer av FSH inneholdende forskjellige antall sialsyremolekyler. Ved å bruke denne metoden ble kloner som danner FSH-isoformer med et høyere antall sialsyremolekyler, identifisert. Manipulering med α2,3- eller α2,6- sialyltransferase resulterte i kloner med mer sialsyre og en lavere pi. Eksempel 7 Analyse av sialyrebindinger av Per.C6 FSH 2 3 Glykokonjugater ble analysert ved å bruke en lektin-basert differensieringsmetode. Med denne metoden kan glykoproteiner bundet til nitrocellulose bli karakterisert. Lektiner gjenkjenner selektivt en spesiell enhet, f.eks. α2,3-bundet sialsyre. Lektinene som blir tilsatt, er konjugert med steroidet hapten digoksygenin som tillater immunologisk påvisning av de bundne lektiner. Renset Per.C6 FSH fra en parental klon (ingen ekstra sialyltransferase) ble en α2,3-silalyltransferase-manipulert klon og en α2,6-sialyltransfersase-manipulert klon separert ved å bruke standard SDS-PAGE-teknikker. Et kommersielt tilgjengelig rekombinant FSH (Gonal-f, Serono) ble brukt som en standard. Sialsyre ble analysert ved å bruke DIG Glycan Differentiation Kit (Kat. nr , Roche) i henhold til produsentens instruksjoner. Positive reaksjoner med Sambucus nigra agglutinin (SNA) indikerte terminalt bundet (2-6) sialsyre. Positive reaksjoner med Maackia amurensis agglutinin II (MAA) indikerte terminalt bundet (α2-3) sialsyre.

17 1 Som oppsummering inneholdt den parentale klon 00 lave nivåer av både α2,3- og α2,6-sialsyre. Klonene manipulert med α2,3-sialsyretransferase inneholdt høye nivåer av α2,3- sialsyrebindinger og lave nivåer α2,6-sialsyrebindinger. Kloner manipulert med α2,6-sialsyretransfrase inneholdt høye nivåer av α2,6- sialsyrebindinger og lave nivåer av α2,3- sialsyrebindinger. Standardkontrollen Gonal-f inneholder kun α2,3- sialsyrebindinger. Dette er konsistent med hva som er kjent omkring rekombinante proteiner dannet i kinesisk hamster ovarieceller (CHO) (Kagawa et al., 1988, Takeuchi et al., 1988, Svensson et al., 1990). Som konklusjon økte manipulering av Per.C6 FSH-celler med α2,3- eller α2,6-sialyltransferase antallet sialsyremolekyler konjugert til FSH-materialet i prøven. Eksempel 8 Mengdebestemmelse av totalt sialsyre 1 2 Sialsyre er et protein-bundet karbohydrat som er ansett å være et monosakkarid og opptrer i kombinasjon med andre mono-sakkarider lik galaktose, mannose, glukosamin og fukose. Det totale sialsyre på renset rfsh (Eksempel 11) ble målt ved å bruke en enzymatisk sialsyre mengdebestemmelsessett i henhold til produsentens instruksjoner (Sigma, Sialic-Q). Kort fortalt katalyserer N-acetylnuraminsyre aldolase sialsyre til N-acetylmannoasin og druesyre. Druesyren kan bli redusert til melkesyre med β-nadh og melkesyredehydrogenase. β-nadh-oksydering kan bli målt nøyaktig spektrofotometrisk. Proteinkonsentrasjonen ble målt i mikrotiterplater ved å bruke et kommersielt bicinkoninsyre (BCA) assaysett (Sigma, B 9643) basert på Lowry-metoden (Lowry et al., 191). Det totale sialsyreinnhold av Per.C6 FSH ble målt og funnet å være større enn 6 mol/mol. Eksempel 8b Mengdebestemmelse av relative mengder av α2,3, α2,6 og α2,8 sialsyre 3 De relative prosentvise mengder av α2,3-, α2,6- og α2,8-sialsyre på renset rfsh (Eksempel 11) ble målt ved å bruke kjente teknikker. Hver prøve av rfsh ble immobilisert (gel blokk), vasket, redusert, alkylert og spaltet med PNGase F over natten. N-glykanene ble så ekstrahert og prosessert. N-glykaner for NP-HPLC- og WAX-HPLC-analyse ble merket med fluoroforen 2AB som angitt i Royle et al. N-glykanene ble kjørt på normal fase (NP) HPLC på

18 16 1 en TSK amidkolonne (som angitt i Royle et al.) med retensjonstider uttrykt i glukose-enheter (GU). Prøver av de ekstraherte, sammenslåtte glykaner (ekstrahert som ovenfor) ble spaltet med forskjellige sialidaser for å bestemme bindingene. NAN 1 (rekombinant sialidase) frigjør α2,3-bundne ikke-reduserende terminale sialsyrer (NeuNAc og NeuNGc), ABS (Arthrobacter ureafaciens sialidase) frigjør α2,3, α2,6- og α2,8- bundet ikke-reduserende terminals sialsyrer (NeuNAc og NeuNGc). Prøver ble analysert med NP-HPLC for å tillate sammenligning av den uspaltede prøve med den spaltet med NAN1 og den spaltet med ABS. Sammenligning av de tre NP-HPLCspor (uspaltet, NAN1-spaltet, ABS-spaltet) viser at spaltning med ABS og NAN1 gir forskjellige resultater. Dette indikerer at prøvene har sialsyrer med α2,3-, α2,6- og α2,8-bindinger. De relative prosentdeler ble regnet ut fra strukturer som er til stede i det uspaltede glykanmaterialet og ble funnet å være i området 6% - 8% (f.eks. 77,7%) for α2,3-sialylering, 1 til 3% (f.eks. 21,46%) for α2,6-sialylering og 0,1 til 3% for α2,8-sialylering. Eksempel 8c Mengdebestemmelse av relative mengder mono-, di- tri- og tetra-antennære sialylerte strukturer 2 De relative prosentvise mengder av mono-, di-, tri- og tetra-sialylerte strukturer på glykaner ekstrahert fra renset rfsh (Eksempel 11) ble målt ved å bruke kjente teknikker. Hver prøve av rfsh ble immobilisert (gel blokk), vasket, redusert, alkylert og spaltet med PNGase F over natten. N-glykanene ble så ekstrahert og prosessert. N-glykaner for NP-HPLC- og WAX-HPLC-analyse ble merket med fluoroforen 2AB som beskrevet i Royle et al. Svak anionebytter (WAX) HPLC for å separere N- glykanene ut fra ladning (Eksempel 8b) ble utført som angitt i Royle et al. med en Fetuin N-glykan-standard som referanse. Glykaner ble eluert i henhold til antallet sialsyrer som de inneholdt. Alle prøver hadde mono (1S), di (2S), tri (3S) og tetra (4S) sialylerte strukturer. De relative mengder av sialylerte strukturer ble funnet å være i de følgende forhold (1S:2S:4S:4S): 9-1:27-%:-36%:2-29% (f.eks.,24:28,6:3,49:2,62). Eksempel 9 Bestemmelse av de metabolske fjerningshastigheter av rfsh 3 For å bestemme de metabolske fjerningshastigheter (MCR) av Per.C6 FSHprøver, ble bevisste hunnrotter (3 dyr per klon) injisert i halevenen på nulltidspunktet med en bolus av rfsh (1 µg/rotte basert på ELISA mengdebestemmelse av

19 17 1 prøver, DRG EIA 1288). Blodprøver (400 µl) ble tatt fra tuppen av halen ved 1, 2, 4, 8, 12, 14 og 32 timer etter forsøksprøveinjeksjon. Serum ble smalet opp med sentrifugering og undersøkt for FSH-innhold med ELISA (DRG EIA 1288). Asialoglykoprotein-reseptor (ASGP-R) gjenkjenner desialylerte (galatoseterminerte) glykoproteiner så som asialofetuin (ASF). (Pricer og Ashwell, Van Lenten og Ashwell, 1972). ASGP-reseptoren og det bundne desialylerte glykoprotein blir internalisert i cellen hvor reseptoren blir gjenbrukt og liganden blir degradert (Regoeczi et al., 1978, Steer og Ashwell, 1980). For å undersøke om Per.C6 FSH-materiale ble fjernet via denne mekanismen, ble ASGP-R mettet med asialofetuin. Den metabolske fjerningshastighet av parental, α2,6 eller α2,3-sialyltransferase-manipulert materiale ble bestemt som beskrevet med samtidig administrasjon av et minst 700 gangers molart overskudd av asialofetuin for å mette ASGP-R i 1-2 timer. Materialet dannet av de parentale Per.C6 FSH-kloner inneholdt noe lengre MCR-materiale, men en høy prosentdel ble fjernet raskt (Fig. 7). Ledeklonen 00, som inneholdt det meste sialylerte materiale, var manipulert ved å bruke α2,6- eller α2,3-sialyltransferase (Eksempel ). Selv om klonene manipulert med α2,6- sialyltransferase viste øket sialylering (Figur ) var det ingen forbedring i MCR (Figur 7). Blokkering av ASGR restaurerte MCR av α2,6-materialet til den av standarden, noe som viser at selv med økete α2,6-bindinger blir materialet fjernet raskt (Figur8). Manipulering med α2,3-sialyltransferase resulterte i kloner med sammenlignbar MCR som standarden (Figur 9) og varierende sialinnhold var konsistent med hva som er kjent for isoformer av FSH (Figur ). 2 Eksempel Steelman-Pohley in vivo assay 3 For å vise at økende sialsyreinnhold på FSH resulterer i en øket biologisk effekt, ble økningen i ovarievekter i rotter av høyt sialylert FSH så som fremstilt i Eksempel, undersøkt. Økningen i ovarievekter grunnet Per.C6 rfsh-kloner ble analysert i henhold til metoden til Steelman og Pohley (193). Per.C6 rfsh fra filtrerte cellemediumprøver ble mengdebestemt med ELISA (DRG, EIA-1288). Prøvene (Per.C6 rfsh) og standarder (Gonal-f rfsh) ble undersøkt ved fem forskjellige doser (3 dyr/dose). Gonal-f dosert ved 0, 0, 0, 400 og 800 ng/rotte. Prøvedosene ble regnet ut ved å bruke deres AUC-verdier i forhold til Gonal-f, typisk 0,0 µg/rotte. Som konklusjon var det undersialylerte materialet dannet av Per.C6 FSHklonene (Figur 11) ikke like virksomt i ovarievektøkningsassayet som det kommersielt tilgjengelige rfsh. Sialyltransferase-manipulering til å legge til ytterligere

20 18 α2,6-bindinger øket sialsyreinnholdet, men forbedret ikke virksomheten i in vivoassayet (Figur 12). Imidlertid forbedret ytterligere α2,3-bindinger i vesentlig grad effekten (Figur 13) og de to rekombinante FSH-preparater (Per.C6 og CHO-avledet) oppviser svært like profiler i dette assayet. Eksempel 11 Fremstilling og opprenskningsoversikt En prosedyre ble utviklet for å danne FSH i PER.C6-celler som ble dyrket i suspensjon i serumfritt medium. Prosedyren er beskrevet nedenfor og ble anvendt på flere FSH-produserende PER.C6 cellelinjer. FSH fra den parentale klon 00, α2,3-klon 007 og α2,6-klon 09 ble dannet ved å bruke en modifikasjon av metoden beskrevet av Lowry et al. (1976). For fremstillingen av PER.C6-FSH ble cellelinjene tilpasset til et serum-fritt medium, dvs. Excell 2 (JRH Biosciences). Cellene ble først dyrket for å danne et 70%-90% konfluent monolag i en T80 kulturflaske. Ved passasje ble cellene resuspendert i det serum-frie medium, Excell mm L-glutamin, til en celletetthet på 0,3x 6 celler/ml. En 2 ml cellesuspensjon ble plassert i en ml risteflaske og ble ristet ved 0 rpm ved 37 C ved % CO 2. Etter å ha nådd en celletetthet på >1x 6 celler/ml ble cellene subdyrket til en celletetthet på 0,2 eller 0,3x 6 celler/ml og videre dyrket i risteflasker ved 37 C, % CO 2 og 0 rpm. For fremstilling av FSH ble cellene overført til et serum-fritt produksjonsmedium, dvs. VPRO (JRH Biosciences) som støtter veksten av PER.C6-celler til svært høye celletettheter (vanligvis > 7 celler/ml i en batch-kultur). Cellene ble først dyrket til > 1x 6 celler/ml i Excell 2, derpå sentrifugert ned i min ved 00 rpm og etterfølgende suspendert i VPRO-medium + 6 mm L-glutamin til en tetthet på 1x 6 celler/ml. Cellene ble så dyrket i en risteflaske i 7- dager ved 37 C, % CO 2 og 0 rpm. I løpet av denne perioden vokste cellene til en tetthet på > 7 celler/ml. Dyrkningsmediet ble innhøstet etter at celletettheten startet å synke. Cellene ble sentrifugert ned i min ved 00 rpm og supernatanten ble brukt for mengdebestemmelse og opprenskning av FSH. Konsentrasjonen av FSH ble bestemt ved å bruke ELISA (DRG EIA 1288). Deretter ble opprenskning av FSH utført ved å bruke en modifikasjon av metoden beskrevet av Lowry et al. (1976). Dette ble utført med kromatografi på DEAE cellulose, gelfiltrering på Sephadex G0 absorpsjonskromatografi på hydroksyapatitt og preparativ polyakrylamid-elektroforese. Under alle kromatografiske prosedyrer ble tilstedeværelsen av immunoreaktiv FSH bekreftet med RIA (DRG EIA 1288) og IEF (Eksempel 6).

21 19 Referanser Andersen CY, Westergaard LG, and van Wely M. (04). FSH isoform composition of commercial gonadotrophin preparations: a neglected aspect? Reprod Biomed Online. 9(2), Arey BJ, Stevis PE, Deecher DC, Shen ES, Frail DE, Negro-Vilar A, and Lopez FJ. (1997) Induction of promiscuous G protein coupling of the follicle-stimulating hormone (FSH) receptor: a novel mechanism for transducing pleiotropic actions of FSH isoforms. Mol Endocrinol. 11(), Baenziger JU and Green ED. (1988). Pituitary glycoprotein hormone oligosaccharides: structure, synthesis and function of the asparagine-linked oligosaccharides on lutropin, follitropin and thyrotropin. Biochim Biophys Acta. 947 (2), Bassett RM, and Driebergen R. (0). Continued improvements in the quality and consistency of follitropin alfa, recombinant human FSH. Reprod Biomed Online. (2), Damian-Matsumura P, Zaga V, Maldonado A, Sánchez-Hernández C, Timossi C, and Ulloa-Aguirre A. (1999). Oestrogens regulate pituitary alpha2,3- sialyltransferase messenger ribonucleic acid levels in the female rat. J Mol Endocrinol. 23(2), D Antonio M., Borrelli F., Datola A., Bucci R., Mascia M., Polletta P., Piscitelli D., and Papoian R. (1999) Biological characterization of recombinant human follicle stimulating hormone isoforms. Human Reproduction 14, Dalpathado DS, Irungu J, Go EP, Butnev VY, Norton K, Bousfield GR, and Desaire H. (06). Comparative glycomicsof the glycoprotein follicle stimulating hormone: glycopeptide analysis of isolates from two mammalian species. Biochemistry. 4(28), No copy. Dias JA, Van Roey P. (01). Structural biology of human follitropin and its receptor. Arch Med Res. 32(6), -19. Fiddes, J. C. and Goodman, H. M. (1979) Isolation, cloning and sequence analysis of the cdna for the alpha-subunit of human chorionic gonadotropin. Nature, 281, Flack, M.R., Bennet, A.P., Froehlich, J. Anasti, JN and Nisula, B. (1994). Increased biological activity due to basic isoforms in recombinant human folliclestimulating hormone produced in a human cell line. J. Clin. Endocrinol. Metab., 79, Fox KM, Dias JA, and Van Roey P. (01). Three-dimensional structure of human follicle-stimulating hormone. Mol Endocrinol. 1(3),

22 1 2 3 Grabenhorst E, Hoffmann A, Nimtz M, Zettlmeissl G, and Conradt HS. (199). Construction of stable BHK-21 cells coexpressing human secretory glycoproteins and human Gal(beta 1-4)GlcNAc-R alpha 2,6-sialyltransferase alpha 2,6- linked NeuAc is preferentially attached to the Gal(beta 1-4)GlcNAc(beta 1-2)Man(alpha 1-3)-branch of diantennary oligosaccharides from secreted recombinant beta-trace protein. Eur J Biochem. 232(3), Green ED and Baenziger JU. (1988). Asparagine-linked oligosaccharides on lutropin, follitropin, and thyrotropin. II. Distributions of sulfated and sialylated oligosaccharides on bovine, ovine, and human pituitary glycoprotein hormones. J Biol Chem. 263(1), Grundmann,U., Nerlich,C., Rein,T. and Zettlmeissl, G. (1990). Complete cdna sequence encoding human betagalactoside alpha-2,6-sialyltransferase. G Nucleic Acids Res. 18(3), 667. Howles, C.M. (1996). Genetic engineering of human FSH (Gonal-F). Hum Reprod. Update, 2, Kagawa Y, Takasaki S, Utsumi J, Hosoi K, Shimizu H, Kochibe N, and Kobata A. (1988). Comparative study of the asparagine-linked sugar chains of natural human interferon-beta 1 and recombinant human interferon-beta 1 produced by three different mammalian cells. J Biol Chem. 263(33), Keene, J.L., Matzuk, M.M., Otani, T., Fauser, B,C,J,M., Galway, A.B., Hsueh, A.J.W. and Boime, I. (1989). Expression of Biologically active Human Follitropin in Chinese Hamster Ovary Cells. The Journal of Biological Chemistry, 264 (9), Kitagawa, H. and Paulson,J.C (1994) Cloning of a novel alpha 2,3- sialyltransferase that sialylates glycoprotein and glycolipid carbohydrate groups. J. Biol. Chem. 269(2), Lee EU, Roth J, and Paulson JC (1989) Alteration of terminal glycosylation sequences on N-linked oligosaccharides of Chinese hamster ovary cells by expression of beta-galactoside alpha 2,6-sialyltransferase. J Biol Chem. 264(23), de Leeuw, R., Mulders, J., Voortman, G. Rombout, F. Damm, J. and Kloosterboer, L. (1996) Structure-function relationship of recombinant follicle stimulating hormone (Puregon). Mol. Hum. Reprod., 2, Lowry OH, Rosebrough NJ, Farr AL, Randall RJ. (191) Protein measurement with the Folin phenol reagent. J Biol Chem. 193(1), Lowry, PJ, McLean, C, Jones RL and Satgunasingam N. (1976) Purification of anterior pituitary and hypothalamic hormones Clin Pathol Suppl (Assoc Clin Pathol). 7,

23 Pierce JG, and Parsons TF (1981) Glycoprotein hormones: structure and function Annu Rev Biochem. 0, Pricer WE Jr, and Ashwell G. (1971). The binding of desialylated glycoproteins by plasma membranes of rat liver. J Biol Chem. 246(1), Rathnam P, and Saxena BB. (197). Primary amino acid sequence of folliclestimulating hormone from human pituitary glands. I. alpha subunit. J Biol Chem.;(17): Regoeczi E, Debanne MT, Hatton MC, and Koj A. (1978) Elimination of asialofetuin and asialoorosomucoid by the intact rat. Quantitative aspects of the hepatic clearance mechanism. Biochim Biophys Acta. 41(3), Royle L, Radcliffe CM, Dwek RA and Rudd PM (06) Methods in Molecular Biology, ed I Brockhausen-Schutzbach (Humana Press), 347: Glycobiology protocols, Ryan RJ, Keutmann HT, Charlesworth MC, McCormick DJ, Milius RP, Calvo FO and Vutyavanich T. (1987). Structure-function relationships of gonadotropins. Recent Prog Horm Res.;43,: Saxena BB and Rathnam P. (1976) Amino acid sequence of the beta subunit of follicle-stimulating hormone from human pituitary glands. J Biol Chem. 21(4), Steelman SL, and Pohley FM. (193) Assay of the follicle stimulating hormone based on the augmentation with human chorionic gonadotropin. Endocrinology. 3(6), Steer CJ, and Ashwell G. (1980) Studies on a mammalian hepatic binding protein specific for asialoglycoproteins. Evidence for receptor recycling in isolated rat hepatocytes. J Biol Chem. 2(7), Svensson EC, Soreghan B, and Paulson JC. (1990) Organization of the betagalactoside alpha 2,6-sialyltransferase gene. Evidence for the transcriptional regulation of terminal glycosylation. J Biol Chem. 26(34): Takeuchi M, Takasaki S, Miyazaki H, Kato T, Hoshi S, Kochibe N, and Kobata A (1988). Comparative study of the asparagine-linked sugar chains of human erythropoietins purified from urine and the culture medium of recombinant Chinese hamster ovary cells. J Biol Chem. 263(8), Timossi CM, Barrios de Tomasi J, Zambrano E, González R, Ulloa-Aguirre A. (1998). A naturally occurring basically charged human follicle-stimulating hormone (FSH) variant inhibits FSH-induced androgen aromatization and tissuetype plasminogen activator enzyme activity in vitro. Neuroendocrinology. 67(3), Timossi CM, Barrios-de-Tomasi J, González-Suárez R, Arranz MC, Padmanabhan V, Conn PM, and Ulloa-Aguirre A. (00). Differential effects of the

24 charge variants of human follicle-stimulating hormone. J Endocrinol. 16(2), Ulloa-Aguirre, A., Espinoza, R., Damian-Matsumura, P. and Chappel, S.C. (1988) Immunological and biological potencies of the different molecular species of gonadotrophins. Hum. Reprod. 3, Ulloa-Aguirre, A., Cravioto, A., Damian-Matsumura, P. Jimenez, M, Zambrano, E and Diaz-Sanchez, V. (1992) Biological characterization of the naturally occurring analogues of intrapituitary human follicle stimulating hormone. Hum. Reprod. 7, 23-. Ulloa-Aguirre A, Midgley AR Jr, Beitins IZ, and Padmanabhan V. (199). Follicle-stimulating isohormones: characterization and physiological relevance. Endocr Rev. 16(6), Ulloa-Aguirre A, Maldonado A, Damián-Matsumura P, and Timossi C (01). Endocrine regulation of gonadotropin glycosylation. Arch Med Res. 32(6), -32. Ulloa-Aguirre A, Timossi C, Barrios-de-Tomasi J, Maldonado A, and Nayudu P. (03). Impact of carbohydrate heterogeneity in function of follicle-stimulating hormone: studies derived from in vitro and in vivo models. Biol Reprod. 69(2), Van Lenten L, and Ashwell G. (1972) The binding of desialylated glycoproteins by plasma membranes of rat liver. Development of a quantitative inhibition assay. J Biol Chem. 247(14), Wide, L. and Albertsson-Wikland, K. (1990) Change in electrophoretic mobility of human follicle-stimulating hormone in serum after administration of gonadotropin-releasing hormone. J. Clin. Endocrinol. Metab. 70, Wide, L. and Bakos, O. (1993). More basic forms of both human folliclestimulating hormone and luteinizing hormone in serum at midcycle compared with the follicular or luteal phase. J. Clin. Endocrinol. Metab., 76, Wide L, Naessén T, Sundström-Poromaa I, Eriksson K. (07) Sulfonation and sialylation of gonadotropins in women during the menstrual cycle, after menopause, and with polycystic ovarian syndrome and in men. J Clin Endocrinol Metab.;92(11), Zambrano E, Zarinán T, Olivares A, Barrios-de-Tomasi J, and Ulloa-Aguirre A. (1999). Receptor binding activity and in vitro biological activity of the human FSH charge isoforms as disclosed by heterologous and homologous assay systems: implications for the structure-function relationship of the FSH variants. Endocrine. (2), Zhang X, Lok SH, and Kon OL (1998) Stable expression of human alpha-2,6- sialyltransferase in Chinese hamster ovary cells: functional consequences for hu-

25 NO/EP man erythropoietin expression and bioactivity. Biochim Biophys Acta. 142(3), SEQ ID 1 Follikkel-stimulerende hormon alfa polypeptid Tilgangsnummer AH Nukleotidsekvens av FSH alfa 1 Proteinsekvens av FSH alfa 2 SEQ ID 2 Follikkel-stimulerende hormon beta polypeptid Tilgangsnummer NM_000 Nukleotidsekvens av FSH beta 3

26 NO/EP Proteinsekvens av FSH beta 2 SEQ ID 3 Beta-galaktosid alfa-2,3-sialyltransferase 4 Tilgangsnummer L23767 Nukleotidsekvens av ST3GAL4 3

27 NO/EP

28 26 Peptidsekvens av ST3GAL4 1 SEQ ID 4 Beta-galaktosamid alfa-2,6-sialyltransferase 1 Tilgangsnummer NM_0032 Nukleotidsekvens av ST6GAL1 2 3

29 NO/EP Op-proteinskvens av ST6GAL1

30 28

31 29 P a t e n t k r a v 1. Rekombinant FSH (rfsh) innbefattende α2,3- og α2,6-sialylering hvor 60% eller mer av den totale sialylering er α2,3-sialylering og fra til 40% av den totale sialylering er α2,6-sialylering; hvor det rekombinante FSH har et sialsyreinnhold [uttrykt som et forhold mellom sialsyre til mol av protein] på mol/mol til 1 mol/mol. 2. Rekombinant FSH ifølge krav 1, som ytterligere inkluderer α2,8-sialylering Farmasøytisk sammensetning omfattende rfsh innbefattende α2,3- sialylering og α2,6-sialylering hvor 60% eller mer av den totale sialylering er α2,3- sialylering og fra til 40% av den totale sialylering er α2,6-sialylering; hvor det rekombinante FSH har et sialsyreinnhold [uttrykt som et forhold mellom sialsyre til mol av protein] på mol/mol til 1 mol/mol. 4. Farmasøytisk sammensetning omfattende rfsh ifølge krav 2.. Farmasøytisk sammensetning ifølge krav 3 eller 4 ytterligere omfattende hcg og/eller LH. 6. Farmasøytisk sammensetning ifølge ethvert av kravene 3 til for anvendelse ved behandling av ufruktbarhet Fremgangsmåte for fremstilling av rfsh i henhold til ethvert av kravene 1 eller 2, omfattende trinnet å fremstille eller uttrykke slikt rfsh i en human cellelinje.

32 1 / 14 Figurer Fig. 1, 2 og 3: Plasmidkart av pfshalfa/beta, pst3 og pst6 ekspresjonsvektorer. CMW = Cytomegalovirus-promoter, BGHp(A) = Bovin Veksthormon polyadenyleringssekvens, fl ori = fl replikasjonsstart, SV40 = SImian Virus 40 promoter, Neo = Neomycin resistensmarkør, Hyg = Hygromycin resistensmarkør, SV40 p(a) = Simian Virus 40 polyadenyleringssekvens, FSH A = Follikkelstimulerende hormon alfa polypeptid, FSH B = Follikkel-stimulerende hormon beta polypeptid, ST3GAL4 = α2,3-sialyltransferase, ST6GAL1 = α2,6-sialyltransferase, ColE1 = ColE1 replikasjonsstart, Amp = ampicillin resistens-markør. Figur 1. FSH ekpresjonsvektor

33 2 / 14 Figur 2. α2,3-sialyltransferase (ST3GAL4) ekspresjonsvektor Figur 3. α2,6-sialyltransferase (ST6GAL1) ekspresjonsvektor

34 3 / 14 Figur 4. Isoelektrisk fokusering av rekombinant FSH dannet av Per.C6-celler som uttrykker stabilt FSH. Cellekultursupernatanter separert under native betingelser på en ph 3,0-7,0-grandient. Klon 00 er representativ for de fem kloner tatt forover for sialyltransferase-manupulering. Kloner inneholdende mindre sure isoformer ble kastet.

35 NO/EP / 14 Figur. Eksempel på kloner analysert med isoelektrisk fokusering av rekombinant FSH fremstilt av Per.C6-celler som uttrykker FSH stabilt etter manipulering med α2,3- eller α2,6-sialyltransferase. Cellekultur-supernatanter separert under native betingelser på en ph 3,0-7,0 gradient. Klon 00 er den parentale Per.C6 FSH cellelinje. Kloner som oppviser basiske eller blandete profiler ble kastet (*). De gjenværende kloner oppviser oppnådd manipulering med en sialyltransferase for å øke antallet sialsyremolekyler på FSH.

36 / 14 Figur 6. Analyse av sialsyrebindinger av Per.C6 FSH. Renset Per.C6 FSH ble separert med SDS PAGE på duplikat-geler, overført til nitrocellulose og visualisert ved å bruke et DIG Glykan Differensieringssett (Kat. nr , Roche) i henhold til produsentens instruksjoner. Positive reaksjoner med Sambucus nigra agglutinin (SNA) indikerte terminalt bundet (2-6) sialsyre (A). Positive reaksjoner med Maackia amurensis agglutinin (MAA) indikerte terminalt bundet (2-3) sialsyre (B). Spor I produsents kontroll inneholdende α2,6-bindinger alene. Spor II produsents kontroll inneholdende α2,6- og α2,3-bindinger. Prøve a, kommersiell CHO-avledet rekombinant FSH (Gonal-f, Serono). Prøve b, parental Per.C6 rfsh, ingen sialyl-transferase-manipulering. Prøve c, Per.C6 rfsh med α2,6- sialyltransferase-manipulering. Prøve d, Per.C6 rfsh med α2,3-sialyltransferasemanipulering. A

37 NO/EP / 14

38 NO/EP / 14

39 8 / 14 Figur 7. Metabolske fjerningshastigheter av Per-C6 FSH-prøver. Hunnrotter (3 dyr per klon) ble injisert i halevenen på tidspunkt null med en bolus av rfsh (1 µg/rotte). Blodprøver samlet opp over tid ble undersøkt for FSH-innhold med ELISA.

40 9 / 14 Figur 8. Metabolske fjerningshastigheter av α2,6-sialyltransferase-manipulerte Per- C6 FSH-prøver. Hunnrotter (3 dyr per klon) ble injisert i halevenen på tidspunkt null med en bolus av rfsh (1 µg/rotte). Blodprøver samlet opp over tid ble undersøkt for FSH-innhold med ELISA.

41 / 14 Figur 9. Metabolske fjerningshastigheter av α2,6-sialyltransferase-manipulerte Per- C6 FSH-prøver med samtidig administrasjon av et 700 gangers molart overskudd av asialofetuin for å mette ASGP-R i 1-2 timer.

42 11 / 14 Figur. Metabolske fjerningshastigheter av α2,3-sialyltransferase-manipulerte Per-C6 FSH-prøver. Prøver ble valgt for sitt sialsyre-innhold basert på sin IEFprofil.

43 12 / 14 Figur 11. Ovarivektøkning i henhold til metoden til Steelman og Pohley (193). Per.C6 rfsh og standarder (Gonal-f rfsh) ble undersøkt ved forskjellige doser (3 rotter/dose).

44 13 / 14 Figur 12. Ovarivektøkning i henhold til metoden til Steelman og Pohley (193). Α2,6-sialyltransfrease-manipulerte Per.C6 rfsh og standarder (Gonal-f rfsh) ble undersøkt ved forskjellige doser (3 rotter/dose).