(12) Oversettelse av europeisk patentskrift

Transkript

1 (12) Oversettelse av europeisk patentskrift (11) NO/EP B1 (19) NO NORGE (1) Int Cl. G01N 33/69 (06.01) G01N 33/68 (06.01) Patentstyret (21) Oversettelse publisert (80) Dato for Den Europeiske Patentmyndighets publisering av det meddelte patentet (86) Europeisk søknadsnr (86) Europeisk innleveringsdag (87) Den europeiske søknadens Publiseringsdato (30) Prioritet , GB, (84) Utpekte stater AT BE BG CH CY CZ DE DK EE ES FI FR GB GR HR HU IE IS IT LI LT LU LV MC MK MT NL NO PL PT RO SE SI SK TR (73) Innehaver MEDINNOVA AS, Rikshospitalet, 0027 OsloNorge (72) Oppfinner JOHNSEN, Lisbeth, Blastjerneveien 24, 147 FinstadjordetNorge BLENNOW, Kaj, Institute of Neuroscience and PhysiologyDepartment of Psychiatry and NeurochemistryThe Sahlgrenska Academy at University of GothenburgSU/Molndal V-huset, S Molndal, SE-Sverige FLADBY, Tormod, Department of NeurologyAkershus University HospitalSykehusveien 27, 1478 LorenskogNorge (74) Fullmektig Tandbergs Patentkontor AS, Postboks 170 Vika, 0118 OSLO, Norge (4) Benevnelse Diagnostisk fremgangsmåte (6) Anførte publikasjoner JUNG S S ET AL: "Beta-amyloid precursor protein is detectable on monocytes and is increased in Alzheimer's disease." NEUROBIOLOGY OF AGING, vol., no. 3, May 1999 (1999-0), pages , XP ISSN: WILCOCK DONNA M ET AL: "Passive amyloid immunotherapy clears amyloid and transiently activates microglia in a transgenic mouse model of amyloid deposition." THE JOURNAL OF NEUROSCIENCE : THE OFFICIAL JOURNAL OF THE SOCIETY FOR NEUROSCIENCE 7 JUL 04, vol. 24, no. 27, 7 July 04 ( ), pages , XP ISSN: MALER JUAN MANUEL ET AL: "Distinct fractional Abeta release patterns in human mononuclear phagocytes." JOURNAL OF NEUROIMMUNOLOGY, vol. 6, no. 1-2, 3 January 09 ( ), pages 1-4, XP ISSN: AVAGYAN ET AL: "Immune blood biomarkers of Alzheimer disease patients" JOURNAL OF NEUROIMMUNOLOGY, vol. 2, no. 1-2, 16 February 09 ( ), pages 67-72, XP FIALA MILAN ET AL: "Ineffective phagocytosis of amyloid-beta by macrophages of Alzheimer's disease patients" JOURNAL OF ALZHEIMER'S DISEASE, vol. 7, no. 3, 1 June 0 ( ), pages , XP00849 IOS PRESS, AMSTERDAM, NL ISSN: cited in the application DOS REIS-FILHO J B ET AL: "[Semiologic value of erythrocyte macrophages in the cerebrospinal fluid]" ARQUIVOS DE NEURO-PSIQUIATRIA, vol. 38, no. 3, 1 September 1980 ( ), pages , XP008 ACADEMIA BRASILEIRA DE NEUROLOGIA, SAO PAULO, BR ISSN: X

2 HASEGAWA K ET AL: "NF-kappaB activation in peripheral blood mononuclear cells in neonatal asphyxia." CLINICAL AND EXPERIMENTAL IMMUNOLOGY, vol. 132, no. 2, May 03 (03-0), pages , XP ISSN: BUDDENHAGEN F ET AL: "PHAGOCYTIC ACTIVITY OF CSF MONOCYTES IN NEUROLOGICAL DISEASES" JOURNAL OF NEUROLOGY - ZEITSCHRIFT FUER NEUROLOGIE, vol. 234, no. 4, 1 July 1987 ( ), pages 27-28, XP00826 SPRINGER VERLAG, BERLIN, DE ISSN: [retrieved on ] KIM YOON SEONG ET AL: "Microglia, major player in the brain inflammation: their roles in the pathogenesis of Parkinson's disease." EXPERIMENTAL & MOLECULAR MEDICINE, vol. 38, no. 4, 31 August 06 ( ), pages , XP ISSN: OE TOMOYUKI ET AL: "Quantitative analysis of amyloid beta peptides in cerebrospinal fluid of Alzheimer's disease patients by immunoaffinity purification and stable isotope dilution liquid chromatography/negative electrospray ionization tandem mass spectrometry." RAPID COMMUNICATIONS IN MASS SPECTROMETRY, vol., no. 24, 06, pages , XP ISSN: OIDE T ET AL: "Regression stage senile plaques in the natural course of Alzheimer's disease." NEUROPATHOLOGY AND APPLIED NEUROBIOLOGY, vol. 32, no., October 06 (06-), pages 39-6, XP ISSN: VEHMAS ANNE K ET AL: "Immune reactive cells in senile plaques and cognitive decline in Alzheimer's disease." NEUROBIOLOGY OF AGING (03 MAR-APR), vol. 24, no. 2, March 03 (03-03), pages , XP ISSN: LIU YANG ET AL: "LPS receptor (CD14): a receptor for phagocytosis of Alzheimer's amyloid peptide." BRAIN : A JOURNAL OF NEUROLOGY, vol. 128, no. Pt 8, August 0 (0-08), pages , XP ISSN:

3 1 OPPFINNELSENS OMRÅDE [0001] Den foreliggende oppfinnelsen vedrører en fremgangsmåte for detektering av nærvær av eller overvåkning av alvorlighetsgraden av en tilstand karakterisert ved nærværet av fragmenter av et markørprotein i hjernen til en pasient BAKGRUNN [0002] Alzheimers sykdom (AD) er klart den sykdommen som hyppigst forårsaker demens, og AD-lignende mekanismer som amyloidavsetning er også innblandet i de to nest vanligste årsakene, vaskulær (VaD) og demens med Lewy-legemer (DLB). AD har et langvarig forløp fra diagnosetidspunktet, og er også helseskadelig for omsorgspersonene [1, 2]. I et system med styrt forbruk av helsetjenester er AD også en alvorlig byrde for det offentlige helsevesenet [3], de økonomiske skadevirkningene i noen estimater er allerede større enn de for kreft, slag og hjertesykdom [4, ]. ADforekomsten øker fra % over 6 års alderen, til 0 % blant de over 8 år [6,7] og kan firedobles innen 0 på grunn av insidensrater som øker eksponentielt med alderen [8] og et større antall eldre [9]. [0003] I dag synes ser det ut til at en behandling mot progresjonen av Alzheimers sykdom (AD) er like rundt hjørnet []. Dette vil drastisk øke viktigheten av en nøyaktig tidlig diagnose, og vil endre forskningsfokuset mot en forståelse av prosessen med AD-sykdomsinduksjon. [0004] Karakteriseringen av pasienter med mild kognitiv svikt (MCI)[11] og nylig foreslåtte forskningskriterier for AD [12] bidrar til å identifisere en pasientgruppe med økt risiko for progressiv demens [13]. Det er kjent at AD-initiering og progresjon er knyttet til sentralnervesystem (CNS) APP (amyloid forløperprotein) produksjon; metabolismen av APP til Aβ42-protein med β- og γ-sekretase; og avsetningen av Aβ42-proteinet i amyloide plakk [14, 1]. Tau-aggregering, mikrotubul demontering og nevrofibrillær degenerering følger [, 16, 17], muligens som et resultat av interaksjon med Aβ42 [18-]. Sykdomsutviklingen er sterkt påvirket av genetisk disposisjon [21, 22], men trolig også av epigenetisk og ervervede risikofaktorer som cerebrovaskulær sykdom [23] og proteomikk [24] og immunologiske [2] mekanismer. Konsentrasjonen av Aβ42 i cerebrospinalvæske (CSF) reflekterer CNSparenkymale nivåer og øker fra 0-års alderen [26]. Konsentrasjonen av Aβ42 i cerebrospinalvæsken reduseres imidlertid hos pasienter som utvikler AD [27, 28], sannsynligvis på grunn av avsetningen i amyloide plakk [29]. [000] Lengden på tidsrommet fra AD-initiering for utvikling av demens hos den enkelte pasient er ukjent. Bevis fra obduksjoner utført på pasienter som har dødd av urelaterte årsaker tilsier at begrenset AD-lignende skade på tidlig stadium kan oppstå flere tiår tidligere [30], men den naturlige utviklingen av disse lesjonene er ukjent. En

4 forlenget preklinisk fase fra sykdomsstart til klinisk demens kan gi et stort terapeutisk tidsvindu. [0006] Demens innledes med mild kognitiv svikt (MCI) [11, 13, 31]. På dette stadiet har noen pasienter økt risiko for progresjon til demens (den årlige konverteringsraten = 6-2 %, [13]), selv om andre kan ha en tilstand begrenset til MCI i mange år. Bildebevis indikerer at en undergruppe av pasienter med MCI har amyloidavsetning i hjernen [32-34]. Dette beviset støtter resultatene fra studier med CFS-markører, der lave nivåer av amyloidforløperen CSF Aβ42 knyttet til cerebral amyloidavsetning [18, 29] har en tendens til å bli funnet i MCI-undergrupper som senere utvikler seg til Alzheimers demens. Mange av disse pasientene tilfredsstiller nye AD-forskningskriterier [12]. Som beskrevet ovenfor har nevropsykologi, CSF-proteomikk og nevroavbildning bidratt til økt forståelse av MCI. Induksjon av sykdommen forekommer tidligere, og en latensperiode kan overlappe MCI-stadiet etter hvert som sykdommen kan detekteres. [0007] Men det finnes fortsatt ingen pålitelig fremgangsmåte som kan detektere de tidlige stadiene av AD, selv om disse tidlige periodene kan vise seg å være klinisk verdifulle for å gjennomføre sykdomsmodifiserende behandlinger [3]. Dette er viktig ettersom den utstrakte skaden forårsaket av AD mest sannsynlig er irreversibel på senere trinn [16]. For å kunne utføre en effektiv behandling av AD er det derfor viktig å detektere AD tidlig. [0008] Fiala M. et al. [39] rapporterer om en studie der monocytter (CD68-positive celler) oppnådd fra blodprøver til AD-pasienter og kontrollindivider ble differensiert i makrofager og deretter utsatt for Aβ-protein in vitro. Aβ-proteinet ble konjugert med en synlig markør og cellene ble undersøkt ved fluorescens eller konfokal mikroskopi for å bestemme opptaket av Aβ-protein. Studien indikerer at makrofagene avledet fra AD-pasienter var ineffektive i Aβ-proteinfagocytose sammenlignet med kontrollgruppen. Men tilnærmingen i denne studien er ganske arbeidskrevende, og det er ikke klart på hvilket stadium i utviklingen av AD denne fremgangsmåten ville gi et positivt resultat. [0009] Andre patologiske tilstander i sentralnervesystemet karakterisert ved nærværet av fragmenter av et markørprotein i hjernen inkluderer Parkinsons sykdom, multippel sklerose, frontotemporal demens og amyotrofisk lateral sklerose. I hvert tilfelle er det ønskelig å stille diagnosen tidlig. [00] Derfor søker foreliggende oppfinnelse å lindre ett eller flere av de ovennevnte problemene og tilveiebringe en forbedret fremgangsmåte for å detektere nærvær eller overvåkning av alvorlighetsgraden til tilstanden, karakterisert ved nærværet av fragmenter av et markørprotein i hjernen til pasienten. [0011] Buddenhagen et al, (1987. J Neurol, 234, 27-28), rapporterer om fagocytose av latekspartikler av monocytter oppnådd fra pasienter med multippel sklerose. Kim et

5 3 1 al (06. Exp Mol Med, 38(4), ) gjennomgår rollen til mikroglia i nevrodegenerative forstyrrelser inkludert Alzheimers sykdom, Parkinsons sykdom og multippel sklerose. Det rapporterer at amyloid-betaprotein rekrutterer og induserer fagocyttisk aktivitet av mikroglia. Oe et al (06. Rapid Comm Mass Spectr,, ) rapporterer om fremgangsmåter for å kvantifisere nivåer av amyloidbetapeptider i cerebrospinalvæske. Testene gjennomført av forfatterne bestemte ikke nivået på Aβ-protein i makrofagene til pasientene. [0012] Liu et al (0. Brain 128, ) rapporterer om en studie der det ble observert at eksogent Aβ42 ble fagocytosert av mikrogliaceller på en CD14-avhengig måte. Studien ble utført ved å analysere mikrogliaceller dyrket in vitro, og deretter behandle cellene med biotinylert faβ42.. Denne studien inkluderte også immunhistokjemisk analyse av hjernevev fra pasienter som lider av Alzheimers sykdom og kontrollpersoner. Jung et al (1999. Neurobiol,, ) rapporterer celleoverflateimmunreaktiviteten for βapp på sirkulerende perifere eller blodmonocytter. OPPSUMMERING AV OPPFINNELSEN [0013] I henhold til ett aspekt av den foreliggende oppfinnelsen er det tilveiebrakt en fremgangsmåte for detektering av nærværet eller overvåkning av alvorlighetsgraden av en tilstand som karakteriseres ved nærværet av fragmenter av en markør i hjernen hos en pasient omfattende trinnene med å: (i) (ii) (iii) tilveiebringe en cerebrospinalvæske eller blodprøve oppnådd fra pasienten, der prøven innbefatter aktiverte makrofager: sortere flere celler i prøven og velge de aktiverte makrofagene for å tilveiebringe en anriket prøve omfattende aktiverte makrofager: og detektere nærværet av markørproteinet eller fragmenter derav som er i makrofagene i den anrikede prøven, og som var i makrofagene til pasienten, sammenligne nivåene av markørproteinet og/eller fragmenter derav med et standardnivå, standardnivået er et gjennomsnitt av nivåene til markørproteinet og/eller fragmenter derav i makrofager oppnådd fra cerebrospinalvæske eller blod fra flere individer uten tilstanden, og som var i makrofagene i individene, der nivåene av markørproteinet og/eller fragmenter derav er unormale dersom det er en statistisk signifikant forskjell fra standardnivået og der unormale nivåer av markørproteinet og/eller fragmenter derav i makrofagene er tegn på nærværet eller alvorlighetsgraden av tilstanden til pasienten, og der tilstanden er Alzheimers sykdom og markørproteinet er Aβ-peptidet; tilstanden er Parkinsons sykdom og markørproteinet er ubiquitin; tilstanden er multippel sklerose og markørproteinet er myelinbasisk protein; tilstanden er frontotemporal demens og markørproteinet er tau-proteinet; eller tilstanden er

6 4 amyotrofisk lateral sklerose og markørproteinet er tau-proteinet, eller tilstanden er Parkinsons sykdom, Lewy-legemedemens eller Alzheimers sykdom og markørproteinet er alfa-synuklein [0014] Fordelaktig er nærværet av unormale nivåer av markørproteinet og/eller fragmenter derav en reduksjon i nivåene i forhold til standardnivået, en økning i nivåene, sammenlignet med standardnivået eller fraværet av markørproteinet og/eller fragmenter derav. Nærmere bestemt, der tilstanden er Alzheimers sykdom, Parkinsons sykdom, frontotemporal demens, amyotrofisk lateral sklerose eller Lewy-legemedemens, er markørproteinnivåene redusert eller fraværende. Der tilstanden er multippel sklerose økes markørproteinnivåene. [001] Alternativt er nærværet av unormale nivåer av markørproteinet og/eller fragmenter derav nærværet av et unormalt mønster av markørproteinfragmenter. [0016] Fortrinnsvis viser makrofagene CD 14- og/eller CD 16-celleoverflatemarkører. [0017] Hensiktsmessig omfatter sorteringstrinnet anvendelse av fluorescensaktivert cellesortering eller magnetisk ekstraksjon. [0018] Fortrinnsvis omfatter trinn (iii) lysering av makrofagene og immunfelling av markørproteinet og/eller fragmenter derav. [0019] Fordelaktig omfatter trinn (iii) detektering av markørproteinet og/eller fragmenter derav ved hjelp av massespektrometri, fortrinnsvis matriks-assistert laserdesorpsjon-/ioniseringstid av lett massespektrometri. [00] Alternativt omfatter trinn (iii) detektering av markørproteinet og/eller fragmenter derav ved hjelp av HPLC-fluorescens, HPLC-UV, luminescens eller streptavidin-/biotinsystemer. [0021] Hensiktsmessig omfatter trinn (iii): å bringe markørproteinet i kontakt med et målantistoff i stand til å binde til markørproteinet; å bringe målantistoffet i kontakt med et sekundært antistoff i stand til å binde målantistoffet eller markørproteinet; og detektering av nærværet av det sekundære antistoffet. [0022] Fortrinnsvis omfatter det sekundære antistoffet en detekterbar merking og trinn iii) omfatter detektering av den detekterbare merkingen. [0023] Fordelaktig er den detekterbare merkingen en nukleinsyremarkør og trinn (iii) omfatter detektering av nukleinsyremarkøren ved hjelp av en nukleinsyreforsterkningsreaksjon. [0024] Hensiktsmessig omfatter fremgangsmåten videre trinnet med å detektere minst én ytterligere markør for tilstanden, der nærværet av den ytterligere markøren og nærværet av unormale nivåer av markørproteinet og/eller fragmenter derav i makrofagene eller mikroglia er indikative på nærværet av tilstanden i pasienten. [002] Fortrinnsvis er tilstanden Alzheimers sykdom, og den minst ene ytterligere markøren av Alzheimers sykdom er unormale nivåer av Aβ42, Tau, Fosfo-Tau,

7 Abeta42-/Abeta40-forhold, eller kombinasjoner derav, i en prøve av cerebrospinalvæske oppnådd fra pasienten, eller i en RNA-profil i blodet eller cerebrospinalvæske oppnådd fra pasienten. [0026] Fortrinnsvis er de unormale nivåene av den ytterligere markøren i en prøve av cerebrospinalvæske oppnådd fra pasienten: en Aβ2-proteinkonsentrasjon på mindre enn 0 µg/ml; en Fosfo-Tau-konsentrasjon som er større enn 8 pg/ml, eller ([Aβ42]/[Aβ40]) x er mindre enn 1. [0027] Hensiktsmessig er tilstanden Alzheimers sykdom og markørproteinet er Aβpeptidet og der Aβ-peptidet omfatter en sekvens som har en sekvenslikhet på minst 70 %, fortrinnsvis minst 80 %, mer foretrukket minst 90 %, mer foretrukket minst 9 %, mer foretrukket minst 99 %, mest foretrukket minst 0 % med SEQ. ID NO. 1. [0028] Alternativt er tilstanden Parkinsons sykdom og markørproteinet er ubiquitin og der ubiquitinproteinsekvensen omfatter en sekvens som har en sekvenslikhet på minst 70 %, fortrinnsvis minst 80 %, mer foretrukket minst 90 %, mer foretrukket minst 9 %, mer foretrukket minst 99 %, mest foretrukket minst 0 % med SEQ. ID NO. 2. [0029] Alternativt er tilstanden multippel sklerose og markørproteinet er myelinbasisk protein, og der den myelinbasiske proteinsekvensen omfatter en sekvens som har en sekvenslikhet på minst 70 %, fortrinnsvis minst 80 %, mer foretrukket minst 90 %, mer fortrinnsvis minst 9 %, mer foretrukket minst 99 %, mest foretrukket minst 0 % med SEQ. ID NO. 3. [0030] Alternativt er tilstanden frontotemporal demens eller amyotrofisk lateral sklerose, og markørproteinet er tau-protein, og der tauproteinsekvensen omfatter en sekvens som har en sekvenslikhet på minst 70 %, fortrinnsvis minst 80 %, mer foretrukket minst 90 %, mer foretrukket minst 9 %, mer foretrukket minst 99 %, mest foretrukket minst 0 % med SEQ. ID NO. 4. [0031] Alternativt er tilstanden Parkinsons sykdom, Lewy-legemedemens eller Alzheimers sykdom og markørproteinet er alfa-synukleinprotein og der alfasynukleinproteinsekvensen omfatter en sekvens som har en sekvenslikhet på minst 70 %, fortrinnsvis minst 80 %, mer foretrukket minst 90 %, mer foretrukket minst 9 %, mer foretrukket minst 99 %, mest foretrukket minst 0 % med SEQ. ID NO.. [0032] Ifølge et annet aspekt av den foreliggende oppfinnelsen anvender fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen et sett som omfatter: en mål-spesifikk bindingsreagens i stand til å binde markørproteinet; og en makrofag-spesifikk bindingsreagens i stand til spesifikt å binde en makrofag. [0033] Hensiktsmessig omfatter settet videre en sekundær bindingsreagens i stand til å binde den målspesifikke bindingsreagensen eller markørproteinet, der den sekundære bindingsreagensen kobles til en merking. [0034] Fortrinnsvis er merkingen et nukleinsyremarkørmolekyl.

8 [003] Fortrinnsvis er én av, begge eller alle av den målspesifikke bindingsreagensen, den makrofagspesifikke bindingsreagensen og eventuelt den sekundære bindingsreagensen antistoffer eller antigenbindingsfragmenter derav. [0036] Hensiktsmessig bindes den makrofagspesifikke bindingsreagensen til en magnetisk kule. [0037] Fortrinnsvis omfatter settet videre et cellelyserende middel. [0038] Fortrinnsvis er den makrofagspesifikke bindingsreagensen i stand til å binde CD-14- eller CD-16-cellemarkørene. [0039] Hensiktsmessig omfatter settet flere målspesifikke bindingsreagenser, hver i stand til å binde et forskjellig markørprotein. [0040] Fortrinnsvis velges det ene eller hvert markørprotein fra en gruppe bestående av α-betaproteinet, ubiquitin, myelinbasisk protein, tau-proteinet og α-synukleinproteinet. [0041] I henhold til et ytterligere aspekt av den foreliggende oppfinnelsen er det tilveiebrakt anvendelse av et sett for deteksjon av nærværet av, eller overvåkning av alvorlighetsgraden av en tilstand karakterisert ved nærværet av fragmenter av et markørprotein i hjernen til en pasient, fra en prøve oppnådd fra en pasient. [0042] Offentliggjøringen vedrører en strategi for diagnostisering og overvåkning av sykdommer i sentralnervesystemet (CNS). Tilnærmingen ifølge den foreliggende oppfinnelsen studerer immuncellene, slik som makrofager/mikroglia, i prøver av f.eks. cerebrospinalvæske (CSF) og blod, og måler unormale nivåer eller fraværet av intracellulære sykdomsspesifikke peptider eller proteiner. Aktivering av makrofag- /mikrogliasystemet og fagocytose av sykdomsspesifikke peptider/proteiner tilveiebringer et nytt diagnostisk verktøy og muliggjør fremdriften og effekt av terapeutiske intervensjoner som skal vurderes. [0043] Skjønt man ikke ønsker å være bundet av teori, er det antatt at oppfinnelsen opererer på grunn av de molekylære og fysiologiske mekanismene som nå vil bli beskrevet i relasjon til det spesifikke eksemplet på Alzheimers sykdom. Det antas at den naturlige utviklingen av Alzheimers patologi involverer en forlenget preklinisk periode. Rollen til immunsystemet er svært interessant i denne sammenheng. Det er kjent at immunisering av en person med Aβ-peptider utløser fagocytose [36], og at dette kan lindre amyloidavsetning i transgene AD-mus (muligens også menneskelig AD, men et klinisk forsøk ble avsluttet etter at pasienter utviklet encefalomyelitt [37]). Immun aktivitet kan også være involvert i den naturlige utviklingen av amyloid patologi, dvs. det kontinuerlige nivået av fagocytisk aktivitet kan bidra til plakkbelastning over tid. Som støtte til dette er det bevis for at makrofager sirkulerer fra benmargen til sentralnervesystemet i patologiske tilstander og bidrar til å fjerne plakk i AD-mus [38]. Det er også bevis for redusert fagocytose av Aβ av makrofager i ADpasienter in vitro[39]. Derfor er det antatt at den foreliggende oppfinnelsen virker ved å

9 måle den manglende fagocytiske aktiviteten av makrofager og/eller mikroglia in vivo, og anvender dette for diagnostiske formål. [0044] Utførelsesformer ifølge den foreliggende oppfinnelsen benytter IP-MS (immun-presipiteringsmassespektrometri) for å muliggjøre overvåking av makrofag- /monocyttfagocytisk aktivitet in vivo. Dette åpner nye områder for overvåking av Aβfagocytose hos pasienter predisponert for AD, enten genetisk eller med subjektiv hukommelsessvikt. [004] Det samme prinsippet kan også anvendes til å studere andre sykdomsgrupper. Detekteringen i makrofager av et spesifikt biomarkørprotein (andre enn Aβpeptider) som er involvert i mekanismen til en annen sykdom anvendes for tidlig diagnose og overvåking av den andre sykdommen. Noen spesifikke eksempler skal nå beskrives. 1. Utviklingen av multippel sklerose (MS) involverer tap av myelinlaget som isolerer aksonene. Immunaktivering og fagocytose involveres i demyelineringsprosessen. En viktig sykdomsspesifikk markør er derfor myelinbasisk protein (MBP). 2. I Parkinsons sykdom er ubiquitin funnet akkumulert i sykdomsspesifikke inklusjonslegemer, kalt Lewy-legemer. Ubiquitin er et meget konservert lite regulerende protein involvert i kontroll av stabilitet, funksjon og intracellulær lokalisering av mange forskjellige proteiner. Identifiseringen av unormale akkumuleringer av ubquitinproteinet inne i cellene som er markører for Parkinsons sykdom er derfor forutsatt i en utførelsesform av den foreliggende oppfinnelsen. 3. Alfa-synuklein er et protein funnet primært i nevrale vev, der det er sett hovedsakelig i presynaptiske terminaler. Proteinet kan aggregere for å danne uløselige fibriller i patologiske tilstander karakterisert ved Lewy-legemer, slik som Parkinsons- og Lewy-legemedemens. En fragmentert variant av alfasynuklein er også funnet i amyloide plakk i Alzheimers sykdom. 4. Tau-proteiner er mikrotubul-assosierte proteiner som er abundante i nerveceller der hovedfunksjonen er å modulere stabiliteten i aksonale mikrotubuli. Ulike tau-aggregater er også involvert i sykdommer, slik som amyotrofisk lateral sklerose (ALS), AD, Parkinson og frontotemporal demens. [0046] De ovennevnte eksemplene illustrerer viktige sykdomsspesifikke proteinmarkører (1-4) som er kjent for å akkumulere (2-4) i nevrodegenerative sykdommer. Derfor, for å bevirke tidlig diagnose og overvåkning av utviklingen av slike sykdommer, foretas den samme generelle tilnærmingen som beskrevet i dette dokumentet i forbindelse med Alzheimers sykdom, bortsett fra at et alternativt panel av antistoffer (som er spesifikke for proteinet som karakteriserer sykdommen, og

10 fragmenter av proteinet) anvendes til å trekke tilbake proteinet av interesse i immunutfellingstrinnet. [0047] Under tilstandene oppført i 2-4 ovenfor skal det forstås at et markørprotein fagocytoseres ved unormalt lave nivåer av makrofager, og således er unormalt lave nivåer av markørproteinet i makrofager fra et individ en indikasjon på tilstanden. Med hensyn til multippel sklerose antas MBP-markørproteinet å fagocytoseres av makrofager ved unormalt høye nivåer og således er detektering av unormalt høye nivåer av markørproteinet en indikasjon på multippel sklerose i pasienten. [0048] I denne beskrivelsen inkluderer begrepet "overvåkning av nærværet eller måling av alvorlighetsgraden" av en tilstand diagnostisering av tilstanden, men inkluderer også vurderingen av utviklingen av tilstanden etter initiell diagnose, overvåking av responsen på tilstanden til en behandling; og etablering av omfanget på pasientens tilstand (dvs. trinninndeling). [0049] I denne beskrivelsen inkluderer begrepet "makrofag" begrepet "mikroglia". Vanligvis anvendes begrepet "makrofag" når cellen er i cerebrospinalvæsken og begrepet "mikroglia" anvendes når cellen er i sentralnervesystemet. I denne beskrivelsen bestemmes den prosentvise "identiteten" mellom to sekvenser ved hjelp av BLASTP-algoritmeversjon (Altschul, Stephen F., Thomas L. Madden, Alejandro A. Schäffer, Jinghui Zhang, Zheng Zhang, Webb Miller og David J. Lipman (1997), "Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs", Nucleic Acids Res. 2: ) ved hjelp av standard parametere. Nærmere bestemt kan man få tilgang til BLAST-algoritmen på internettnettadressen: KORT BESKRIVELSE AV TEGNINGENE [001] Figur 1 er et strømningsplott av monocytter fra cerebrospinalvæsken til en pasient diagnostisert med ikke-ad/mci (øvre panel) og et tilsvarende strømningsplott fra en bloddonor (nedre panel). Den omkransede cellepopulasjon er aktiverte makrofager/mikroglia. Figur 2 er et diagram som viser den relative fordelingen av aktiverte og ikkeaktiverte makrofager fra pasienter med 1: Alzheimers sykdom (AD), 2: Multippel sklerose (MS), 3: Ingen CNS-sykdommer, 4: MCI/ikke-AD og : 7- dager etter slag. Figur 3 viser IP-MS-spektrene av Aβ-peptidfragmenter fra CSF-prøver fra pasienter. De to øverste spektrene er fra AD-pasienter, N = (F = 8), gjennomsnittsalder 68,9, # CD16+ ~ 1894 celler. De to nederste spektrene er fra MS-pasienter, N = 3 (F = 2), gjennomsnittsalder = 4, #CD 16+ ~ 773 celler.

11 Figur 4 viser IP-MS-spektrene av Aβ-peptidfragmenter fra CSF-prøver fra individer. Spektrene er fra individer uten CNS-sykdom, N = 13 (F = 8), gjennomsnittsalder = 36,1, # CD16+ ~ 4792 celler. Figur viser IP-MS-spektrene av Aβ-peptidfragmenter fra CSF-prøver fra pasienter. De to øverste spektrene er fra pasienter med MCI, men uten AD, N = (F = 3), gjennomsnittsalder = 71,4, # CD16+ ~ 82 celler. De to nederste spektrene er fra pasienter 7- dager etter slag, N = (F = 0), gjennomsnittsalder = 67, # CD16+ CSF ~ 2930, #CD16+ blod ~ 3748 celler. Figur 6 viser IP-MS-massespektrene av C- og N-terminalt avkortede Aβpeptider immunutfelt fra cerebrospinalvæsken. Figur 7 viser IP-MS-spektrene av Aβ-peptidfragmenter fra perifere blodprøver 7- dager etter slagpasient (CD16++ øvre spektrum og CD16- nedre spektrum). Figur 8 er et skjematisk diagram av et sett i henhold til en utførelsesform av den foreliggende offentliggjøringen i bruk. Figur 9 er et strømningsdiagram som viser trinnene i produksjonen av antistoffer for anvendelse i et sett i henhold til en utførelsesform av den foreliggende oppfinnelsen. Figur viser konfokale mikroskopibilder av en makrofag fra CSF farget for intracellulær MBP, der figur a er et fluorescerende bilde av cellen og figur b er et gjennomlyst bilde av den samme cellen. Figur 11 viser konfokale mikroskopibilder av en makrofag fra CSF farget med isotype-spesifikke antistoffer, der figur 11a er et fluorescerende bilde av cellen, og figur 11b er et gjennomlyst bilde av den samme cellen. Figur 12 viser konfokale mikroskopibilder av en makrofag fra blod farget med intracellulær MBP, der figur 12a er et fluorescerende bilde av cellen, og figur 12b er et gjennomlyst bilde av den samme cellen. Figur 13 viser konfokale mikroskopibilder av en makrofag fra blod farget med isotype-spesifikt antistoff, der figur 13a er et fluorescerende bilde av cellen, og figur 13b er det gjennomlyste bildet av den samme cellen. Figur 14 viser konfokale mikroskopibilder av en makrofag fra blod uten primært antistoff mot intracellulære antigener, der figur 14a er et fluorescerende bilde av cellen, og figur 14b er et fluorescerende bilde av den samme cellen. Figur 1 viser grafer av gjennomsnittlig fluorescerende intensitet i cerebrospinalvæsken (a) og blod (b) mot celletellingen. KORT BESKRIVELSE AV SEKVENSENE [002] SEQ. ID NO.: 1 er aminosyresekvensen til Aβ-proteinet.

12 SEQ. ID NO.: 2 er aminosyresekvensen til ubiquitinproteinet (RPS27A) SEQ. ID NO.: 3 er aminosyresekvensen til myelinbasisk protein (MBP). SEQ. ID NO.: 4 er aminosyresekvensen til Tau-proteinet (MAPT). SEQ. ID NO.: er aminosyresekvensen til alfa-synukleinproteinet (SNCA) DETALJERT BESKRIVELSE [003] I utførelsesformer ifølge den foreliggende oppfinnelsen anvendes peptid- /proteininnholdet i aktiverte makrofager for tidlig diagnose av AD som nå vil bli forklart. Data offentliggjort i dette dokumentet (se for eksempel figur 3 til ) indikerer at makrofager i AD har en redusert kapasitet for Aβ-fagocytose. De fleste pasientene studert som rapport i dette dokumentet er pasienter med AD ifølge Dubois et al.[12], med MCI, men ikke demens. Dette tyder på at redusert fagocytose kan være til stede tidlig i sykdomsutviklingen. [004] En utførelsesform ifølge den foreliggende oppfinnelsen vil nå bli beskrevet. En prøve av cerebrospinalvæske (CSF) ble oppnådd fra en pasient ved lumbalpunksjon. Makrofagene i prøven ble farget med fluorescent-merkede anti-cd14- og anti-cd16- antistoffer og makrofagene ble så trukket tilbake fra prøven ved fluorescensaktivert cellesortering. [00] Cellene ble valgt på grunnlag av CD-14- og CD 16-ekspresjon siden dette gjør det mulig for aktiverte makrofager å bli differensiert fra hvilende celler (økende CD16- ekspresjon betegner en aktivert status). Denne fremgangsmåten unngår også den utilsiktede prøvetakingen av andre celletyper, slik som CD68 positive-dendrittiske celler. Denne tilnærmingen står i kontrast med det som er rapportert av Fiala et al (39) der det ble valgt CD68-positive celler. [006] De resulterende makrofage cellene ble lysert og klargjort for proteinanalyse. Cellelysatet ble blandet med monoklonale antistoffer i stand til å binde fragmenter av Aβ-proteinet (SEQ ID NO.: 1). Eksempler på antistoffer er 6E, 4G8 og 11A0-B fra Signet Laboratories, Inc. 6E-antistoffet anvendes til å immunfelle Aβfragmentene 1-16, 4G8-antistoffimmunfeller Aβ-fragmentene og 11A0-B- antistoffimmunfeller Aβ fragmentene I alternative utførelsesformer kan det anvendes et annet panel av antistoffer som er spesifikke for andre fragmenter. De monoklonale antistoffene ble også koplet til magnetiske kuler, for eksempel med kuler bundet til anti-igg-antistoffer. De magnetiske kulene ble anvendt til å trekke ut fragmentene fra Aβ-proteinet. Antistoffene og kulene ble deretter fjernet fra peptidfragmentene. Peptidfragmentene ble deretter analysert ved MALDI-TOFmassespektrometri og sekvensen av fragmentene avledet fra den molekylære massen av hvert fragment. Resultatene vises kvantitativt for å indikere den relative mengden av hvert fragment. Når ingen Aβ-proteiner eller Aβ-proteinfragmenter Aβ detekteres i makrofagene er dette en indikasjon på at pasienten har AD.

13 [007] Aβ-fragmentene vist i IP-MS-spektrene er resultatet av intracellulær nedbrytning i henhold til karakteren av det katalytisk aktive området og betingelser for handling av intracellulære proteaser/peptidaser. Slike fragmenter tilsvarer ikke nødvendigvis sekvensene av Aβ-fragmentene funnet ekstracellulært i cerebrospinalvæsken. For å identifisere den eksakte lengden på hvert Aβ-fragment oppnådd i forsøket isoleres således peptidene i noen utførelsesformer for å bestemme deres respektive aminosyresekvenser. [008] Det skal forstås at den ovenfor beskrevne fremgangsmåten detekterer nærværet av Aβ-proteinfragmentene til stede in vivo i pasienten. Fremgangsmåten involverer ikke et separat trinn for å eksponere makrofagene overfor Aβ-proteinet, in vitro, etter ekstrahering fra pasienten. [009] I noen utførelsesformer sammenlignes nivået av de detekterte Aβ-proteinfragmentene med nivået i et kontrollindivid som ikke har AD. I slike utførelsesformer sammenlignes nivået og mønsteret av Aβ-proteinfragmenter fra pasienten med nivået og mønsteret til kontrollindividet. Når nivået av Aβ-proteinfragmenter er vesentlig lavere enn i kontrollindividet er dette en indikasjon på at pasienten har AD. Hvis tilsvarende type Aβ-proteinfragmenter til stede i individet er vesentlig forskjellig fra de til kontrollindividet er dette en indikasjon på at pasienten har AD. I alternative utførelsesformer genereres et standard nivå av Aβ-proteinfragmenter ved å detektere nærværet av slike fragmenter i makrofagene i CSF i flere kontrollindivider som ikke har AD. Nivået og mønsteret til Aβ-proteinfragmentene fra pasienten ble så sammenlignet med standardnivået og en statistisk signifikant reduksjon i nivået eller forskjell i mønsteret av nærværet av fragmenter er en indikasjon på AD. [0060] I andre utførelsesformer ble en enkelt pasient undersøkt årlig over en tidsperiode (for eksempel år). I hvert tilfelle studeres nivåene av Aβ-proteinfragmenter i makrofagene i en CSF-prøve fra pasienten som beskrevet ovenfor. En vesentlig endring i nivået eller mønsteret av Aβ-proteinfragmenter hvert år, særlig en reduksjon i nivået av Aβ-proteinfragmentene fra år til år, er en indikasjon på nærværet av AD. [0061] I visse utførelsesformer måles også ytterligere AD-markører i pasienten samtidig som den ovenfor beskrevne analysen utføres. Slike ytterligere AD-markører inkluderer unormale nivåer av Aβ42, Tau, Fosfo-Tau eller Aβ42/Aβ40-forholdet i en CSF-prøve oppnådd fra pasienten eller i RNA-profilen til en blod- eller CSF-prøve oppnådd fra pasienten. Et unormalt nivå av noen av eller alle disse ytterligere ADmarkørene, så vel som et unormalt nivå av Aβ-proteinfragmenter i makrofagene i CSF hos pasienten er en indikasjon på nærværet av AD. Et eksempel på et unormalt (dvs. patologisk) nivå av Aβ42 er en CSF-konsentrasjon på mindre enn 0 pg/ml. Konsentrasjonen av Tau er aldersavhengig, høye nivåer er patologiske. Et patologisk nivå av Fosfo-Tau er en CSF-konsentrasjon på mer enn 8 pg/ml. Et patologisk nivå på Aβ42/Aβ40-forholdet er der (Aβ42/Aβ40) x er mindre enn 1.

14 [0062] I de ovenfor beskrevne utførelsesformene oppnås en CSF-prøve fra pasienten. I alternative utførelsesformer studeres imidlertid en blodprøve. En slik alternativ prøve kan anvendes siden makrofager sirkulerer fra benmargen til sentralnervesystemet og derfor kan makrofager i blodet til en pasient ha blitt utsatt for proteiner i sentralnervesystemet. Det er selvsagt lettere å oppnå en blodprøve enn en CSF-prøve fra en pasient. [0063] En utførelsesform ifølge den foreliggende oppfinnelsen legger følgende kriterier til grunn for en diagnostisk test for å vurdere Alzheimers sykdom i en pasients aktiverte makrofager/mikroglia: 1) Oppfyllelse av sykdomskriteriene, 2) Nærvær og sortering av CD16+ populasjon av celler i CSF og blod med strømningscytometri, 3) Nærvær/fravær av Aß-peptidfragmenter i MS-spektrene etter immunfelling med antistoffer, 4). FREMGANGSMÅTER FOR EVALUERING AV OPPFYLLELSE AV SYKDOMSKRITERIENE [0064] Pasienten gjennomgår en grundig klinisk undersøkelse, inkludert en studie av medisinsk historie, fysisk, nevrologisk og psykiatrisk undersøkelse, screeningslaboratorietester og MRI- og PET-billeddiagnostikk av hjernen. AD-diagnosen utføres i henhold til nylig publiserte kriterier [12]. Pasienten gjennomgår en grundig fysisk og psykologisk undersøkelse når den innrulleres i diagnoseprogrammet på et sykehus. Undersøkelsen inkluderer nevropsykologiske spørreskjemaer for identifisering av kognitiv svikt, nevrologisk undersøkelse, genetisk analyse, CSF-biomarkører, bildebehandling og metabolsk profil. FREMGANGSMÅTER FOR EVALUERING OG SORTERING AV CD 16+- POPULASJON AV CELLER I CSF OG BLOD MED STRØMNINGSCYTOMETRI [006] Cellene erverves på et FACSAria-cellesorteringssystem og analyseres ved hjelp av FACSDiva-programmet (begge fra Becton Dickinson). CSF-cellepopulasjonene sorteres basert på deres uttrykk av relevante overflatemarkører (CDer). Cellene fordeles etter lysspredningsegenskaper forover og til siden og utvelges positivt for nærvær av CD4 + CD3 + CD4 + CD8 (karakterisering av T-cellepopulasjon) og CD4 + CD14 + CD16 + CD19 (karakterisering av aktiverte makrofager og B-celle-populasjon). For å bevare immuncellene intakte utføres cellesorteringen maksimum fire timer etter punksjonen. CD14+/CD16+-sorterte celler lyseres og holdes frosne ved -80 C for videre analyse (proteinanalyse). I tillegg til å samle celler for proteinanalyser indikerer strømningscytometriresultatene den CSF- og perifere (blod) immuncellefordelingen til pasienten.

15 FREMGANGSMÅTE FOR FREMSTILLING AV CELLER FOR IMMUNFELLING [0066] CSF-cellepopulasjoner ble sortert basert på deres uttrykk for relevante overflatemarkører (CD-er). Cellene ble fordelt etter lysspredningsegenskapene forover og til siden og utvelges positivt for nærvær av CD4 + CD3 + CD4 + CD8 (karakterisering av T-cellepopulasjon) og CD4 + CD14 + CD 16 + CD19 (karakterisering av aktiverte makrofager og B-cellepopulasjon). Cellepopulasjon og celleantall i hver populasjon ble oppnådd og registrert (se figur 2). Antallet aktiverte celler hos slagpasienter etter 7- dager er høyt, noe som tyder på sirkulasjon av rekrutterte celler også til CSF-rommet av et stort antall immunceller. Antallet aktiverte makrofager i AD er i stor grad lik det i MCI/ikke-AD-gruppen. Summen %-aktiverte celler i MS er lavere enn AD; som kan være fordi immunprosessen i MS i hovedsak involverer T-celler. [0067] De CD14+/CD16+- og CD14+/CD16-sorterte prøvecellene ble vasket med 400 µl PBS og sentrifugert (4 C, 70 x g, min). Supernatanten ble fjernet og klargjort for IP-MS-analyse ved tilsetning av µl RIPA-buffer for cellelysering og holdt frosset ved -80 C før proteinanalyse. FREMGANGSMÅTE FOR IMMUNFELLING [0068] En alikvot (4 µg) av de monoklonale antistoffene 6E (1 mg/ml, epitop 4-9), 4G8 (1 mg/ml, epitop 18-22) eller 11A0-B (0, mg/ml, reaktive på C-terminalen) (Signet Laboratories, Inc.) ble separat tilsatt til 0 µl magnetiske Dynabeads (sauantimus-igg) og inkubert over natten på en gyngende plattform ved + 4 C. Det resterende ubundne antistoffet ble fjernet ved vasking to ganger med fosfatbufret saltløsning (PBS, ph 7,4). Etter tilsetning av 1 ml CSF til de antistoffbelagte kulene ble inkubasjonen fortsatt i ytterligere 1 time ved + 4 C. Kulene ble pelletert i min ved bruk av en magnetisk partikkelkonsentrator (Dynal MPC) og vasket to ganger med PBS (ph 7,4) og to ganger med 0 mm ammoniumbikarbonat (ph 7,3). Etter den siste vaskingen ble de ekstraherte Aβ-peptidene eluert ved tilsetning av µl 0, % maursyre (FA) i vann. Etter hvirvelbehandling i 2 min i romtemperatur ble kulene pelletert ved hjelp av den magnetiske partikkelkonsentratoren og supernatanten ble oppsamlet. Den oppsamlede supernatanten ble tørket ned i en vakuumsentrifuge og oppløst på nytt i µl 0,1 % FA i % acetonitril (ACN). Alle anvendte løsningsmidler var av HPLC-kvalitet og alle vandige oppløsninger ble laget ved bruk av 18,2 M deionisert vann oppnådd fra et Millipore-rensesystem. FREMGANGSMÅTER FOR Å EVALUERE NÆRVÆR/FRAVÆR AV Aß I MS-SPEKTRENE ETTER IMMUNFELLING

16 [0069] IP-MS ble anvendt til å isolere og bestemme Aβ-peptidinnholdet (Aβ-signatur) på CD14+/CD16+-makrofagene sortert ved strømningscytometri. Proteolytisk bearbeidede Aβ-peptider er vanskelige å detektere ved hjelp av standard proteomikkfremgangsmåter muligens fordi de omfatter et heterogent sett av både N- og C- terminalt trunkerte peptider, noen i lav mengde. IP-MS-analyse har blitt anvendt tidligere for å oppnå en Aβ-peptidsignatur på vellykket måte [43] [44] (se figur 6). Kort fortalt ble Aβ-peptidene isolert fra lyserte makrofager ved hjelp av anti-aβmonoklonale antistoffer og magnetiske Dynabeads. Så ble en matriks-assistert laserdesorpsjons-/ioniseringstid av lett massespektrometri (MALDI-TOF MS)-analyse utført på de immunutfelte peptidene og makrofag-aβ-signaturen ble beregnet. Fraværet av Aβ-signalet i prøven ble tolket som en positiv AD-diagnose. ALTERNATIVE METODOLOGIER [0070] I varianter av den ovennevnte beskrevne metodologien ble de følgende fremgangsmåtene anvendt. 1. I stedet for å anvende strømningscytometri for å sortere celler ble aktiverte makrofager/mikrogliaceller trukket tilbake ved hjelp av magnetisk ekstraksjon, flotasjonsfremgansmåter eller andre antistoff- eller affinitets-baserte ekstraksjonsfremgangsmåter, f.eks. kromatografi, gradientsentrifugering. Alternativt ble cellene studert ved hjelp av immunhistokjemi. 2. Immunfelling ved hjelp av andre antistoffer spesifikke for peptidet/proteinet av interesse. 3. I stedet for å anvende massespektrometri ble det benyttet en annen fremgangsmåte for kvantitativ eller semikvantitativ peptid-/proteinanalyse, slik som: HPLCfluorescens eller -UV, luminescens, streptavidin-/biotinsystemer, immunhistokjemi m.m. ALTERNATIVE BETINGELSER [0071] I alternative utførelsesformer karakteriseres en annen patologisk tilstand ved nærværet av fragmenter av et markørprotein i hjernene til studerte pasienter. I hvert tilfelle er det nødvendig å identifisere tilstanden som skal studeres, og de tilsvarende proteinene som karakteriserer tilstanden. Eksempler på tilstander inkluderer: Parkinsons sykdom, der ubiquitin (SEQ ID NO: 2) er det karakteriserende proteinet; multippel sklerose, der myelinbasisk protein (SEQ ID NO: 3) karakteriserer tilstanden; frontotemporal demens og amyotrofisk lateral sklerose, som karakteriseres ved tauproteinet (SEQ ID NO: 4); og Parkinsons sykdom (SEQ ID NO: ), Lewylegemedemens og AD som karakteriseres av alfa-synukleinproteinet. I hvert enkelt tilfelle utføres fremgangsmåten for detektering eller overvåkning som beskrevet ovenfor i forbindelse med AD, bortsett fra at antistoffer som anvendes til å

17 immunutfelle peptidene fra makrofagene substitueres med antistoffer i stand til å binde fragmenter av det karakteriserende proteinet til tilstanden. I tilfellet med multippel sklerose er videre unormalt høye nivåer av ubiquitinmarkørproteinet en indikasjon på nærværet av sykdommen. [0072] I noen utførelsesformer testes flere slike betingelser simultant ved å immunutfelle cellelysater med flere sett av antistoffer, der hvert sett av antistoffer er spesifikke for fragmenter av forskjellige karakteriseringsproteiner. [0073] I noen utførelsesformer ifølge oppfinnelsen anvender fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen et diagnostisk sett tilveiebrakt for å muliggjøre detektering av en patologisk tilstand ifølge oppfinnelsen (det vil si en tilstand som karakteriseres ved nærværet av fragmenter av et markørprotein i hjernen til en pasient som lider av tilstanden). Settet er egnet for bruk i vanlige kliniske laboratorier siden det er basert på en ELISA/immun-PCR-metode, og dermed ikke krever bruk av MALDI-TOF- eller IP- MS-metoder, som beskrevet i noen foregående utførelsesformer. Settet omfatter et panel av målspesifikke antistoffer spesifikke for en første epitop av markørproteinet. Således, f.eks. der den patologiske tilstanden som skal detekteres er Alzheimers sykdom, er markørproteinet Abeta 42-proteinet. Settet omfatter også en tilførsel av magnetiske kuler som viser makrofage spesifikke antistoffer (f.eks. antistoffer spesifikke for CD14- og CD16-cellemarkørene); et cellelyseringsmiddel, slik som radioimmunfellingsanalyse (RIPA)-buffer inneholdende 2 mm Tris-HCl ph 7,6, mm NaCl, 1 % NP-40, 1 % natriumdeoksykolat og 0,1 % SDS (Pierce Biotechnology); og et sekundært antistoff for markørproteinet. Det sekundære antistoffet er konjugert til et dobbelt-trådet DNA-markørmolekyl. [0074] Med henvisning til figur 8 vil settet nå beskrives i anvendelse. En prøve, slik som en perifer blod- eller CSF-prøve, ble oppnådd fra en pasient og makrofagceller ble isolert fra prøven ved å blande den med de magnetiske kulene tilveiebrakt i settet. De makrofagspesifikke antistoffene vist av de magnetiske kulene bandt makrofagene i pasientprøven og makrofagene og de magnetiske kulene ble deretter fjernet fra prøven på magnetisk vis. Makrofagcellene ble deretter frigjort fra de makrofagspesifikke antistoffene ved å justere ph-en i løsningen, og makrofagcellene ble lysert med lyseringsmidlet for å frigjøre celleinnholdet 2 som inkluderer markørproteinet 3 som vist i figur 8A. [007] I det diagnostiske settet er det også tilveiebrakt et fast underlag 4 som det immobiliseres flere målantistoffer, 6 på som er spesifikke for markørproteinet 3. [0076] Som vist i figur 8b bringes så innholdet 2, 3 i den lyserte makrofagcellen 1 deretter i kontakt med det faste underlaget 4 slik at den første epitopen til markørproteinet 3 binder til det primære antistoffet. [0077] Med henvisning til figur 8c bringes det faste underlaget 4 i kontakt med et sekundært antistoff 7 som er konjugert til et dobbelttrådet DNA-molekyl 8. Det

18 sekundære antistoffet 7 er spesifikt for den andre epitopen til markørproteinet 3 slik at det sekundære antistoffet 2 immobiliseres på det faste underlaget 4, der markørproteinet 3 er til stede. [0078] Ubundne proteiner og ubundet sekundært antistoff vaskes deretter ut og fjernes (se figur 8d). [0079] Med henvisning til figur 8e utsettes det vaskede faste underlaget 4 deretter for sanntids-pcr, som smelter det dobbelt-trådede DNA-molekylet 8 og forsterker kopiantallet (se figur 8f) for å identifisere kopiantallet av DNA-markørmolekylet. Antallet kopier av DNA-markørmolekylet 8 etter et forutbestemt antall sykluser av PCR-forsterkning indikerer startantallet DNA-molekyler. Videre er det et én-til-énforhold mellom startantallet DNA-molekyler og antallet bundne markørproteiner. Derfor gir denne immun-pcr-metoden en nøyaktig indikasjon på antallet markørproteinmolekyler i pasientprøven. [0080] Følgelig tillater slike diagnostiske sett en enkel immunologisk fremgangsmåte som skal anvendes i standard kliniske laboratorier som er tilgjengelig på alle sykehus, private klinikker og kommersielle laboratorier for å analysere pasientprøver i samsvar med den foreliggende oppfinnelsen. Anvendelsen av settet ifølge offentliggjøringen krever ikke anvendelse av dyre eller avanserte laboratorieinstrumenter og deteksjon ved hjelp av en immun-pcr-metode sikrer høy følsomhet. [0081] Målantistoffene i det diagnostiske settet kan være antistoffer allerede kjent innen teknikken i stand til å binde markørproteinet, slik som antistoffene 6E, 4G8 og 11A0-B beskrevet ovenfor. Imidlertid kan ytterligere antistoffer identifiseres som forklart i strømningsskjemaet i figur 9 i forhold til antistoffer mot Abeta-proteinet. Prosessen starter med oppnåelse av en egnet pasientprøve ved ekstrahering av en cerebrospinalvæskeprøve ved en lumbalpunksjon (boks 9). Deretter ekstraheres de aktiverte makrofagene fra prøven ved binding av merkede antistoff til egnede cellemarkører (f.eks. CD14 og CD16) i pasientprøven og sortering av cellene med FACS (se boks ). De isolerte makrofagene dyrkes deretter (boks 11) og oppfordres til fagocytose ved utfordring med Abeta-proteinet in vitro (boks 12). Mer informasjon om dette trinnet er gitt i "amyloid-beta-belastningstesten" av Fiala et al (39). De dyrkede makrofagene lyseres deretter og fordøyde fragmenter av Abeta-proteinet trekkes ut og immunutfelles (boks 13). [0082] På dette trinnet i prosedyren kan Abeta-fragmentene i seg selv anvendes til å immunisere vertsdyr (slik som kaniner) for å produsere antistoffer spesifikke for Abeta-proteinfragmentene på en liten skala (boks 14). For større skala-produksjon av antistoffer, fortsetter imidlertid prosedyren med å identifisere de fordøyde Abetaproteinfragmentene ved hjelp av tandemmassespektrometri (f.eks. elektrospray-q-tof eller MALDI-TOF (boks 1)). Når sekvensene til Abeta-proteinfragmentene er blitt identifisert syntetiseres fragmentene f.eks. ved hjelp av rekombinant ekspresjon i en

19 vertscelle, slik som E. coli (boks 16). De syntetiserte Abeta-proteinfragmentene anvendes så til å immunisere vertsdyr (vanligvis kaniner) (boks 17) som i sin tur produserer antistoffer (boks 18). Antistoffer kan oppnås fra vertsdyrene og inkluderes i de diagnostiske settene, men fortrinnsvis produseres monoklonale antistoffproduserende celler som er kjent innen teknikken (f.eks. ved produksjon av hybridomceller). Alternativt sekvenseres antistoffene, eller minst deres komplementaritetsbestemmende områder, og uttrykkes rekombinant. Uansett hvilken fremgangsmåte for antistoffproduksjon man velger, renses antistoffene og inkluderes i det diagnostiske settet (boks 19). [0083] I enkelte varianter av de ovenfor beskrevne diagnostiske settene, tilveiebringes flere paneler av antistoffene i settet. I en variant omfatter settet f.eks. først målantistoffer spesifikke for en første epitop av Abeta-proteinet og andre målantistoffer spesifikke for en tredje epitop av Abeta-proteinet. I enda ytterligere utførelsesformer tilveiebringes flere paneler av antistoffer i settet, og antistoffene er spesifikke for markørproteiner som tilsvarer mer enn én patologisk tilstand. I en bestemt variant tilveiebringes f.eks. et panel av antistoffer spesifikke for Abeta-proteinet (markørproteinet for Alzheimers sykdom), og et panel av antistoffer tilveiebringes spesifikt for multippel sklerose (der myelinbasisk protein er markørproteinet). I disse variantene er det foretrukket at forskjellige paneler av sekundære antistoffer, som hver er spesifikke for et respektivt markørprotein, og hver er konjugert til et annet DNA-molekyl, tilveiebringes slik at signalene for detektering av hvert markørprotein kan skilles fra hverandre. [0084] I de ovenfor beskrevne utførelsesformene av det diagnostiske settet er den detekterbare merkingen et DNA-markørmolekyl. I andre utførelsesformer anvendes imidlertid en annen detekterbar merking. Den detekterbare merkingen kan f.eks. være en fluorfor-, en lateksmikrokule- eller gullpartikkel. Slike alternative detekterbare merkinger er nyttige når settet kun er tilveiebrakt for å tilveiebringe et kvalitativt resultat heller enn et kvantitativt resultat. [008] I enkelte alternative utførelsesformer av settet tilveiebringes ikke et lyseringsmiddel som sådan. I stedet lyseres cellene mekanisk, f.eks. ved sentrifugering, før isolering av makrofagene. [0086] Det skal også forstås at de diagnostiske settene ifølge den foreliggende offentliggjøringen ikke begrenses til sett omfattende antistoffer. I alternative utførelsesformer erstattes antistoffene i settet med andre bindingsreagenser, slik som antigenbindingsfragmenter (f.eks. F(ab')2-fragmenter eller Fab-fragmenter) eller en polynukleotidsekvens. Vanligvis har slike andre bindingsreagenser bindingsaffiniteter for deres mål sammenlignbare med de til antistoffer som har en bindingsaffinitet på mindre enn 0 nm i en vandig bufret oppløsning ved ph mellom 4 og 8.

20 18 EKSEMPLER EKSEMPEL 1: PASIENTUTVALG [0087] Pasientene var polikliniske eller innlagt og ble rekruttert fra Nevroklinikken på Akershus Universitetssykehus. Lumbalpunksjon ble utført som en planlagt prosedyre. Pasientgruppene ble delt inn i følgende diagnoser: 1) sannsynlig Alzheimers sykdom (AD) diagnostisert i henhold til NINCS-ADRA-kriteriene [12]; 2) sannsynlig multippel sklerose (MS) diagnostisert i henhold til McDonald-kriteriene; 3) ingen sykdom i nervesystemet (f.eks. ME, og andre pasienter med en full negativ etterforskning for "organisk" sykdom); 4) mild kognitiv svikt (MCI)/ikke-AD; og ) 7- dager etterslag-pasienter. EKSEMPEL 2: LUMBALPUNKSJON/BLODPRØVETAKING [0088] Lumbalpunksjonen ble rutinemessig utført i forbindelse med diagnosen mellom kl og CSF ble oppnådd fra pasientene gjennom lumbalpunksjon mellom L4- og L-virvlene med pasientene i vannrett stilling. Huden i lumbalregionen ble grundig vasket med sterile Q-tips og % klorheksidin. Nevrologen på vakt utførte lumbalpunksjonen. Det ble anvendt fine engangsnåler (Becton Dickinson GA 3. IN 0,9 x 90 mm). Prøven for strømningscytometrianalyse ble samlet inn som den siste prøven, til sammen 2 ml (~ 40 dråper) CSF. Blodprøven (EDTA eller heparin) ble tatt umiddelbart før eller etter lumbalpunksjonen. [0089] Cellene ble ervervet på et FACSAria-cellesorteringssystem og analysert ved hjelp av FACSDiva-programmet (begge fra Becton Dickinson) innen maksimalt fire timer etter punksjonen/blodprøvetakingen. EKSEMPEL 3: FREMSTILLING OG ANALYSE AV CSF/BLODPRØVER VED STRØMNINGSCYTOMETRI [0090] 2 ml CSF og/eller 4 ml blod ble pelletert (4 C, 400 xg, min). Supernatanten ble fjernet, og de gjenværende cellepelletene ble vasket én gang med fargebuffer (Becton Dickinson, San Jose, CA). Cellepelletene ble fortynnet i 1-2 ml fargebuffer og sentrifugert ved 4 C, 400 xg, min. Supernatanten ble fjernet, og prøven ble overført til et strømningsrør. Prøven ble farget med et panel av fluorescensmerkede antistoffer (2, µl CD4-FITC og CD19-FITC, 2,0 µl CD8-PE, CD16-PE og CD4-PerCP, 1, µl CD3-APC og CD14-APC, alle fra Becton Dickinson). Prøvene ble inkubert i et kjøleskap i 1- minutter før tilsetning av 3-4 dråper FACSFlow-løsning, blandet og klargjort for strømningscytometrianalyse. EKSEMPEL 4: STRØMNINGSCYTOMETRIANALYSE OG CELLESORTERING