KJ2053 Kromatografi Oppgave 7: Kapillærelektroforese: Separasjon av tre aromatiske aminosyrer ved kapillærelektroforese (CZE) Rapport Pia Haarseth piakrih@stud.ntnu.no Audun Formo Buene audunfor@stud.ntnu.no Utført: 19. april 2013
Innhold 1 Resymé 2 2 Teori [1] 3 3 Eksperimentelt 6 4 Resultater 7 4.1 Optimalisering.............................. 7 4.2 Platetall................................. 7 4.3 Elektroosmotisk mobilitet, µ EOF.................... 7 4.4 Elektroforetisk mobilitet av aminosyrer, µ e.............. 8 4.5 Elueringsrekkefølge........................... 8 4.6 Teoretisk hydrodynamisk injisert volum................ 8 5 Diskusjon 9 6 Konklusjon 10 A Elektroferogrammer 12 1
1 Resymé Det skulle utføres en enkel undersøkelse av muligheten for en kapillærsoneelektroforetisk separasjon av tre essensielle aromatiske aminosyrer med deteksjon ved hjelp av UV/Diode array-detektor. Aminosyrene som ble separert var fenylalanin, tryptofan og tyrasin. Effekten av ph og spenning på separasjonen ble også undersøkt i forsøket. For å bestemme den elektroosmotiske kraften i separasjonen ble et nøytralt molekyl, acetofenon, analysert med de samme betingelser som aminosyrene. 2
2 Teori [1] Kapillærelektroforese er en viktig separasjonsmetode for hovedsakelig ladede polare forbindelser, ionsike eller ioniserbare forbindelser, men nøytrale forbindelser kan også analyseres. Eksempler på forbindelser der det blir anvendt kapillærelektroforese er legemidler, kirale forbindelser, peptider, proteiner, oligonukleotider, vitaminer, organiske syrer, aminosyrer, uorganiske ioner og polymere. Kapillærelektroforese har fordeler som rask analysetid, høy effektivitet og lavt forbruk av prøvemateriale og kjemikalier. I kapillærelektroforese foregår separasjonen i et væskefylt kapillærrør og drivkraften vandringen av molekylene er spenningspotensialet som settes over kapillæret. Kapillæret er vanligvis 20-100 cm langt og har en indre diameter på 50 µm. Svært effektive separasjoner kan oppnås ved bruk av høye spenninger og en tynn kapillær som har god varmeavledning. For å sikre konstant temperatur i systemet, er et kjølesystem nødvendig på grunn av varmeutviklingen som oppstår når det går strøm gjennom kapillæren. Både væske- og luftkjøling er brukt for temperaturkontroll av kapillæren. Separasjoner kan utføres ved konstant strøm eller konstant spenning, men konstant spenning er som regel foretrukket. Både lav- og høymolekylære forbindelser kan separeres effektivt i fri løsning. Injeksjon av prøve kan utføres hydrodynamisk, elektrokinetisk, isotachoforetisk eller ved å bruke loop-injetor eller splittsystemer. Hydrodynamisk injeksjon kan utføres ved å enten legge trykk på prøveglasset med en inert gass, legge undertrykk på utgangen av kapillæret eller forandre relativ høyde mellom inngang og utgang av kapillæret. Teoretisk hydodynamisk injisert mengde prøveløsning kan beregnes fra formelen: vol inj = π P d4 col t inj 128 η L col (1) hvor P er overtrykket i systemet under separasjonen, d col er kolonnediameteren, t inj er injeksjonstiden, L col er kolonnelengden og η er viskositeten i systemet. 3
Kolonnene i kapillærelektroforese er normalt kvarts kapillærrør som er belagt med polyimid utvendig for beskyttelse. Effektiv kapillærlengde defineres som avstanden mellom kapillærinngangen og detektorcellen. Båndbredden øker proporsjonalt med økende diameter, mens deteksjonsgrensen for analytter er omvendt proposjonal med indre diameter. Valg av indre diameter er et kompromiss mellom oppløsning og deteksjonsgrense. Større kapillær gjør også at varmeavledningen blir dårligere. Varmegradienter vil føre til båndsprening på grunn av forskjell i elektroforetisk mobilitet, som kommer av endringer i viskositeten som følge av temperaturendringen. Den ytre diameteren kan også justeres. Benyttes luftkjøling er tynn vegg ønskelig, mens tykkere vegg ofte brukes med væskeavkjøing. Forbindelsene kan detekteres ved å plassere en detektor nær den ene elektroden forbindelsene vandrer mot. UV/VIS- og fluorescensdetektor er vanlig i kommersielle instrumenter. Signalet fra detektoren kan plottes som funksjon av tid og kalles elektroferogram. Optimalisering av separasjonen i kapillærelektroforese kan gjøres blant annet ved å justere ph til bufferløsningen og spenningen mellom elektrodene. Kolonnens effektivitet kan uttrykkes ved et platetall, som kan tolkes som antall teoretiske separasjonstrinn eller likevekter som er innstilt langs kolonnens totale lengde. Platetallet N kan bestemmes for en komponent fra følgende formel ( ) 2 tr N = 5.54 (2) w 0.5 hvor t R er retensjonstid, og w 0.5 er båndbredde ved halv topphøyde. Den elektroosmotiske mobiliteten kan beregnes med utgangspunkt i migrasjonstiden for det nøytrale stoffet acetofenon, ved de samme betingelser som separasjonen av aminosyrene. Den elektroosmotiske mobiliteten, µ EOF, kan bestemmes fra formelen µ EOF = l L V t (3) 4
der l er migrasjonslengden, L er kapillærens totallengde, V er potensialet mellom elektrodene og t er migrasjonstiden. Den elektroforetiske mobiliteten for de tre aromatiske aminosyrene ved optimerte betingelser, den effektive mobiliteten, µ e, kan bestemmes fra formelen µ e = µ a µ EOF (4) der µ a er tilsynelatende mobilitet. µ a beregnes på samme måte som µ EOF, men med migrasjonstiden til kationene, altså aminosyrene. 5
3 Eksperimentelt Hver bufferløsning ble overført til to prøveglass og korket. Prøveglass med destillert vann, prøveløsning og et tomt glass ble også forberedt. Optimaliseringen ble startet med bufferløsningen med ph 2.5, og da ble hele rense/kondisjoneringsprogrammet fulgt. Deretter ble bufferløsningene med ph 6.79, 8.37 og 10.01 brukt til separasjonen, men med kortere vaskesekvens i starten av programmet, og separasjonen ble avbrutt da aminosyrene var ute av kolonnen. Etter optimalisering med forskjellige buffere ble den bufferen som gav best separasjon, ph 10, valgt. Deretter ble ble spenningen variert for å ha separasjonsresultater fra 10, 20 og 30 kv. På grunnlag av både buffer-ph og elektrisk potensiale ble det valgt et optimalt sett med separasjonsbetingelser for analysen av aminosyreløsningene. De tre aminosyrene ble identifisert ved å analysere standarder som inneholdt kun én av aminosyrene. Til slutt ble et nøytralt molekyl analysert. Dette var acetofenon, og dette ble gjort for å kunne bestemme den elektroosmotiske kraften i systemet. Resultatene ble hentet fra analyser ved bølgelengdene 210 nm og 260 nm. 6
4 Resultater 4.1 Optimalisering De optimaliserte betingelsene for separasjon av aminosyreblandingen ved kapillærelektroforese ble funnet til å være med en spenning på 10 kv og med bufferløsning med ph 10. 4.2 Platetall Platetallene og platehøydene for den første og siste toppen i elektroferogrammet for aminosyreblandingen vedlagt i Vedlegg A, er utregnet med Formel (2), og er rapportert i Tabell 1. Tabell 1: Platetallene og platehøydene for aminosyrene tryptofan og tyrasin. Aminosyre Platetall N Platehøyde H [m/plate] Tryptofan 34288 8.84 10 6 Tyrasin 23754 6.12 10 6 4.3 Elektroosmotisk mobilitet, µ EOF Den elektroosmotiske mobiliteten i systemet ble bestemt ved å analysere det nøytrale stoffet acetofenon. Retensjonstiden for acetofenon ble funnet fra elektroferogrammet vedlagt i Vedlegg A til å være 2.029 minutter. Den elektroosmotiske mobiliteten ble funnet til å være: µ EOF = l L V t = 0.21 [m] 0.31 [m] 10 10 3 V 121.74[ s] = 5.35 10 8 [m 2 /V s] (5) 7
4.4 Elektroforetisk mobilitet av aminosyrer, µ e Den effektive elektroforetiske mobiliteten av aminosyrene tryptofan, tyrasin og fenylalanin er vist i Tabell 2. Tabell 2: Effektiv elektroforetisk mobilitet for aminosyrene tryptofan, tyrasin og fenylalanin. Aminosyre µ a [m 2 /V s] µ e [m 2 /V s] Tryptofan 3.39 10 8-1.95 10 8 Fenylalanin 3.67 10 8-1.67 10 8 Tyrasin 3.96 10 8-1.35 10 8 4.5 Elueringsrekkefølge Elueringsrekkefølgen ble funnet ved å analysere de tre forskjellige aminosyrene hver for seg. Utleverte ferdiglagede standarder ble analysert. Tabell 3: Elueringsrekkefølge for aminosyrestandardene for tryptofan, tyrasin og fenylalanin. Aminosyre t R [min] Rekkefølge Tryptofan 2.78 1 Fenylalanin 3.01 2 Tyrasin 3.25 3 4.6 Teoretisk hydrodynamisk injisert volum Teoretisk hydrodynamisk injisert volum beregnes fra Formel (1) vist i Teori. vol inj = π 34.3 103 [g cm 1 s 2 ] (5 10 3 [cm]) 4 4 [s] 128 0.00955 [g cm 1 s 1 ] 31 [cm] = 7.11 10 6 [cm 3 ] 8
5 Diskusjon Bufferen med ph 10 ble valgt, da denne gav separasjon av komponentene i motsetning til bufferene med lavere ph. Separasjon med spenning på 10 kv ble valgt da dette var det potensialet som gav best grunnlinjeseparasjon. Høyt platetall indikerer separasjon med høy effektivitet, noe som igjen gir lave platehøyder. Platetallet var noe lavere i kapillærelektroforese enn ved gasskromatografi utført i oppgave 3 (Reaksjonsforløp fulgt ved reduksjon av keton til alkohol). Platetallet for både CZE og GC er mye større enn platetallet fra LSC i oppgave 2 (Preparativ kolonnekromatografi). Grunnen til så god effektivitet i kapillærelektroforesen kan være lett separerbar blanding, godt utstyr og at det er en effektiv separeringsmetode. Toppene for aminosyrene i blandingen skulle i utgangspunktet hatt likt toppareal, men dette var noe variabelt. Dette kan komme av at to av standardene var laget i buffer, mens den tredje var laget i vann. Hvor stor påvirkning dette kan ha hatt på nøyaktigheten av resultatene er uvisst, men det må antas å påvirke i en viss grad. For fenylalanin var det også en merkbar endring i retensjonstid mellom prøveløsningen og standarden. Dette kan også forklares med at løsningene kan ha vært laget forskjellig. Elueringsrekkefølgen av de tre aminosyrene stemmer bra overens med hva som teoretisk var antatt. Tyrosin vandrer tregest gjennom kolonnen på grunn av størst negativ ladning ved ph 10 som følge av en ekstra deprotonert hydroksylgruppe. Fra pka-verdiene for de ulike funksjonelle gruppene til aminosyrene er det tydlig at fenylalanin vil vandre noe langsommere enn tryptofan. Dette kommer av at ved ph 10, vil en større andel av fenylalanin sine proton være deprotonert, og denne har derfor en totalt sett større negativ ladning enn tryptofan. Dette igjen fører til større grad av retensjon. Den effektive elektroforetiske mobiliteten til de tre aminosyrene reflekterer forskjellene i retensjonstid. Den aminosyren som eluerte raskest var den med lavest 9
elektroforetisk mobilitet, og tilsvarende at den langsomst eluerte hadde høyest elektroforetisk mobilitet. Det teoretiske hydrodynamiske injiserte volumet var svært lite, noe som stemmer godt overens med prinsippene for kapillærelektroforese. 6 Konklusjon Det konkluderes med at det er mulig å separere aminosyrer med kapillærelektroforese. De optimale betingelsene for separasjonen ble funnet til å være med en buffer på ph 10, og med et elektrisk potensial på 10 kv mellom elektrodene. Elueringsrekkefølgen ble funnet til å være at tryptofan eluerte raskest, deretter fenylalanin og til slutt tyrasin. Separasjon av tre aminosyrer fungerte godt med kapillærelektroforese. Dette er likevel et noe kunstig eksempel, siden det i de fleste biologiske prøver er 20 aminosyrer. Dersom det hadde vært 20 aminosyrer i prøveblandingen, kan det være det hadde blitt noe vanskeligere å gjennomføre en like god separasjon. 10
Trondheim, 16. oktober 2014 Referanser [1] Greibrokk, Lundanes, Rasmussen, ed. 1998. Kromatografi - Separasjon og deteksjon. [2] Asmussen, J., Schmid, R. Oppgave 7: Separasjon av noen aromatiske aminosyrer ved kapillærelektroforese (CE), versj. 15.04.2013. 11
A Elektroferogrammer 12