1 KJ2053 Kromatografi (Analytiske metoder II) Lundanes Else, Reubsaet Léon, Greibrokk Tyge, Chromatography, Basic Principles, Sample Preparations and..., Wiley-VCH, 2014. ISBN:978-3-527-33620-3 (Gas Chromatography) 2.B. 6 GC Temperatur-regulering 2 2.B. 6 GC Temperatur-regulering 2.B.6. a. Detektor- og injektor-temperatur Som regel regulert /kontrollert uavhengig av kolonne-temperaturen. Temperaturen velges noe høyere enn i kolonna for - i injektoren - å få raskest mulig fordampning (jfr. Kap.2.B.4) på vei gjennom detektoren - å unngå kondensering/"utfrysing" av prøven (forsinkelser, tap av effektivitet, tap av signal (stoff)). 1
3 2.B.6. b. Kolonne-(ovn-)temperatur Må kontrolleres og reguleres nøyaktig og presis!! for å få reproduserbare (retensjons-) resultater. Standard kolonne-ovn : Varmluftsovn = sirkulerende, temperatur-kontrollert luftbad. Ekstrem nøyaktig og reproduserbar T-kontroll er avgjørende. Oppover opptil (over) 400 C, Nedover ned til noen grader over RT, ved mulighet for aktiv kjøling: fra noen få, til titalls C under RT. For ultra-rask GC : Direktoppvarming av GC-kolonna (ikke via varmluft, gir kontrollerbare oppvarmingshastigheter på flere 100 C/min (i bruk kun for kapillær-kolonner). 4 2.B. 6. b. Kolonne-(ovn-)temperatur Generelt : Økt kolonnetemperatur - redusert retensjonstid log V R = a + b T Og, som tidligere nevnt, tommelfingeren for GC som påstår : for 30 C økning i T kol : omtrent halvering av k (og dermed t R ) ved isotermiske analyser. (jfr. enkel utledning i Miller-boken(1988), s.147-148 / (2005), s.174) 2
5 2.B.6. b. Kolonne-(ovn-)temperatur Driftsmåter : (i) gasstrykk- el. gass-strøm-programmert : Sjeldent brukt. Hensikt : å akselerere, eller bremse, elueringen når temperaturen av en eller annen grunn ikke ønskes forandret. Ofte for å spare tid - mot å ofre effektivitet i (mindre viktige / mindre vanskelige) deler av kromatogrammet. 6 2.B.6. b. Kolonne-(ovn-)temperatur Driftsmåter : (ii) isotermisk : Analyse ved konstant kolonnetemperatur. enkel i drift, og gir høyest mulig effektivitet; - for enkle prøver, enkelt-komponenter. - for teoretisk prøve- eller kolonne-karakterisering (N, h, k, α, etc.) Erfaring: t R for homologer øker eksponensielt (eks. n-alkaner) Fordel med, og bruk av, isotermisk analyse: - instrumentelt enkelt, og - forutsetning for mange teoretiske data (valgt som standard - for bestemmelse av bl.a. K, k, R S, N, H, A s ). 3
7 2.B.6. b. Kolonne-(ovn-)temperatur Driftsmåter : (ii) isotermisk : Kolonne-temperaturen velges så høyt at analysen kan gjennomføres på kortest mulig tid, uten at separasjonen av stoffene blir dårlig (forutsatt ingen andre relevante temperaturgrenser brytes, (f.eks. kolonnens MAOT, eller for høy kolonneblødning skapes, eller analytten overlever ikke). 8 2.B.6. b. Kolonne-(ovn-)temperatur Driftsmåter : (iii) Temperatur-programmert : starter analysen ved relativt lav temperatur, som så økes etter hvert. Fordel med, og brukt for : Prøvekomponenter med sterkt forskjellig flyktighet (retensjon) kan separeres innen rimelig tid i én analyse : Temperatur-programmering krever avansert temperatur-styring og -kontroll for å få en reproduserbar temperatur - tid-sammenheng og dermed nødvendig / tilfredsstillende retensjonstidpresisjon! 4
9 2.B.6. b. Kolonne-(ovn-)temperatur Driftsmåter : (iii) Temperatur-programmert : Fremgangsmåte: 1 Ved lav start-temperatur - flyktige komponenter elueres med rimelig god separasjon, mens mer tungflyktige analytter beveger seg sakte, meget sakte eller står omtrent stille ("utfryst") ved/nær kolonne-inngangen; 2 etter hvert, som temperaturen økes, øker damptrykket for de noe "tyngre" analyttene og disse beveger seg med økende fart (ved økende temperatur - damptrykk) gjennom kolonnen. 3 enda tyngre prøvekomponenter starter noe seinere igjen, og de tunge enda seinere, og de meget tunge enda enda... 10 2.B.6. b. Kolonne-(ovn-)temperatur Driftsmåter : (iii) Temperatur-programmert : Fremgangsmåte: 1 Ved lav start-temperatur - flyktige komponenter elueres med rimelig god separasjon, mens mer tungflyktige analytter beveger seg sakte, meget sakte eller står omtrent stille ("utfryst") ved/nær kolonneinngangen; 2 etter hvert, som temperaturen økes, øker damptrykket for de noe "tyngre" analyttene og disse beveger seg med økende fart (ved økende temperatur -damptrykk) gjennom kolonnen. 3 enda tyngre prøvekomponenter starter noe seinere igjen, og de tunge enda seinere, og de meget tunge enda enda... Temperaturprogrammets høyeste (= slutt-) temperatur : bestemmes av retensjons-temperaturen til den minst flyktige komponenten i prøven (eller av kolonnens øvre temperaturgrense). Temperaturprogram flest øker temperaturen lineært (evt. i trinn med ulik (lineær) temperatur-økning), evt. kombinert med isotermiske perioder (ved start og/eller underveis og eller til slutt). Temperaturen et stoff elueres fra kolonnen ved (T kol ved t R ) er retensjonstemperaturen, T R (tidligere: elueringstemperatur, T el ); T R er like karakteristisk som t R (for gitt analyse-system og T-program). 5
11 2.B.6. b. Kolonne-(ovn-)temperatur Driftsmåter : (iii) Temperatur-programmert : Pesticid-kromatogram fra www.blog.restek.com (via Google pict.) Aldrin: Endrin: Temperaturen et stoff elueres fra kolonnen ved (T kol ved t R ) er retensjonstemperaturen, T R (tidligere: elueringstemperatur, T el ); 12 2.B.6. b. Kolonne-(ovn-)temperatur Driftsmåter : (iii) Temperatur-programmert : N.B.: Innenfor et lineært økende temperaturprogram) elueres homologer (forbindelser i en homolog serie av stoffer, her: n-alkaner) med (ca.) konstant avstand i t R (el. T el ) "Et lineært T-program 'logaritmerer' de eksponensielt økende avstandene mellom homologene i en isotermisk analyse". Figure 8.20. A comparison of (a) isothermal and (b) temperature-programmed separtion of n-papraffins. Figure Courtesy of McNair and Bonnelli, Basic Gas Chromatography, Varian 1968. Figur fra: James. M. Miller, Chromatography, Concepts and Contrasts, Wiley Interscience, New York, 1988: Fig. 8.20, s. 146, (el. 2005, s. 173) el. Harold M. McNair & James M. Miller, "Basic Gas Chromatography", 2 nd ed., Wiley, 2009: Fig. 9.2, s. 148. 6
13 2.B.6. b. Kolonne-(ovn-)temperatur Driftsmåter : (iii) Temperatur-programmert : Obs. 1: Fra temperatur-programmerte analyser kan ikke retensjonsfaktor k, eller platetall N (eller derav utledede parametere, som R S, m.m.) utregnes direkte, på en enkel måte. Obs. 2: Økende kolonnetemperatur gir økende (bære-)gass-viskositet økende motstand mot gjennomstrømning av gass gjennom kolonnen. Derfor enten minker bæregasstrømmen med økende T kol utover i analysen (ved konstant kolonne-inngangstrykk) eller øker kolonne-inngangstrykket med med økende T kol (ved konstant bæregass-strøm). 14 2.B.6. c. Eluering av homologe serier: ulike aspekter, indekser Systematiske "retensjons-trender" innenfor homologe serier av forbindelser - som i ovenstående figur vist for n-alkaner - brukes innen kromatografi, også innen GLC, til ulike formål. Klart mest brukt og best studert for metylen-homologer, f.eks. X-(CH 2 )n-ch 3. Erfaring: T b = a + b n T b : kokepunkt; analogt T R, ΔH v = c + d n ΔH v : fordampningsentalpi (gjelder analogt for log p 0, log k) b og d = hhv. kp.-økning og Δh v -økning pr. (metylen-)gruppe 7
15 2.B.6. c. Eluering av homologe serier: ulike aspekter, indekser Like funksjonelle grupper (f.eks. metylen-grupper) i homologe serier: bidrar ofte til ΔH v og til T b med et "fast bidrag" (hhv. b = ΔT kp (CH 2 ), d(=δh v (CH 2 )). Bidraget er omtrent konstant for hver "tilføyd ny gruppe" (fra n til n+1, til n+2, ).. ln k e + f n prop. ln p prop. log t R ' (som her er y-aksen) el. T el g + h n Figur fra Greibrokk & al. "Kromatografi", 1994 (orig. ref. ukjent). Denne egenskap av homologe serier av forbindelser utnyttes på ulike vis innen kromatografi: 16 (i) Retensjonsindeks (Kováts-indeks), I(X), Retensjonsindeksen er et mål for relativ retensjon ved GC av et stoff X i en bestemt stasjonærfase, målt i forhold til retensjonen av n-alkan-homologene i samme stasjonær fase. For isotermiske analyser er den definert som: log t R '(X) - log t R '(n) I(X) = 100 n + 100 [ ] log t R '(n+1) - log t R '(n) t R '(X), t R '(n) og t R '(n+1) er de justerte retensjonstidene (t' R, adjusted retention times) av henholdsvis stoff X, n-alkan C n H 2n+2 (som elueres rett før X) og n-alkan C n+1 H 2n+4 (som elueres rett etter X). 8
17 log t R '(X) - log t R '(n) I(X) = 100 n + 100 [ ] log t R '(n+1) - log t R '(n) (i) Retensjonsindeks (Kováts-indeks), I(X), Den grafiske løsnings-vei for I X : t R '(X), t R '(n) og t R '(n+1) er justerte retensjonstider av hhv. stoff X, n-alkan C n H 2n+2 (som elueres rett før X) og n-alkan C n+1 H 2n+4 (som elueres rett etter X). Originalfigur fra: GRL «Kromatografi» (1994) 18 (i) Retensjonsindeks (Kováts-indeks), I(X), I lineært temperaturprogrammerte analyser øker t R (omtrent) lineært med antall metylen-grupper i en homolog serie : t R (X) - t R (n) I(X) = 100 n + 100 [ ] ( Her kan ikke-justert verdi for t R brukes ) t R (n+1) - t R (n) Målingen må foretas et stykke ut i et lineært programmert område av kromatogrammet, ikke rett etter starten, eller rett etter endringer i T-programmet (eller andre endringer i betingelser med innflytelse på t R, f.eks. plutselige gasstrykk / -strøm-endringer). 9
19 (ii) Separasjonstall, TZ (fra tysk :Trennzahl), eller SN (for engelsk «Separation Number») Separasjonstall er et alternativt mål for å beskrive en kolonnes effektivitet (separasjonsevne). Separasjonstall gjengir antall topper som teoretisk kan plasseres mellom toppene fra to homologe stoffer - som regel n-alkaner - når avstanden mellom disse toppene er antatt å være 2 ganger gjennomsnittlig bredde i halv topphøyde av homolog-toppene (= summen av de to homologenes "halvbredder"). t R (n+1) - t R (n) TZ = [ ] - 1,00 w h (n+1) + w h (n) Obs. Obs.! : Korrekt er : minus 1 (ikke + 1 som i gammel-læreboka (Kro. 1994) 20 (ii) Separasjonstall, TZ (fra tysk :Trennzahl), eller SN (for engelsk «Separation Number») «Separasjonstall : antall topper mellom to homologe stoffer «t R (n+1) - t R (n) TZ = [ ] - 1,00 w h (n+1) + w h (n) Eksempel : 10
21 (ii) Separasjonstall, TZ (fra tysk :Trennzahl), eller SN (for engelsk «Separation Number») «Separasjonstall : antall topper mellom to homologe stoffer «t R (n+1) - t R (n) TZ = [ ] - 1,00 w h (n+1) + w h (n) Dessuten, ang. TZ : TZ kan også beregnes ut fra oppløsningen R S av 2 homologe stoffer: R S TZ = [ ] - 1,00 1,177 Separasjonstallet TZ min som kreves for å kunne separere X og Y ( R S minst 1,177) kan beregnes ut fra I(X) - I(Y): 100 TZ min = [ ] - 1,00 I(X) - I(Y) 22 (iii) Selektivites- / polaritets-indekser Forskjell i relativ retensjon av et stoff på polar og upolar kolonne : Eksempel med benzen: Forskjellen i I bz mellom de 2 kolonnene uttrykker forskjell i styrken av polare interaksjoner mellom benzen og SF'ene. kan brukes til å beskrive en SF's polaritet (målt i f.t. f.eks. squalan) (Squalan velges som standard-sf uten polare interaksjoner, fordi den er én ren, upolar substans). 11
23 (iii) Selektivites- / polaritets-indekser «Kjemisk representative» test-stoffer (foruten benzen) kan velges for typiske forbindelsesklasser / stoffgrupper Systemer basert på dette: Rohrschneider-konstanter og McReynolds-konstantene Samme prinsipp, litt ulike test-/ standardstoffer. Rohrschneider- og Mc Reynoldskonstanter ΔI = I polar - I squalan (J.M. Miller 2005) X Y Z U S 24 (iii) Selektivites- / polaritets-indekser McReynolds-konstant-verdier for noen utvalgte typiske SF er: (McReynolds-konstantene er i dag de mest brukte av de to konstant-typene) Rohrschneider- og Mc Reynoldskonstanter ΔI = I polar - I squalan f.eks. SE30 (= 100% PDMS). CP =100 x (217/4219) = 5,1 (Kromatografi 1994) 12
25 (iv) CP-Indeksen (CP index) Beskriver stasjonærfase-polaritet summarisk i ett tall (glemmer er da informasjon om selektivitet). Indeksen bruker McReynolds-konstantene (de første 5), referanse-fasene er hhv. Squalan (C 30 H 62, upolar, via McReynolds-konstantene) og OV-275 (polar poloysiloksanfase, NOTE). De fleste CP-indeksene ligger mellom 0 og 100. NOTE: (OV-275 = "cyanoallylsilikon"; ifølge C.F.Poole (i "The Essence of Chro.", 2003) er OV-275 en poly(dicyanoalkyl)silikon med 70 % dicyanopropyl- og 30% dicyanoetyl-grupper. ) 26 (iv) CP-Indeksen (CP index) De fleste CP-indeksene ligger mellom 0 og 100. Noen eksempler er gitt i tabellen. For øvrig : En GC-kolonne-produsent bruker (nesten ) systematisk CP-indeksen for å benevne sine GC-SF'er : her er unntaket i denne tabellen CP-1301 (CP = 13, navn-kluss med "likepolar" CP-Sil 13 CB med samme polaritet. Fra : Varian Inc. Chro. & Spectrosc. Supplies, ca.1998 13