Det humane genomet (genom = arvemasse) 3 x 10 9 basepar ca. 30.000 gen ferdigsekvensert ca. år 2001
kromosom 21 127 kjente gen 98 ukjente gen
Biologi cellekultur organ organismar kva gen er involvert i ein gitt biologisk prosess? kva er funksjonen deira? Genomforsking 30.000 gen DNA sekvens proteinsekvens
Biologi kva gen er involvert i ein gitt biologisk prosess? kva er funksjonen deira? Genomforsking cellekultur organ organismar høgkapasitets- analyse 30.000 gen DNA sekvens proteinsekvens parallell analyse av tusenvis av gen og protein DNA mikroarray,, proteinarray + + +
Funksjonell genomforsking biologisk system hypotesedanning funksjon av protein og gen screening genomskala eksperimentell analyse funksjon av protein og gen modellering beregningsbasert biologi
DNA mikroarray (mikromatrise) DNA molekyl = spesifikk probe objektglas 5.000-40.000 probar pr. array
Protein mikroarray antistoff objektglas
Robot for trykking av mikroarray
Mikroarray analyse 1 prøve kontroll 3 scanning 1-5 µg total RNA RNA isolering merking laser 1 laser 2 2 hybridisering raud = opp grøn = ned
Konfokal laserscannar
Høg sensitivitet kan analysere vevsmateriale frå klinisk biopsi 5µg total RNA 1µg total RNA
Light directed oligonucleotide synthesis Lipshutz et al, Nature Genetics, Supplement, 21:20, 1999
Punktmutasjonsanalyse Minisekvensering (APEX: arrayed primer extension) prøve DNA G DNA pol ddctp ddttp ddatp oligonukleotid array ddgtp
Bruksområde - medisin analyse bruksområde genuttrykk sjukdomsdiagnostikk (t.d. kreftdiagnostikk) sekvensvariasjon sjukdomsdiagnostikk (punktmutasjonar) presymptomatisk diagnostikk delesjonar/ kreftdiagnostikk amplifikasjonar = genkopi-tal
Genuttrykk kvar celletype uttrykker 10-20 000 gen fysiologiske og patofysiologiske responsar og tilstandar heng sammen med variasjonar i cellulært genuttrykk kunnskap om variasjonar i genuttrykk som funksjon av fysiologisk/patofysiologisk tilstand kan danne grunnlag for hypoteser om gen-funksjon og for diagnostikk
Genuttrykksmønster i fysiologi og patofysiologi normal mageslimhinne fastande måltid magekreft type A type B
Klassifikasjon av leukemi med DNA mikroarray akutt myeloisk leukemi (AML) < > akutt lymfatisk leukemi (ALL) Diagnostikk i dag: hematologi, histopatologi, immunhistokjemi Mikroarray genuttrykksanalyse: - 100% riktig klassifikasjon med ein analyse pr kreftprøve (beinmarg) - identifiserte prognostisk markør (HOXA9) som er overuttrykt hos patientar som ikkje svarar på behandling Golub TR, et al. Science 286:531-537, 1999
Klassifikasjon av brystkreft med DNA mikroarray Kvar svulst har ein unik genuttrykksprofil som er stabil over mange veker og uendra i metastasar Fem subgrupper brystkreft identifisert ER+/luminal-like A ER+/luminal-like B normal breast basal-like Erb-B2+ aukande malignitet Perou CM, et al, Nature 406: 747-752, 2000 Sørlie T, et al
Klyngeanalyse Prøve 1 2 3 4 5 6 gen 1 gen 7 gen 6 gen 8 gen 3 Fluorescensratio raud > grønn: Overuttrykt raud = grønn grønn > raud : Underuttrykt manglar data gonger reduksjon gonger auke
Classification of human breast tumours Perou et al, Nature 406:747, 2000
Kommersielle DNA mikroarray for forsking og diagnostikk
DNA mikroarrayprosjektet ved NTNU Genomic Classifier Research ORGANISERING klinisk medisin basal medisin kunnskapsoppdaging data varehus etikk molekylærbiologi modellering instrumentering problemløysing tolking
Nasjonalt nettverk for mikroarray- basert funksjonell genomforsking Prosjektleiing 3 Prosjektleiarar 3 Institusjonsrepresentantar DNR probar trykking NTNU probar, trykking datavarehus dataanalyse UiB probar dataanalyse Brukarar
Nasjonalt datavarehus Lab Computer Lab Equipment Screen Array Printer Experiment preparation and execution Browsing and visualisation Tower box Analysis Tools Other Microarray Data Repositories Norwegian Microarray Data Repository (MIAME compliant) Data transfer and Interfaces Public Databases (PubGene, SwissProt, Medline etc.)
Ventrikkelcarcinom (magekreft) i Skandinavia 15-20/100 000 år 5-års overleving ca. 10% predisponerande tilstandar
Mikroarray-analyse av ventrikkelcancer kan bidra til innsikt i ventrikkelcancer-biologi tidleg diagnostikk betre grunnlag for valg av behandling (kirurgi, anna)
Genuttrykk i ventrikkelcancer preliminære data cellevekst S100 calcium-binding protein A3 regenerating islet-derived 1 alpha (pancreatic stone protein) chromosome segregation 1 c-mer proto-oncogene tyrosine kinase protein phosphatase 1 ribosomal protein S16 inflammasjon phospholipase A2, group IIA interleukin 8 monokine induced by gamma interferon natural killer cell transcript 4 human RNA for HLA-Bw72 antigen annexin I (lipocortin) human B-cell receptor associated protein celleadhesjon collagen, type I, alpha 2 fibromodulin osteonectin hevin transmembrane 4 superfamily member 4 intercellular adhesion molecule 2
Mål: identifisere spesifikke genuttrykksmønster for klassifikasjon av magekreft type A type B
Klassifikator for ventrikkelcancer eksempel S100 calciumbinding protein A3 collagen, type I, alpha 2 regenerating islet-derived 1 alpha klasse [1.4, 2.2) [1.6, 2.3) diffus 1.1 diffus -1.2 1.1 diffus 2.3 intestinal -1.3 intestinal -1.3 2.2 intestinal [1.1, 1.4) 1.6 intestinal