Hypoglykemi reduserer legumainaktivitet i makrofager

Hypoglykemi reduserer legumainaktivitet i makrofager Økt legumain i plasma fra pasienter med karotisplakk Inass Elyouncha Mastergradsoppgave i farmasi Avdeling for farmasøytisk biovitenskap Farmasøytisk institutt Det matematiske-naturvitenskapelige fakultet UNIVERSITETET I OSLO September 2015

II

Hypoglykemi reduserer legumainaktivitet i makrofager Økt legumain i plasma fra pasienter med karotisplakk Inass Elyouncha Mastergradsoppgave i farmasi Avdeling for farmasøytisk biovitenskap Farmasøytisk institutt Det matematiske-naturvitenskapelige fakultet UNIVERSITETET I OSLO September 2015 Veiledere: Professor Harald Thidemann Johansen Professor Rigmor Solberg Professor Bente Halvorsen III

Inass Elyouncha 2015 Hypoglykemi reduserer legumainaktivitet i makrofager Økt legumain i plasma fra pasienter med karotisplakk Inass Elyouncha http://www.duo.uio.no/ Trykk: Reprosentralen, Universitetet i Oslo IV

Forord Denne masteroppgaven ble utført ved avdeling for farmasøytisk biovitenskap, Farmasøytisk institutt, Universitetet i Oslo i perioden fra august 2014 til September 2015. Mine interne veiledere har vært professor Harald Thidemann Johansen og professor Rigmor Solberg. Professor Bente Halvorsen ved Institutt for indremedisinsk forskning, OUS, har vært ekstern veileder. Jeg ønsker å rette en stor takk til mine hovedveiledere professor Harald Thidemann Johansen og professor Rigmor Solberg for god oppfølging, veiledning, rådgivning og støtte og ikke minst for god hjelp i skriveprosessen. En stor takk rettes også til professor Bente Halvorsen for verdifulle innspill fra Institutt for indremedisinsk forskning. Tusen takk til overingeniør Hilde Nilsen for god opplæring i det det praktiske arbeidet og all hjelp til cellearbeid og gjennomføring av forsøk på laben. Jeg vil også takke avdelingsingeniør Ellen Lund Sagen ved Institutt for indremedisinsk forskning, for god hjelp med PCR-analyse. Tusen takk til stipendiat Ngoc Nguyen Lunde for nyttige innspil og hyggelige samtaler. Jeg ønsker å takke medstudenter og alle ansatte ved avdelingen i fjerde etasje for et godt og hyggelig arbeidsmiljø gjennom hele året. Jeg vil også takke familie og venner for støtte og motivasjon i denne perioden. Blindern, 15. september 2015 Inass Elyouncha V

VI

Sammendrag Makrofager spiller en viktig rolle i utvikling av aterosklerotiske plakk, og er hovedkilden til proteaser som fører til destabilsering og ruptur av plakkene. Diabetes mellitus øker risikoen for hyperlipidemi og aterosklerose. Cysteinproteasene legumain og cathepsin B er vist å være oppregulert i ateroskelrotiske plakk, og flere cysteinproteaser samt metalloproteaser er regulert av hyperglykemi. I denne studien ble THP-1 celler differensiert med forbolester (PMA) til makrofager før inkubering med ulike konsentrasjoner av glukose (hypo-, normo og hyperglykemi). Aktivitet av legumain (asparaginyl endopeptidase (AEP)-aktivitet) og cathepsin B ble målt i cellelysat ved bruk av enzymspesifikke substrater og inhibitorer, og proteinuttrykk ble bestemt ved hjelp av Western blotting med spesifikke antistoffer. Legumainmengden ble målt ved hjelp av ELISA ( enzyme-linked immunosorbent assay ) både i kondisjonert medium og i plasmaprøver fra friske frivillige og pasienter med aterosklerotisk karotisplakk. I tillegg ble mrna-ekspresjon av legumain, cathepsin B, L og S analysert ved hjelp av real time-pcr. Resultatene viste at både proteinekspresjon, sekresjon og aktivitet av legumain ble nedregulert ved hypoglykemi i forhold til ved normoglykemi i PMA-stimulerte THP-1 celler. Tilsvarende ble ikke observert for cathepsin B. Hypoglykemi førte derimot til signifikant oppregulering av cathepsin B og S mrna-ekspresjon, mens legumain mrna viste tendens til nedregulering. Cathepsin L mrna viste signifikant oppregulering ved hyperglykemi (11 mm). AEP-aktiviteten i THP-1 makrofager ble delvis hemmet av E64 og vist å skyldtes et cathepsin. Legumain ble for første gang detektert i plasmaprøver fra pasienter med aterosklerotisk karotisplakk og ELISA viste signifikant høyere legumainkonsentrasjoner hos pasientene sammenlignet med friske frivillige. Det var ingen signifikante forskjeller i legumainmengden mellom asymptomtiske og symptomatiske aterosklerose pasienter, men derimot viste friske menn å ha høyere legumainkonsentrasjon i plasma enn kvinner. Den eventuelle betydningen av dette er ukjent. VII

Innholdsfortegnelse Forord... V Sammendrag... VII Innholdsfortegnelse... VIII FORKORTELSER... XI 1 Innledning... 1 VIII 1.1 Aterosklerose... 1 1.1.1 Makrofagenes rolle i aterosklerose... 4 1.2 Proteaser... 5 1.2.1 Cysteinproteaser... 6 1.2.2 Legumain... 7 1.2.3 Cysteincathepsiner... 9 1.3 Proteasenes roller i aterosklerose... 10 1.4 Regulering av proteaseaktivitet ved glukose... 11 1.5 Mål for oppgaven... 12 2 Materialer og metoder... 13 2.1 Kjemikalier og reagenser... 13 2.2 Utstyrliste... 16 2.3 Celledyrking... 18 2.3.1 THP-1 celler... 18 2.3.2 Tining av THP-1 celler... 18 2.3.3 Dyrking, splitting og telling av celler... 18 2.3.4 Tillaging av glukose-oppløsninger... 19 2.4 Celleforsøk... 20 2.4.1 Celleforsøk til måling av mrna ekspresjon av legumain og cathepsiner i PMAstimulerte THP-1 celler ved ulike glukosekonsentrasjoner... 20 2.4.2 Celleforsøk i brett til måling av totalprotein, enzymaktivitet og Western i PMAstimulerte THP-1 celler... 20 2.4.3 Celleforsøk i flasker til måling av totalprotein, legumainaktivitet, Western og ELISA i PMA-stimulerte THP-1 celler... 21 2.5 Pasientmateriale... 21 2.6 Totalproteinmåling... 21 2.7 Enzymaktivitetsmåling... 22

2.7.1 Legumainaktivitet... 22 2.7.2 Måling av cathepsin B-aktivitet... 23 2.8 Western blotting... 23 2.9 ˮEnzyme-linked immunosorbent assay ˮ (ELISA)... 24 2.10 Real time PCR... 25 2.10.1 Isolering og kvantifisering av total RNA... 25 2.10.2 Komplementært DNA (cdna)- syntese... 26 2.10.3 Real-time PCR... 27 2.11 Statistiske analyser... 29 3 RESULTATER... 30 3.1 Hypoglykemi fører til oppregulering av cathepsin B og S mrna-ekspresjon, men ikke av legumain... 30 3.2 Effekt av glukose på AEP- og cathepsin B- aktivitet i PMA-stimulerte THP-1 celler 31 3.3 Effekt av glukose på legumainsekresjon fra PMA-stimulerte THP-1 celler... 36 3.4 Konsentrasjonen av legumain i plasmaprøver fra pasienter med symptomatiske eller asymptomatiske aterosklerotiske karotisplakk... 37 4 Diskusjon... 40 Cellemodell og metoder... 41 Hypoglykemi hemmer aktivitet av legumain, men ikke av cathepsiner... 42 Legumain i plasmaprøver fra karotispasienter... 46 5 KONKLUSJON... 47 Litteraturliste... 49 APPENDIKS... 55 IX

X

FORKORTELSER AEP APC Asn Asp Cys DMSO DTT Asparaginylendopeptidase Antigenpresenterende celle Asparagin Aspartat Cystein Dimetylsulfoksid Ditiotreitol E-64 Trans-epoksysuksinyl-L-leucylamido-(4-guanidino)butan EC ECM ELISA ER FBS His ICAM-1 IL IFN-γ KO Endotelcelle Ekstracellulær matriks Enzyme-linked immunosorbent assay Endoplasmatisk retikulum Føtalt kalveserum Histidin Intercellulært adhesjonmolekyl-1 Interleukin Interferon-γ Knock-out XI

LDL Low density lipoprotein MCP M-CSF MHC MMP mrna OxLDL PMA PTC SMC SR THP-1 TLR TNFα VCAM Z-Ala-Ala-Asn-AMC Z-Arg-Arg-AMC Monocytt kjemoattraktant protein Makrofag kolonistimulerende faktor Major histocompatibility complex Matriks metalloproteinase Messenger ribonukleinsyre Oksidert low density lipoprotein Forbol 12-myristat 13-acetat Proksimal tubulær celle Glatte muskelceller Scavenger reseptor Human leukemia monocytic cell line (ATCC, TIB-202) Toll-like reseptor Tumornekrosefaktor-α Vaskulært celleadhesjonmolekyl Benzyloksykarbonyl-alanin-alanin-asparagin-7-amino-4- metylkumarin Benzyloksykarbonyl-arginin-arginin-7-amino-4-metylkumarin XII

1 Innledning 1.1 Aterosklerose Aterosklerose er en kronisk inflammatorisk sykdom som utgjør en viktig årsak til morbiditet og mortalitet i vestlige land, og er assosiert med økt risiko for hjerte- og karsykdommer [1, 2]. Inflammatoriske prosesser står sentralt i utviklingen av aterosklerose, og risikofaktorer som hypertensjon, dyslipidemi, diabetes mellitus, og andre livsstilrelaterte forhold som røykevaner og stress er av stor betydning i denne prosessen. De første tegn til aterosklerose kan sees allerede hos barn med hyperkolesterolemi, og utvikler seg gradvis over tid. Aterosklerosen affiserer i første omgang store og mellomstore arterier, fortrinnsvis forgreninger. Koronararteriene er særlig disponert for forandringer relatert til aterosklerose [3]. Sykdommen kjennetegnes av aterosklerotiske lesjoner som inneholder en unormal akkumulering av celler, lipider og ekstracellulært materiale i arterieveggen [1, 4]. Aterosklerotiske lesjoner (plakk) er asymmetriske fortykninger som oppstår i det innerste laget av arterieveggen, intima [5]. Første stadium i utvikling av plakk begynner med en avleiring av lipidrike celler under endotelet, en såkalt fettansamling ( fatty streak ). De fleste cellene i fatty streak er makrofager samt noen T-celler. Slike fettansamlinger er asymptomatiske, og kan vokse opp og utvikle seg til aterosklerotiske plakk. Plakkdannelse kan føre til innsnevring av lumen i blodårene [5]. Aterosklerotiske plakk består av en lipidholdig kjerne som inneholder skumceller og ekstracellulære lipiddråper, og omgis av en fibrøs kappe av glatte muskelceller (SMC) og kollagenrik matriks [5]. Den fibrøse kappen beskytter plakket mot ruptur. Dersom plakk i blodåreveggen brister eller løsner og kommer i kontakt med blodet, kan det dannes blodpropp som hindrer blodstrømmen. Dette kan i sin tur føre til hjerneinfarkt, hjerteinfarkt eller kritisk iskemi i andre organsystemer [5]. Når det oppstår endoteldysfunksjon ved en mekanisk eller kjemisk påvirkning som ved hypertensjon eller hyperkoleseterolemi, vil produksjon av en rekke signalstoffer endres og fører til økt penetrasjon av lipider, remodellering av arterieveggen, samt adhesjon og vandring av betennelsesceller (monocytter og T-lymfocytter) gjennom endotelet [6, 7]. 1

LDL (low density lipoprotein) er en type lipoprotein som består av fosfolipider, kolesterolestere, triglyserider samt fritt kolesterol [8]. Ved hyperkolesterolemi vil overskudd av LDL passere gjennom endotelet og blir værende i intima (figur 1-1). Denne infiltrasjonen av LDL til intima vil sette i gang en inflammatorisk respons i arterieveggen [5]. Figur 1-1: Effekt av LDL-infiltrasjon på inflammasjon i arterieveggen. Overskudd av LDL tas opp i arterieveggen og samles i intima, hvor de modifiseres til oksidert LDL (oxldl). OxLDL induserer aktivering av endotelceller (EC) og produksjon av leukocytt adhesjonsmolekyler. Makrofager tar opp oxldl via scavenger reseptorer, og danner skumceller. Modifisert fra [5]. LDL kan oksideres under passasjen gjennom endotelet og frigjøre fosfolipider som stimulerer endotelet til å binde monocytter [9, 10]. Bindingen av betennelsesceller fremmes av overflateproteiner kalt adhesjonsmolekyler. De aktiverte endotelcellene uttrykker ulike typer adhesjonsmolekyler som vaskulær celleadhesjonsmolekyl-1 (VCAM-1) og 2

intercellulæradhesjonsmolekyl-1 (ICAM-1) [5, 11]. Monocytter responderer på kjemoattraktanter produsert av vaskulære endotelceller og glattmuskelceller, og vandrer gjennom endotelcellelaget til intima, hvor de differensierer til makrofager. Denne migrasjonen skjer ved binding til VCAM-1 på overflaten av EC. I intima omdannes makrofagene til såkalte skumceller etter opptak av oxldl-partikler. Videre presenterer de aktiverte makrofagene oksiderte LDL-fragmenter på overflaten, som fører til aktivering av T- lymfocytter. I tillegg stimulerer oksidert LDL migrasjonen av glatte muskelceller inn i det aterosklerotiske plakket i intima [10]. Under utviklingen av aterosklerose frigjøres en rekke signalsubstanser og frie radikaler som aktiverer immunceller [5]. Aktiverte betennelsesceller utskiller proteolytiske enzymer, cytokiner og vevsfaktorer, som bidrar til utviklingen av plakket. Betennelsescellene akkumuleres rundt den fettrike kjernen og i den fibrøse kappen [12, 13]. Graden av inflammasjon i det aterosklerotiske plakket varierer. Vi skiller mellom stabile og ustabile plakk. Ustabile plakk kjennetegnes av høy grad av inflammasjon som aktiverer proteolytiske enzymer, som bryter ned den fibrøse kappen. En tynn kappe sprekker lettere og fører til plakkruptur (figur 1-2). Figur 1-2: Et ustabilt aterosklerotisk plakk. Ruptur av det fibrøse plakket oppstår vanligvis i områder med tynn fibrøs kappe, og kan føre til trombose. Kappen blir tynnere tilsynelatende på grunn av influks og aktivering av makrofager, som frigjør metalloproteaser og andre proteolytiske enzymer i disse områdene. Modifisert fra [3]. 3

Som nevnt over involverer aterogenesen flere ulike celler som makrofager, T-lymfocytter, endotelceller og glattmuskelceller [6]. OxLDL presentert av antigenpresenterende celler (APC, eks. makrofager og dendrittiske celler) trigger aktivering av CD4+ T-celler i arterien, og produksjon av Th1 cytokiner, som for eksempel interferon-γ (IFN-γ). IFN-γ aktiverer makrofager og vaskulære SMC, og promoterer en aktiveringskaskade med produksjon av en rekke cytokiner som tumornekrosefaktor- α (TNF-α) og interleukin-1 (IL-1). Denne kaskaden resulterer i en inflammatorisk prosess som promoterer aterosklerose [5]. Mastceller i sin tur bidrar til aterogenesen ved produksjon av proinflammatoriske cytokiner (IL-6 og IFN-γ), som øker ekspresjon av matriksmetalloproteaser (MMP-2 og MMP-9) [14]. Dannelse av Th2- hjelpeceller er en annen type immunrespons som kan oppstå ved antigeninteraksjonen, og vil stimulere til produksjon av antiinflammatoriske cytokiner (eks. interleukin-10) som virker dempende på inflammasjonen [5]. En rekke studier har vist forhøyede kjemokinnivåer ved aterosklerose, både systemisk og i aterosklerotiske plakk. Monocytt kjemoattraktant protein-4 (MCP-4) er en effektiv kjemoattraktant som stimulerer rekruttering av eosinofile, monocytter og T-celler, og er vist å være involvert i en rekke inflammatoriske tilstander som astma og revmatoid artritt. Høye nivåer av MCP-4 er funnet i karotisplakk, og er dermed foreslått å ha en rolle i aterogenesen og plakkdestabilisering [15]. 1.1.1 Makrofagenes rolle i aterosklerose Makrofager anses som viktige deltakere i dannelse og utvikling av aterosklerotiske plakk, på grunn av deres rolle i modulering av både lipidmetabolismen og inflammasjonsresponsen [16]. Monocyttene fra blodsirkulasjonen adhererer til aktiverte endotelceller i arterieveggen etter en interaksjon med adhesjonsmolekylene som ble nevnt tidligere. De adherente monocyttene migrerer fra blodet til intima, og differensierer til makrofager. Migrasjonen av monocyttene til subendotelområdet induseres hovedsakelig av monocytt kjemoattraktant protein 1 (MCP-1), TNF-α og andre cytokiner som utskilles fra SMC i plakkene, og differensiering av monocytter til makrofager stimuleres av makrofag kolonistimulerende faktor (M-CSF). Makrofagene fagocytterer de modifiserte lipoproteinene ved hjelp av scavenger reseptorer (SR), og transformeres til lipidrike skumceller som akkumuleres i intima. Videre dannes en fettansamling, og senere en lipidkjerne i aterosklerotiske plakk [17]. I tillegg til lipidakkumulering, deltar makrofagene aktivt i den inflammatoriske prosessen ved frigjøring av en rekke inflammatoriske cytokiner som TNF- α, IL-1 og IL-8 (CXCL-8) [16]. 4

Det er kjent at makrofagene differensierer til to subtyper, M1 og M2, i aterosklerotiske plakk. Disse to subtypene utviser ulike karakteristiske egenskaper. M1-makrofager produserer proinflammatoriske cytokiner som tiltrekker immunceller og øker opptak av oxldl. M2- makrofager derimot utskiller antiinflammatoriske cytokiner som IL-10 og TGF-β, som kan dempe inflammasjonen og promotere angiogenesen og vevsremodellering [16, 18, 19]. I tillegg utskiller de aktiverte M1-makrofagene matriksmetalloproteaser (MMP er) og cysteincathepsiner, blant annet MMP-9, cathepsin B, L og S, som direkte svekker og fremmer degradering av den fibrøse kappen, og bidrar til ustabilitet av plakket [20]. Økt nivå av cysteinproteasen legumain er vist å korrelere med tilstedeværelse av makrofager i ustabile plakk, noe som tyder på at enzymet utskilles hovedsakelig fra makrofagene ved aterosklerose [2]. 1.2 Proteaser Proteaser, også kjent som proteolytiske enzymer, er en gruppe enzymer som katalyserer spaltingen av proteiner ved hydrolyse av peptidbindinger. Proteaser deles inn i eksopeptidaser og endopeptidaser etter hvor i proteinsubstratet kløyvingen skjer. Eksopeptidaser, henholdsvis aminopeptidaser og karboksypeptidaser, spalter proteinsubstratet enten fra amino- (N-) eller karboksy- (C-) terminal ende, mens endopeptidaser spalter interne peptidbindinger i proteinet [21, 22]. Proteaser klassifiseres i seks klasser på bakgrunn av deres katalytiske sete; aspartat-, cystein-, glutamat-, metallo-, serin-, og treoninproteaser (figur 1-3). I MEROPS peptiddatabase [23], er proteaser inndelt i familier og klaner basert på deres strukturlikheter. Proteaser kan deles inn i klaner basert på deres tertiære strukturer, og i familier etter likhet i aminosyresekvens [23, 24]. Proteaser ble først assosiert med proteindegradering relatert til fordøyelse av mat og intracellulær protein turn over. Senere ble det påvist at proteaser også inngår i reguleringen av viktige fysiologiske prosesser slik som cellesyklus, celleproliferasjon, celledød, DNAreplikasjon, vevsdannelse, hemostase, sårheling og immunrespons [22, 25]. Proteasesignalveier er strengt regulert, og feilregulering av proteaseaktiviteten kan føre til ulike patologiske tilstander som for eksempel kreft, kardiovaskulære og inflammatoriske sykdommer, osteoporose og nevrologiske lidelser [22, 26]. Det er vist at proteolytiske enzymer er involvert i patogenesen av aterosklerose på flere stadier. De bidrar til infiltrasjon 5

av leukocytter i subendotelområder, migrasjon av glattmuskelceller til intima, degradering av ekstracellulære matriks (ECM), plakkdestabilisering og neovaskularisering. En rekke metallo-, serin- og cysteinproteaser er vist til å inngå i utviklingen av aterosklerose [27]. 1.2.1 Cysteinproteaser Cysteinproteaser utgjør en av de største klassene av proteolytiske enzymer, og det katalytiske setet i disse proteasene inneholder aminosyrene cystein (Cys) og histidin (His). De fleste enzymene i denne gruppen er endopeptidaser, og kan inndeles i omtrent 30 ulike familier på bakgrunn av proteasenes molekylstruktur. Fire av familiene er påvist i pattedyr, hvor den største familien er papainfamilien (C1), som inkluderer blant annet cathepsin B, H, L og S. Disse enzymene er hovedsakelig lysosomale enzymer og ansvarlige for proteolyse i det lysosomale systemet, men kan også skilles ut i cytosol eller ekstracellulært. I cytosol finnes calpainfamilien (C2) og caspasefamilien (C14). Legumain, også kalt asparaginylendopeptidase (AEP), er en lysosomal cysteinprotease som tilhører familien C13. Cysteinproteaser inndeles i klaner på bakgrunn av strukturlikhet. Legumain og caspasene tilhører klan CD, mens cysteincathepsiner samt calpainer tilhører klan CA [28, 29] (figur 1-3). Figur 1-3: Oversikt over de ulike hovedgruppene av proteaser. Modifisert fra [23]. 6

Cysteinproteaser syntetiseres som inaktive preproenzymer og prosesseres til deres modne former via autokatalyse eller ved hjelp av andre proteaser [30]. Proenzymene kløyves ved passasje gjennom det endoplasmatiske retikulum (ER), transporteres gjennom golgiapparatet, og modifiseres i de sure endosomene/lysosomene til modne aktive enzymer. De siste nevnte organellene gir proteasene optimal ph til deres aktivitet [31, 32]. Proteasenes aktivitet kan reguleres gjennom ph eller endogene proteaseinhibitorer som cystatiner [32]. Cystatiner er kompetitive og reversible inhibitorer av cysteinproteaser [33]. 1.2.2 Legumain Legumain, også kalt asparaginylendopeptidase (AEP), tilhører som nevnt C13-familien innenfor CD-klanen av cysteinproteaser (figur 1-3) [27]. Enzymet finnes i mange celletyper, og ble først oppdaget i planter og parasitten Shistosoma mansoni. Senere ble det påvist også i pattedyr (1997), da enzymet ble klonet og sekvensert fra menneske og gris [28, 34]. Legumain er en lysosomal endopeptidase som spesifikt spalter karboksyterminalt for aminosyren asparagin (Asn) i P1-posisjonen i substrater [35]. Hittil er legumain det eneste kjente enzymet med en slik spesifisitet [36]. I likhet med caspasene er legumain også vist å spalte substrater etter aspartat (Asp) ved sur ph [37]. Ved sur ph vil Asp være i protonert form slik at den ligner Asn [38]. Noen kjente legumainsubstrater er cathepsin B, H og L, promatriksmetalloproteinase-2 (prommp-2) [34], matriksproteinet fibronektin [39], α- thymosin [40] og acetoacetyl-coa-syntetase [41]. Legumainaktivitet er detektert i mange ulike mammalske vev som nyrer, placenta, milt, og testikler [42]. Blant disse organene er enzymaktiviteten høyest i nyrer og placenta [43]. Ekspresjon og aktivitet av legumain er også observert i antigenpresenterende celler, som makrofager [44]. In vitro forsøk har påvist at monocytt til makrofag differensiering medfører en kraftig økning i både enzymaktivitet og ekspresjon av legumain [45]. Sekresjon av legumain fra makrofager ble observert, men ikke fra monocytter. Samtidig ble det vist at M2 makrofager har høyere nivå av moden aktiv form (36 kda) av legumain enn M1 makrofager, som hovedsakelig utrykker proformen (56 kda) av legumain. Legumain er lokalisert først og fremst i de sene endosomene og lysosomene, og det sure miljøet er ansett å være fordelaktig for proteolytisk aktivitet [46]. I tillegg har proteolytisk aktiv legumain også blitt observert i kjernen og i det ekstracellulære miljø, hvor det kan være involvert i patologiske prosesser [47, 48]. Legumain har en Arg-Gly-Asp 120 (RGD) motiv som 7

binder til α v β 3 integrinreseptor [49-51]. Ved binding til α v β integrinreseptor, øker phoptimum for legumainaktivitet, noe som indikerer at legumain også kan være aktiv ved mindre surt miljø enn i lysosomene [49]. Overekspresjon og co-lokalisering av både α v β integrin og legumain er sett i tumorceller og i tumormikromiljø [51]. Aktivering Aktiviteten og stabiliteten til legumain er vist til å være ph-avhengig. Under normale forhold utviser legumain høyest aktivitet, og er stabil ved ph 5,8. Ved ph 7 eller høyre, vil enzymet bli irreversibelt denaturert og være inaktivt [28]. Legumain dannes som et inaktivt proenzym (56 kda), og transporteres til lysosomene hvor det skjer autokatalyse. Ved ph 5,5 vil proenzymet bli spaltet ved Asn323, og resultere i et inaktivt mellomprodukt på 47 kda (figur 1-4). Ved en ytterligere reduksjon i ph vil det dannes en 46 kda aktiv intermediær form ved avspaltning av et kort N-terminalt peptid ved Asp25. I siste steg i aktivering av legumain vil den aktive intermediære formen modifiseres til en moden aktiv form av legumain (36 kda) via andre lysosomale proteaser [35]. Forskjellen i enzymaktivitet mellom de to aktive formene ser ikke ut til å være signifikant [35]. Legumainaktivitet kan hemmes av flere potente endogene inhibitorer som cystatin E/M og C [47]. E-64 som er en potent inhibitor av de fleste cysteinproteaser innenfor papainfamilien, inkludert de fleste lysosomale cathepsiner, har ingen effekt på legumainaktivitet [46]. Figur 1-4: Cellulær prosessering og aktivering av legumain. Det inaktive 56 KDa proenzymet konverteres autokatalytisk til en aktiv intermediær form av legumain på 46 KDa ved lav ph. Andre lysosomale proteaser fører til videre spaltning av enzymet, og dannelse av moden legumain form på 36 KDa. Modifisert fra [35]. 8

Biologiske funksjoner Legumain er vist til å være involvert i viktige biologiske responser ved å spalte proteiners asparaginylbindinger. Selv om noen legumainsubstrater er kjent, så er den fysiologiske funksjonen til enzymet i pattedyr ennå ikke fullstendig klarlagt [52]. Manoury et al. [44] har rapportert at legumain har en viktig rolle i prosessering av et bakterielt antigen, tetanustoksin C fragment, for presentering til MHC- II (klasse II major histocompatibility complex) i det endosomale/lysosomale systemet i antigenpresenterende celler. Videre har Choi et al. [53, 54] vist at legumain har en hemmende effekt på osteoklast dannelse og beinresorpsjon. Både in vitro og in vivo studier har vist at legumain er ansvarlig for kløyvingen av intracellulær Tolllike reseptor 9 (TLR-9). Denne kløyvingen medfører aktivering av TLR-9 i dendrittiske celler, som er med på å mediere den medfødte immunresponsen [55]. Legumain er også nødvendig for normal nyrefunksjon ved å opprettholde den lysosomale proteinkatabolismen i proksimale tubulære celler (PTC) i nyrene. Akkumulering av forstørrede lysosomer ble observert i PTC fra legumain knock-out (KO) mus [56]. I tillegg ser det ut til at enzymet er involvert i remodellering av ekstracellulær matriks ved degradering av fibronektin som er en av hovedbestanddelene i ECM [39]. Økt ekspresjon og aktivitet av legumain er observert i ustabile plakk sammenliknet med stabile plakk, og enzymet er antatt å være involvert i utvikling og progresjon av aterosklerose [2, 27]. Overuttrykk av enzymet er også assosiert med økt invasjon og metastase av mange tumorer [50]. 1.2.3 Cysteincathepsiner Cysteincathepsiner er proteolytiske enzymer tilhørende proteasefamilien C1A, en undergruppe av papainfamilien C1 [57]. De fleste cathepsinene er endoproteaser, selv om dipeptidyl-peptidase I (tidligere kalt cathepsin C) og cathepsin X, fungerer som eksoproteaser. I tillegg utviser cathepsin B og H både eksoprotease og endoprotease aktiviteter [58, 59]. Cathepsin B er den best karakteriserte cysteinproteasen i C1 familien, og som de fleste cathepsinene har de optimal aktivitet ved sur ph [60, 61]. I likhet med legumain translateres cathepsiner som proenzymer, transporteres gjennom Golgiapparatet og omdannes i lysosomene til modne cathepsiner [62]. Sistnevnte prosess medieres via ulike proteaser som pepsin, nøytrofil elastase og andre cysteinproteaser [60]. De to aktive formene av cathepsin B er et enkeltkjedet enzym ( single chain ) på 29 kda og en dobbelkjedet form ( two chain ) med en molekylvekt på 25 kda. Det er vist at legumain bidrar til prosessering av single 9

chain form til two chain av cathepsin B, H og L. Dette ble bevist i legumain knock-out mus som viste fravær av two chain formene [28, 52]. Cathepsinene uttrykkes i ulike celletyper, og er involvert i intra- og ekstracellulær degradering og omsetning av proteiner [63]. Cathepsin B og L ser ut til å være involvert i patologiske prosesser som kreft og aterosklerose [60]. I gen knock-out studier ble både cathepsin B og L KO mus født infertile. Cathepsin L KO mus viste en forsinket hårvekst og utviklet hårtap [64], mens cathepsin B KO mus vokste normalt uten noen åpenbare nevrologiske eller atferdsmessige endringer [65]. Cathepsin B inngår i degradering av ekstracellulære matrikskomponenter deriblant type IV kollagen, laminin og fibronektin. Enzymer med sterk elastase- og kollagenaseaktivitet er hovedansvarlige for remodellering av ECM, og en slik aktivitet kan føre til ulike patologiske tilstander [63]. Som respons på inflammatoriske signaler, kan frigjøring av cathepsin B fra lysosomer til cytoplasma føre til apoptose av visse celler slik som hepatocytter og immunceller [21]. Blant matriksdegraderende enzymer er cathepsin K det eneste enzymet som har en essensiell rolle i benresorpsjon [63]. Li et al. observerte at cathepsin K KO mus utvikler osteoporose, har forhøyet antall osteoklaster og økt benskjørhet [66]. I tillegg er cathepsin S uttrykt i høye konsentrasjoner i antigenpresenterende celler som dendrittiske celler og B-celler, og studier i mus viser en korrelasjon mellom mangel på cathepsin S og nedsatt antigenpresentasjon via MHC klasse II [63, 67]. Et annet enzym som er involvert i immunologiske signalveier, er cathepsin W som er høyt uttrykt i CD8+ lymfocytter og natural killer (NK) celler [63]. 1.3 Proteasenes roller i aterosklerose Ulike proteaser kan bidra til utvikling og progresjon av aterosklerotiske plakk gjennom degradering av ekstracellulær matriks. ECM består av elastin, kollagen og proteoglykaner som hovedsakelig produseres av SMC [60]. Spesielt serinproteaser og metalloproteinaser står for mesteparten av degradering av kollagen i den fibrøse kappen som omgir plakket. Dette medfører en redusert kappestyrke, og kan dermed lett føre til plakkruptur [68, 69]. Flere studier har vist at cathepsiner er sterkt assosiert med aterogenesen og kardiovaskulære sykdommer [60, 70]. Cathepsiner uttrykkes av de fleste plakkceller herunder makrofager, endotelceller og glatte SMC [60, 70]. Det ble observert forhøyede protein- eller mrna-nivåer av cathepsin B, K, L og S i mus og humane aterosklerotiske plakk i forhold til normale 10

arterier. I tillegg uttrykkes cathepsin K og S i høy grad i makrofager, spesielt i skulderområdet i plakkene. Disse cathepsinene er også funnet i glatte muskelceller som traverserer den indre elastiske laminaen og den fibrøse kappen. Dette kan tyde på at makrofager og SMC utnytter disse proteasene til å innfiltrere plakkene. Det er også vist at cathepsin S uttrykkes i EC som ligger langs lumen av arterien og i mikrovaskulaturen inn i plakket, noe som indikerer at enzymet er involvert i neovaskulariseringen under aterogenesen [60, 70]. Nyere data indikerer at legumain kan være involvert i remodellering av ECM gjennom aktivering av prommp-2, direkte og indirekte (via MMP-2) degradering av fibronektin og prosessering av andre lysosomale proteaser, og dermed bidrar til plakkets ustabilitet og ruptur [2, 39, 71]. Studier har vist at legumain er oppregulert i områder med ustabile plakk sammenliknet med stabile plakk. Høye mengder av både legumainprotein og -aktivitet er målt i ustabile områder av plakk [72]. De høye nivåene av legumain korrelerer med uttrykk av makrofager og makrofag-deriverte skumceller i skulderregionen av plakket. Disse funnene tyder på at proteasen deltar aktivt i destabilisering av den fibrøse kappen, og i patogenesen ved aterosklerose [2, 27]. 1.4 Regulering av proteaseaktivitet ved glukose Nyere studier indikerer at glukose regulerer lysosomale enzymer [73]. Studier på humane primære monocytter og murin makrofag cellelinje har vist at stimulering med økende glukosekonsentrasjoner medfører nedregulering i cellulær aktivitet av cathepsin B, D, L og S [73]. Inhibering av cathepsin S i mus induserte en kraftig reduksjon av glukose i blod [74]. Samtidig ble det rappotert en positiv korrelasjon mellom cathepsin K, -S og insulinresistens [75]. I en in vivo studie ble effekten av simvastatin (HMG-CoA reduktase inhibitor) på glukosemetabolisme og legumainaktivitet studert i humane myotuber [76]. Det ble vist at simvastatin reduserte glukoseopptakk og -oksidering i humane myotuber. Samtidig ble legumainaktivitet og ekspresjon redusert i simvastatinbehandlede myotuber [76]. Disse funnene tyder på en mulig sammenheng mellom glukose og legumain. 11

1.5 Mål for oppgaven Målet med denne oppgaven er å studere om lysosomale cysteinproteaser reguleres av cellenes tilgang på glukose (hypo-, normo- eller hyperglykemi) ved å: Studere effekt på mrna-/proteinekspresjon, samt aktivitet og sekresjon i PMAstimulerte THP-1 celler. Studere AEP-aktiviteten i PMA-stimulerte THP-1 celler ved hjelp av en ny spesifikk legumainhemmer (QDD) og en hemmer av cathepsiner (E64) Undersøke om legumain kan detekteres i plasmaprøver fra pasienter med aterosklerotiske karotisplakk, og om det er forskjeller mellom pasienter med asymptomatiske eller symptomatiske aterosklerotiske karotisplakk og i forhold til friske frivillige. 12

2 Materialer og metoder 2.1 Kjemikalier og reagenser Aceton AnalaR NORMAPUR,CH 3 COCH 3 (20066.296) Beta-aktin (ACTB) Albuminstandard (23209) Bio-Rad Protein Assay Dye Reagent Concentrate (500-0006) CHAPS, C 32 H 58 N 2 O 7 S. xh 2 O (C3023-IG) Dinatrium-EDTA, Na 2 C 10 H 16 N 2 O 8 (00064) Dinatriumhydrogenfosfat, Na 2 HPO 4.2H 2 (28029.292) DMSO, Dimetylsulfoksid, (CH 3 ) 2 SO (D2650) DPBS, Dulbeccoʹs Phosphate Buffered Saline w/o Calcium or Magnesium (17-512) DTT, Ditiotreitol C 4 H 10 O 2 S 2 (438117) E-64,Trans-epoksysuksinyl-L-leucylamido- (4-guanidino)butan FBS, Føtalt kalveserum (SV 30160.03) Fettfri tørrmelk Funigazone (Amphotericin ) VWR Prolabo, Fontenay, Frankrike Cell Signaling Technology, MA, USA Thermo Scientific, USA Bio-Rad Laboratories Inc., USA Sigma-Aldrich, St.Louis, MI, USA Ferak Berlin, Tyskland VWR Prolabo, Fontenay, Frankrike Sigma-Aldrich,St.Louis, MI, USA Sigma-Aldrich, St.Louis, MI,USA Sigma-Aldrich, St.Louis, MI,USA Sigma-Aldrich, St.Louis,MI,USA Hyclone, Logan, Utah, USA Normilk, Levanger, Norge Bristol-Meyers Squibb, Ny, USA 13

Glukose, C 6 H 12 O 6 (G8644) Hepes Buffer C 8 H 18 N 2 O 4 S (H0887) Human cathepsin B polyclonal goat antibody, primærantistoff (AF 953) Human cathepsin B-primere (forward & reverse) Human cathepsin L polyclonal goat antibody, Primærantistoff (AF 952) Human cathepsin L-primere (forward & reverse) Sigma-Aldrich, St.Louis, MI, USA Sigma-Aldrich, St.Louis, MI, USA R & D Systems, Minneapolis, MN, USA Sigma-Aldrich, St.Louis, MI,, USA R & D Systems, Minneapolis, MN, USA Life Technologies, CA, USA Human cathepsin S-primere (forward & reverse) Human legumain polyclonal goat antibody, Primærantistoff (AF 2199) Human legumain primere (forward og reverse) Human total legumain DuoSet-Kit (DY4769) 2-Mercaptoetanol C 2 H 6 OS (M7522) Natriumacetat NaC 2 H 4 O 2.3H 2 O (6267.0500) Natriumpyruvat C 3 H 3 NaO 3 (11360-039) NuPAGE Antioxidant, Invitrogen (NP0005) R & D Systems, Minneapolis, MN, USA Sigma-Aldrich, St.Louis, MI, USA R & D Systems, Minneapolis, MN, USA Sigma-Aldrich, St.Louis, MI, USA Merck, Darmstadt, Tyskland Gibco, Carlsbad, CA, USA Life Technologies, Carlsbad, CA, USA NuPAGE 4-12% Bis-Tris Protein Gels Novex (NP0322PK2) 14

NuPAGE LDS Sample Buffer (4X) Novex (NP 0007) Life Technologies, Carlsbad, CA, USA NuPAGE MOPS SDS Running Buffer (20X) Novex (NP 0001) Penicillin-streptomycin (155646) PerfeCta SYBR Green FastMix, Low ROX 95074-250 PerfectPure RNA Cultured Cell Kit PMA, Forbol 12-myristat 13-acetat, 12-Otetradekanoylphorbol 13-acetate (p1585) Polyclonal Rabbit Anti-Goat Immunoglobulins/HRP,Sekundær antistoff (p0160) Ponceau S løsning (p7170) Precision Plus Protein Dual Color Standards (161-0374) Restore Western Blot Stripping Buffer (21059) RPMI 1640 medium med glutamin og natriumbikarbonat (21875-034) RPMI 1640 medium uten glukose (11879-020) QDD-inhibitor (legumain-inhibitor) Thermo Scientific, Rockford, USA Quanta Biosciences, Inc., Gaithersburg, USA 5-PRIME, Inc., Gaithersburd, USA Sigma-Aldrich, St.Louis, MI, USA Dako, Glostrup, Danmark Sigma-Aldrich, St.Louis, MI, USA Bio-Rad Laboratories, Inc., USA Thermo Scientific, Rockford, USA Gibco, Carlsbad, CA, USA Gibco, Carlsbad, CA, USA Richard Williams, Centre for Cancer Research & Cell Biology, Queenʹs University, Belfast, UK 15

Sitronsyre C 6 H 8 O 7.H 2 O (1.00244.1000) SuperSignal West Dura Extended Duration Substrate (34076) TaqMan Universal PCR Master Mix Merck, Darmstadt, Tyskland Thermo Scientific, Rockford, USA Life technologies, Carlsbad, CA, USA 20X TaqMan Gene Expression Assay Mix Tryptan Blue Stain (0,4%) (T10282) Tween 20 (170-6531) Z-Ala-Ala-Asn-AMC, legumainsubstrat Z-Arg-Arg-AMC, cathepsin B-substrat Life Technologies, Carlsbad, CA, USA Bio-Rad Laboratories, Inc., USA Bachem, Bubendort, Sveits Bachem, Bubendort, Sveits 2.2 Utstyrliste Amersham TM HybondTM-ECL membran Applied Biosystems 7900HT PCR-maskin Ge Healthcare, Buckinghamshire, UK Life Technologies, USA BioHit Optifit tip pipettespisser 10, 200,1000μl Sartorius BioHit Liquid Handling, Finland ECL Semi-dry blotters (blottemaskin) Class II type A2-LAF-benk Corning 15 ml Sentrifugerør (430791) Amersham Biosciences, UK ESCO, Singapore Corning Incorporated, NY, USA Corning 50 ml Sentrifugerør (430829) Corning 50 ml Sentrifugerør (430921) Corning 75 cm2 celleflaske (3276) 16

Corning 96-brønnersbrett (3598) Corning Incorporated, NY, USA Costar 6-brønnersbrett (3506) Costar 5 ml pipette (4051) Costar 10 ml pipette (4101) Costar 25 ml pipette (4251) Countess automated cell counter Dri-Block DB-2A Heraeus Fresco 21 Centrifuge Holten LaminAir LAF-benk Inkubatorskap Galaxy 170 S Molecular Imager ChemiDocTM XRS+ With Image LabTM Nunc 96-brønners Mikrotiterplate Olympus CKX41 Mikroskop Stratagene MX 3005 p instrument SUB Aqua 12 Vannbad The Belly Dancer Universal 32 R Sentrifuge Wallac 1420 Victor3 Multilabel Counter, Mikroplateleser XCell SureLock TM Electrophoresis Cell Invitrogen, Life Technologies, CA, USA Techne, Cambridge, UK Thermo scientific,usa Medinor, Oslo, Norge Eppendorf, Connecticut, USA Bio-Rad Laboratories Inc., California, USA Nunc, Roskilde, Danmark Olympus, Tokyo, Japan Quanta Biosciences, Gaithersburg, USA Grant, Cambridge, UK Stovall Life Science Greensboro, NC, USA Hettich Zentrifugen, Tuttlingen, Tyskland Perkin Elmer, USA Life Technologies, Boston, MA,USA 17

2.3 Celledyrking 2.3.1 THP-1 celler I dette arbeidet ble det benyttet THP-1 celler fra American Type Culture Collection (ATCC TIB-202, LGC Promochem, Rockville, MD, USA). Dette er en human monocyttlignende cellelinje, isolert fra en ett år gammel gutt med akutt monocyttisk leukemi [77]. Ved stimulering med det syntetiske stoffet forbol 12-myristat 13-acetat (PMA), differensierer THP-1 celler til adherente makrofaglignende celler. 2.3.2 Tining av THP-1 celler Cellene ble tatt ut fra nitrogentanken og tint opp ved forsiktig omvending i vannbad ved 37 C i cirka 40-60 sekunder, til det var en liten isklump igjen. Cellebeholderen ble dreid kontinuerlig under opptiningen, og deretter desinfisert med 70 % etanol. Ni ml av THP-1 dyrkningsmedium (se 2.3.3) ble overført til en Corning 75 cm² dyrkningsflaske, og 1 ml av det opptinte cellematerialet ble tilsatt flasken. Cellene ble dyrket over natt ved 37 C og 5 % CO 2, før de ble overført til et 15 ml rør og sentrifugert ved 800 rpm i 5 minutter. Supernatanten ble sugd av, cellepeletten ble resuspendert i 10 ml nytt medium og cellesuspensjonen ble overført til en ny dyrkningsflaske. 2.3.3 Dyrking, splitting og telling av celler Det ble tilsatt nytt medium (10 ml ) hver 3.- 4. dag. Dyrkningsmediet som ble benyttet til dyrking av THP-1 celler bestod av : RPMI 1640 medium med 2 mm L-glutamin og 1,5 g/l natriumbikarbonat 4,5 g/l glukose 10 % føtalt kalveserum (FBS) 10 mm Hepes 1 mm natriumpyruvat 0,05 mm 2-Mercaptoetanol 18

Penicillin (100 U/ml)-Streptomycin (100 µg/ml) 2,5 µg/ml Fungizone (Amphoterricin) Cellene ble splittet en gang i uken, eller når konsentrasjonen i flasken nærmet seg 1 x 10 6 celler/ml. Det ble tilsatt 1 x 10 6 celler til en flaske med nytt THP-1 medium til et totalvolum på 10 ml. Alt arbeid med celler ble utført aseptisk i LAF-benk med vertikal laminær luftstrøm for å hindre mikrobiell kontaminering av cellekulturene. Cellekonsentrasjon i flasken ble målt ved at 10 µl av cellesuspensjon ble blandet med 10 µl 0,4 % tryptanblått. Deretter ble 10 µl av blandingen overført til et tellekammer for automatisk telling ved hjelp av Countess celleteller. Resulatet ble angitt som antall levende celler, antall døde celler, total antall celler og % viabilitet. 2.3.4 Tillaging av glukose-oppløsninger En stamløsning med glukose (555 mm) ble fortynnet med RPMI 1640 uten glukose til ønsket glukosekonsentrasjon. RPMI 1640 medium uten glukose inneholder de samme substansene som THP-1 dyrkningsmedium som ble beskrevet over, unntatt glukose (0 mm). Følgende glukosekonsentrasjoner ble brukt i forsøkene : 2,5 (hypoglykemi), 5,5 (normoglykemi), 7,5, 11 og 25 (hyperglykemi) mm. 19

2.4 Celleforsøk 2.4.1 Celleforsøk til måling av mrna ekspresjon av legumain og cathepsiner i PMA-stimulerte THP-1 celler ved ulike glukosekonsentrasjoner Ut fra antall levende celler per ml, ble mengde cellesuspensjon og utsåingsmedium (THP-1 medium) beregnet. Til forsøk ble 1 x 10 6 celler i 2 ml THP-1 dyrkningsmedium sådd ut i Costar 6-brønners brett. PMA (62 ng/ml) ble tilsatt hver brønn, og cellene ble inkubert ved 37 C og 5 % CO 2 i 72 timer slik at THP-1 cellene ble adherente. Alle brønnene ble inspisert for adherens. Deretter ble medium fjernet, og hver brønn ble vasket forsiktig med 1 ml RPMI 1640 medium uten glukose. Nytt dyrkningsmedium (RPMI uten glukose) ble tilsatt med ulike innhold av glukose (0, 2,5, 5,5 og 11 mm), etterfulgt av inkubering i 6 eller 78 timer. Mediet ble avpipettert og frosset (-80 C) til senere analyse av total legumainkonsentrasjon ved hjelp av ELISA (se 2.9). Cellene ble deretter høstet og lysert. Adherente celler ble vasket 2 ganger forsiktig med 1 ml steril PBS (se appendiks, løsninger), før de ble lysert med 400 µl Perfectpure lysisbuffer (Perfectpure RNA Cultured Cell Kit). Brettene ble så frosset ved -80 C for senere Real Time PCR analyse (se 2.10). 2.4.2 Celleforsøk i brett til måling av totalprotein, enzymaktivitet og Western i PMA-stimulerte THP-1 celler THP-1 celler ble sådd ut i 6-brønners brett, 5 x 10 5 celler per brønn, og stimulert med 62 ng/ml PMA i 72 timer ved 37 C og 5 % CO 2. Deretter ble brønnene inspisert for adherens, mediet fjernet og cellene vasket forsiktig med 1 ml THP-1 medium uten glukose. Nytt medium med ulike glukosekonsentrasjoner (0, 2,5, 5,5, 7,5, 11 og 25 mm) ble tilsatt. Cellene ble inkubert i 72 timer, før medium ble byttet med nytt medium med samme glukosekonsentrasjon. Cellene ble inkubert i nye 72 timer før høsting og analyse. Medium ble sugd av og kastet, og adherente celler ble vasket forsiktig med 1 ml steril PBS. Til hver brønn ble det tilsatt 0,5 ml legumain lysisbuffer (se appendiks, løsninger), og cellelysatene ble overført til eppendorfrør. Lysatene ble frosset (-70 C) og tint (30 C) tre ganger, og deretter sentrifugert ved 10 000 G og 4 C i fem minutter. Cellelysatene fra disse forsøkene ble brukt til måling av totalprotein (se 2.6), enzymaktivitet (se 2.7) og Western blotting (se 2.8). 20

2.4.3 Celleforsøk i flasker til måling av totalprotein, legumainaktivitet, Western og ELISA i PMA-stimulerte THP-1 celler Til forsøk ble 5 x 10 6 THP-1 celler sådd ut per flaske (Corning 75 cm²) med 10 ml THP-1 dyrkningsmedium. Cellene ble stimulert med 62 ng/ml PMA og inkubert ved 37 C og 5 % CO 2 i 72 timer. Etter stimulering i 72 timer, ble flaskene vasket med 4 ml medium uten glukose før nytt medium med følgende glukosekonsentrasjoner ble tilsatt : 0, 2,5, 5,5, 11 og 25 mm. Etter 72 timer ble medium fjernet, og nytt medium med de samme glukosekonsentrasjoner som før ble tilsatt. Etter enda 72 timer, ble medium avpippetert og oppbevart nedfrosset i 15 ml rør til senere konsentrasjonsanalyse av legumain ved ELISA (2.9). Cellene ble vasket med 5 ml PBS før de ble lysert i 1,5 ml lysisbuffer og overført til eppendorfrør. Videre behandling av lysatene ble utført slik beskrevet i celleforsøkene i brett (2.4.2). Lysatene ble brukt til måling av totalprotein, enzymaktivitet og Western blotting. 2.5 Pasientmateriale Plasmaprøver fra både friske frivillige (n= 92) og pasienter som har påvist karotisplakk (n= 256 ) ble mottatt fra Institutt for indremedisinsk forskning, OUS (godkjent av den regionale komiteen for medisinsk og helsefaglig forskningsetikk, ref S-0923a 2009/6065). Karotis plasmaprøver ble klassifisert som henholdsvis asymptomatiske eller symptomatiske basert på forekomst eller fravær av symptomer i 1, 2 eller 6 måneder før operasjon. Alle plasmaprøvene ble analysert for innhold av legumain ved hjelp av ELISA (2.9). 2.6 Totalproteinmåling Måling av totalprotein i cellelysat ble utført i henhold til en etablert prosedyre beskrevet av Bradford [78]. Prinsippet for bestemmelse av totalproteinmengden er basert på tilsetning av ˮBio-Rad Protein Assay Dye Reagent Concentrateˮ. Reagenset inneholder fargestoffet ˮComassie Brilliant Blue G-250ˮ, som bindes til proteiner i surt miljø. Når fargestoffet bindes til proteiner oppstår en fargeendring fra rødbrunt til blått, og dermed endres absorbansmaksimum fra 465 til 595 nm. Albumin fortynnet i lysisbuffer (se appendiks, løsninger) ble brukt som proteinstandard i konsentrasjonsområdet 0-400 μg/ml. Det ble tilsatt 10 μl av standard eller prøve som duplikater i en Nunc 96-brønners mikrotitreplate. Deretter ble alle brønnene tilsatt 200 μl 21

fargereagens som ble fortynnet med destillert vann i forholdet 1:5 (se appendiks, løsninger). Platen ble inkubert i 5 minutter før absorbansen ble målt i mikroplateleseren (Wallac 1420 Victor 3 Multilabel counter) ved 25 C og bølgelengde 595 nm. 2.7 Enzymaktivitetsmåling 2.7.1 Legumainaktivitet Metoden for måling av legumainaktivitet er beskrevet i Chen et al. [28] og Johansen et al. [79], og baserer seg på økning av fluorescens over en bestemt tid, som et resultat av et spaltet substrat. Prøven som inneholder legumain fortynnes i legumain-ˮassaybufferˮ (se appendiks, løsninger). Denne bufferen inneholder et syntetisk reduksjonsmiddel DTT (ditiotreitol) som gjør at cysteinproteasene blir aktive. Det tilsettes et fluorescerende peptidsubstrat Z-Ala-Ala- Asn-AMC (sluttkonsentrasjon 10 µm) som spaltes av legumain, og fører til dannelse av fritt AMC (7-amino-4-metylcoumarin) som avgir kraftig fluorescens. Økning i fluorescens ble målt over tid i mikroplateleseren. Lysatprøvene (20 μl) eller lysisbuffer (20 μl) ble tilsatt en svart Costar 96-brønners mikrotiterplate, og platen ble plassert i mikroplateleseren (Wallac 1420 Victor3 Multilabel counter). Lysisbuffer ble brukt som blindprøve, og alle prøvene ble analysert som triplikater. ˮLegumain-assaybufferˮ(100 μl) med 1 mm DTT ble tilsatt hver brønn automatisk ved hjelp av en injektor, og platen ble ristet i 10 sekunder. Etter tilsetning ble platen inkubert i 10 minutter ved 30 C for å sikre aktivering av enzymet. Deretter ble 50 μl substratløsning (se appendiks, løsninger) tilsatt rett før målingen. Fluorescens ble målt kinetisk ved 360 nm eksitasjon og 460 nm emisjon. Det ble utført 10 målinger i løpet av 60 minutter, og resultatet ble fremstilt som en økning i fluorescens per sekund ( F/s). Verdien fra blindprøven ble trukket fra alle målinger. Resultatene for enzymaktiviteten i prøvene ble korrigert i forhold til tilhørende totalproteinkonsentrasjon. Det er vist at det i THP-1 celler finnes andre enzymer enn legumain som splater substratet Z- Ala-Ala-Asn-AMC [45]. Derfor kaller vi aktiviteten som detekteres ved spaltning av Z-Ala- Ala-Asn-AMC for AEP-aktivitet. I noen forsøk ble det undersøkt effekt av inhibitorer på AEP-aktivitet i cellelysatene. Til dette ble det benyttet inhibitoren E-64 som hemmer cysteincathepsiner, og QDD-inhibitoren som spesifikt hemmer legumain. QDD-inhibitor er 22

nylig utviklet av Richard Williams (Queen s University Centre for Cancer Research and Cell Biologyfor, Belfast). Denne nye inhibitoren er fortsatt under patentprosessering, og det foreligger ingen publiserte litteratur. Inhibitorene (E-64 og QDD) ble fortynnet i vann til en konsentrasjon på 100 μm. Alle brønnene ble tilsatt 20 μl cellelysat samt 17 μl 100 µm E-64 eller QDD. Deretter ble det tilsatt 83 μl legumain-ˮassaybufferˮ. Til slutt ble 50 μl legumainsubstrat (34 μm) tilsatt, og enzymaktivitet ble målt. Kontrollprøver ble analysert samtidig ved å tilsette 17 μl vann i stedet for inhibitor. En legumainstandard ble analysert med og uten tilsetning av inhibitor for å kontrollere effekten av QDD-inhibitor. Aktivitet målt i kontrollprøvene viser total AEPaktivitet i fravær av inhibitorer. 2.7.2 Måling av cathepsin B-aktivitet Cathepsin B-aktivitet måles ved hjelp av et spesifikt fluorescerende substrat Z-Arg-Arg- AMC beskrevet av Werle et al.[80] og Barrett & Kirsche [81]. Ved spaltning av substratet på karboksylsiden av Arg-Arg, blir fluorescende AMC frigitt. Økning i fluorescens per sekund ble målt. Metoden for måling av cathepsin B bygger på samme prinsippet som overnevnte målemetode for legumain. Hver brønn ble tilsatt ˮcathepsin-B-assaybufferˮ med 8 mm DTT og cathepsin B-substratløsning til en sluttkonsentrasjon på 20 µm (se appendiks, løsninger), og økning i fluorescens ble målt. Det ble utført 10 målinger med inkubering 3 minutter mellom hver måling, ved en konstant temperatur på 30 C. 2.8 Western blotting Western blotting er en metode som benyttes i forskning for å detektere spesifikke proteiner ved hjelp av antistoffer etter separering ved gelelektroforese. Cellelysatene ble oppkonsentrert ved acetonfelling (appendiks), og løst i ˮLDS sample bufferˮ og DTT (appendiks) før koking. LDS og koking denaturerer proteinene og gir dem en uniform negativ ladning. Det ble tilsatt 10 μg totalprotein per brønn, og proteinene ble separert i en polyakrylamid gel (4-12 % Bis-Tris gel) som er plassert i et elektroforsekar med 800 ml elektroforesebuffer (appendiks) og 500 μl antioksidant. Elektroforesen går med 200 V 23

i 1 time og 25 minutter. En proteinstandard ble applisert i en av brønnene. Under elektroforesen vil proteinene vandre mot den positive elektroden, og separeres etter størrelse. Proteiner med lav molekylvekt vandrer lengst ned i gelen. Videre ble proteinene på gelen overført til en nitrocellulose membran, og blottet ved hjelp av en blottebuffer (appendiks) og en strømdrevet blottemaskin (32 ma per gel i cirka 1 time). Membranen ble deretter blokkert med Blotto (appendiks) for å unngå uspesifikke bindinger av antistoff til membranen, og så inkubert med primærantistoff ved 4 C over natt (tabell 2-1). Neste dag ble membranen inkubert med sekundærantistoff i 1 time og deretter med et ˮenhanced chemiluminescentˮ substrat (ECL) i 5 minutter, før den ble fremkalt ved bruk av Molecular Imager XRS+. Primærantistoffet er spesifikt for det proteinet vi ønsker å detektere, og sekundærantistoffet er spesifikt for primærantistoffet. Sekundærantistoffet er konjugert med enzymet horseradish peroxidase (HRP), som danner et fluorescerende kompleks når det binder seg til ˮSuperSignal West Dura Extended Duration substrateˮ, og kan detekteres av Molecular Imager ChemiDocTM XRS+. Molekylvekt på proteinbåndene ble gjenkjent ved hjelp av proteinstandard, Precision Plus Protein Dual Color Standards. Membranene ble strippet og tilsatt nytt primær- og sekundærantistoff, slik at både legumain, cathepsin B og housekeeping -kontroll (GAPDH) kunne detekteres innad i samme forsøk. Tabell 2-1: Primær- og sekundærantistoffer benyttet ved Western blotting Antistoffer Type Fortynning Geit anti-human polyklonalt antistoff mot legumain Primær 1:200 Geit anti-human polyklonalt antistoff mot cathepsin B Primær 1:2000 Geit anti-human polyklonalt antistoff mot cathepsin L Primær 1:200 Polyklonal kanin anti-geit immunoglobulin Sekundær 1:5000 2.9 ˮEnzyme-linked immunosorbent assay ˮ (ELISA) ELISA er en sensitiv immunologisk metode der man benytter spesifikke antistoffer mot ulike proteiner for å bestemme konsentrasjonen av disse molekylene i en biologisk prøve. Metoden 24