Fenotypiske metoder for påvisning av bakteriers følsomhet for antimikrobielle midler Martin Steinbakk, Avdeling for bakteriologi og infeksjonsimmunologi, Fhi
Klassiske metoder for resistensbestemmelse Fortynning Agar fortynning Buljong fortynning Disk diffusjon Ficks diffusjonslover
Antibiotikaresistens og resistensbestemmelse MIC Minimum inhibitory concentration MBC Minimum bactericidal concentration Agardiffusjon (hemningssone i mm) Resultatet tolkes som S, I eller R Sensitiv Midlet er aktivt ved vanlig dosering Intermediært følsom (el. usikkert resultat) Midlet er aktivt dersom det kan gis høye doser eller midlet konsentreres i infeksjonsfokus Resistent Midlet er ikke aktivt mot mikroben (i doser som tåles av vert)
Buljong fortynning 2-folds fortynning av antibiotikum MIC = 8 mg/l MBC =?? 0 0,25 0,5 1 2 4 8
Fortynningsmetoder 2-folds fortynning av antibiotikum Ab kons Vekst/Ikke vekst (mg/l) 32 Ingen vekst 8 Ingen vekst 4 Ingen vekst Mikrobedød (=MBC) 2 Ingen vekst MIC 1 Vekst 0,5 Vekst 0,25 Vekst 0 Vekstkontroll MBC definisjon: > 99,9% av mikrobene er døde
Broth microdilution using Mueller Hinton Broth medium is now ISO-standard ISO 20776-1 Ed. 1 Current stage 60.00TC 212 Clinical laboratory testing and in vitro diagnostic test systems Susceptibility testing of infectious agents and evaluation of performance of antimicrobial susceptibility test devices Part 1: Reference method for testing the in vitro activity of antimicrobial agents against rapidly growing aerobic bacteria involved in infectious diseases
MBC minimum bactericidal concentration Definisjon > 99,9% av bakteriene er døde (ved telling av cfu) eller < 0,1% (<1 av 1000 bakterier) overlever For et pålitelig resultat må inokulum være passe stort Vanlig volum ved mikrobuljongfortynning er 100 ul Inokulum 1.000 cfu/ml 10.000 cfu/ml 100.000 cfu/ml MBC ved (<0,1 cfu i 100 ul) (<1 cfu i 100 ul) (<10 cfu i 100 ul)
MBC Inokulum (cfu/ml) Antall bakterier Ant bakterier Ved 99,9% drap er det antall levende cfu i 100 µl per ml per 100 µl 10**3 10**4 10**5 10**6 1000 100 <0,1 10 000 1000 <1 100 000 10 000 <10 1 000 000 100 000 <100
Noen andre begreper knyttet til resistensbestemmelse MMPC Minimum Mutation Prevention Concentration MBEC minimum biofilm eradication concentration
Susceptibility testing
Agar dilution 0,5 32 mg/l concentrations
Disc diffusion slide show version 4.0
From BSAC Methods for Antimicrobial Susceptibility Testing. Jan 2006
Sammenhengen mellom mm og MIC Fick s diffusjonslov (2 viktige elementer) Diffusjonskonstanten for et middel bestemmes av midlets molekylstørrelse og mediets viskositet Temperatur Dannelse av hemningssone IC (inhibitory concentration) Kritisk tid (avhengig av inokulat og veksthastighet) Antibiotikakonsentrasjonen i agaren er omvendt proporsjonal med kvadratet av avstand fra diffusjonssentrum. For de fleste mikrober og antibiotika finnes det en IC som akkurat hemmer veksten og her vil hemningssonen dannes.
FADL s forlag Bakteriologisk eundersgelsesmetoder 1979 http://dskm.dk/publikationer-2/
Relasjon mellom antibiotikakonsentrasjon, avstand fra diffusjonssenter og tid
C0 = konsentrasjon i depot ved diffusjonsstart Cc = kritisk konsentrasjon (MIC) T = kritisk tid R = avstand fra sentrum til sted hvor Cc befinner seg til tiden T (hemninssonenes radius) r = depotets radius (lappe-radius) D = diffusjonskonstanten e = naturlige logaritmes grunntall (2,718; log e= 0,4343)
25 20 E.coli and ciprofloxacin in ECO SENS The tentative epidemiological breakpoint Canada 25 20 Sweden 15 15 10 10 5 5 0 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70 0 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70 25 20 Spain 25 20 E.coli ATCC 25933 vs Ciprofloxacin 10 µg 15 15 10 10 5 5 0 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70 0 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70
http://www.eucast.org/fileadmin/src/media/pdfs/eucast_files/disk_test_documents/slide_show_v_5.0_eucas T_Disk_Test.pdf
http://www.eucast.org/ast_of_bacteria/warnings/ http://www.eucast.org/fileadmin/src/media/pdfs/eucast_files/disk_test_documents/warnings/summary_evaluati on_of_selected_disks_from_nine_manufacturers_update_june_2016.pdf
Fenotypisk påvisning av resistensmekanisme Påvisning av resistensmarkør Betalaktamase-tester Cefoxitin 30 ug Bruk av markørantibiotika for å påvise resistens eller fravær av resistens (noen eksempler) Penicillinfølsomhet hos pneumokokker (oxa 1) Beta-laktamresistens hos H. influenzae (Pg 1 unit, cefaclor 30 ug) Kinolon-resistens hos enterobakterier (nalidixin 30 ug) Plukker opp gyrase-endring, men ikke andre mekanismer FQ-resistens hos S. typhi Påvisning av resistensprotein meca Påvisning av resistensgen rpob, katg, inh Molekylære metoder fortsatt under utvikling og validering Ulike PCR-metoder, hel-genom sekvensering
Benzylpenicillin (penicillin G) og Fenoxymetylpenicillin (peniclllin V) Pen G Pen V
Penicillinase åpner beta-laktam-ring med sluttresultat dannelse av penicilloan-syre
Acidometrisk metode Bilde fra Yngvar Tveten
Nitrocefin test Bilde fra Yngvar Tveten
Kløverblad Bilde fra Yngvar Tveten
Stafylokokker H. influenzae M. catarrhalis N. gonorrhoeae Aktuelle bakterier Bacteroides spp. Bacillus spp. Enterokokker Stabilt derepressert Enterobacter cloacae
Forekomst betalaktamaseprod. S. aureus (70?) 80-90% (>90%?) H. influenzae 10-15% N. gonorrhoeae 20-30% (>50%?) M. catarrhalis >90% (100%?) Enterokokker Meget sjelden Bacteroides fragilis >95% Andre Bacteroides sjelden Bacillus spp. 100%?
Kløverbladmetoden Suspensjon av penicillin følsom stamme (indikatorstamme) Tørkes Teststammen sås ut i et kryss og en lapp med benxylpenicillin legges i midten Inkuberes over natt Ved betalaktamase prod. vil teststammen bryte ned penicillin og indikatorstammen vokser langs teststammen inn mot pc-lappen
Acidometrisk metode Vannagar tilsatt benzylpenicillin og fenolrødt (indikator) Stort inokulum Inkuberes i 1 t ved 37 0 C Penicillin omdannes til penicillinoinsyre, ph faller og indikatoren slår om fra rødt til gult
Nitrocefin-test Lapp med nitrocefin (cefinase ) (kromogent cefalosporin) legges direkte på kolonier i randen av en hemningssone, f.eks. rundt oxacillin Betalaktamase bryter ned cefalosporinet og fargen endres fra gult til rødt, vanligvis i løpet av 10 min. Kan også utføres i buljongkultur eller i bakterioppslemming i fysiologisk saltvann Falsk positiv reaksjon kan forekomme på medier som inneholder serum eller blod eller andre sure metabolske produkter
Sammenligning av ulike metoder for å påvise betalaktamase-positivitet hos S. aureus
blaz reference method
Strain collection MHG Massachussets General Hospital N= 199, CDC N= 62, Aalborg University Hospital N=87
blaz vs cefinase
blaz vs zone edge
BlaZ vs clover leaf
Konklusjon Nitrocefin (Cefinase) er suboptimal og bør utgå falskt negative resultater (sensitivitet 80-90%) Kløverbladtesten fungerer godt kan brukes til å bekrefte β-laktamaseproduksjon Sonekantens utseende og sonens størrelse kan med stor sikkerhet si om isolatet produserer β- laktamase
Sensitive screening-metoder for å påvise resistens Spesielle testsubstanser Oxacillin 1ug er en sensitiv pneumokokker Nalidixinsyre påviser flurokinolon-resistens på bakgrunn av gyrase-endring Grupperepresentative antibiotika predikerer følsomhet for andre midler i gruppen Tetracykliner Erytromycin (makrolider)
Grupperepresentative midler Grupperepresentative antibiotika predikerer følsomhet for andre midler i gruppen Tetracyklinfølsomhet predikerer følsomhet for alle tetracykliner og glycylcyklin, men ikke nødvendigvis resistens til de andre midlene Erytromycinfølsomhet predikerer følsomhet for alle makrolider (og (nesten alltid) linkosamider) men ikke nødvendigvis resistens til de andre midlene
Påvisning av protein assosiert med resistens MRSA meca (agglutinasjonstest) Tar 10-15 min (ferske kolonier (< 24 t) på blodagar) Koker suspensjon Agglutinerer (positiv (og negativ) kontroll)
Påvisning av resistensgen - Ikke fenotypi rpob-gen og andre resistensgener f.eks. hos M. tuberculosis (katg, inh) M. tuberculosis og rifampicinresistens PCR Kommersielle kit Andre blot-assays
Resistensbestemmelse Utføres på en mikrobepopulasjon Er et dynamisk system Resultatene er uttrykk for samspill mellom antibiotikum og mikrober i et definert testsystem Gjentatte oppsett gir litt varierende resultat Biologisk variabilitet i bakteriepopulasjonene samt «system»-variasjon
25 20 E.coli and ciprofloxacin in ECO SENS The tentative epidemiological breakpoint Canada 25 20 Sweden 15 15 10 10 5 5 0 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70 0 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70 25 20 Spain 25 20 E.coli ATCC 25933 vs Ciprofloxacin 10 µg 15 15 10 10 5 5 0 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70 0 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70
Nye metoder Kombinasjon av flere metoder Tradisjonell fenotypi (sonestørrelse, MIC) Biokjemisk bestemmelse av nedbrytning av aktivt antibiotikum F. eks. kan karbapenem-aktivitet kan måles i løpet av 3 timer ved maldi-tof Måling av «vital-molekyler» hos mikroben eller levende mikrobers evne til omsetning av bestemte «spor-stoff» (f. eks vitalfarger)
Forskjell på mikrobiologisk og klinisk (farmakologisk) resistens
Mikrobiell resistens Mikrobe ødelegger antibiotikum enzymer som beta-laktamase Mikrobe endrer målorgan for antibiotkum Penicillin-bindende proteiner Mikrobe tetter igjen cellevegg endrede poriner Mikrobe pumper antibiotikum ut effluks
Mikrobiell resistens - 2 Mikrobens «miljø» Biofilm Dvale-tilstand Small colony variants Vertsfaktorer Fremmedlegeme Andre faktorer (CAPD m.m.)
Antibiotkaresistens - Seleksjon Opprinnelig bakteriepopulasjon Bakterie med mutasjon overlever Resistente bakterier er selektert Følsomme mikrober Resistent mikrobe Antibiotikabehandling
Man kan ikke alltid stole på resultat av resistensbestemmelse (jfr Expert rules) Blood cultures Klebsiella spp 2002 (n=352) S R Klebsiella har kromosomal klasse A bla og er resistente for Ampicillin M Steinbakk 2012 59