Erfaringer med LC/MS i kliniske studier Katja B Prestø Elgstøen OUS Rikshospitalet 27 mai 2010
1. medfødte stoffskiftesykdommer 1. generelt om metodeutvikling og LCMS 2. eksempler på applikasjoner 3. sluttbemerkninger
Medfødt stoffskiftesykdom DNA RNA enz 1 enz 2 enz 3 enz 4 enz 5 A B C D E F X Y patologiske metabolitter
Laboratoriediagnostikk av medfødte stoffskiftesykdommer (IEM) På 3 nivåer: På metabolittnivå trenger ikke å vite hva vi ser etter På enzymnivå På DNA-nivå må vite hva vi ser etter Seksjon for biokjemisk genetikk (SBG), Avd. for medisinsk biokjemi ved OUS Rikshospitalet har landsfunksjon for laboratorieutredning av IEM. Vi utreder omkring 2000 pasienter årlig og diagnostiserer omkring 200 ulike sykdommer.
Metabolsk screening - multikomponentanalyse F A B C D E normal A B C D E F X Y patologisk Kan starte behandling basert på laboratoriefunn
Generelt ved bruk av eller utvikling av LC-MSMS metoder Tenk gjennom : hvorfor LC-MS? analyttens egenskaper samt konsentrasjon prøvematriks egenskaper dine egenskaper! Hva er du god på? mye prøveopparbeidelse vs mye kromatografi vs mye MSMS fancy analytisk kjemi ikke alltid like robust..
hvorfor LC-MS? molekylvekt electrospray LC-MSMS EI GC-MS Ikke-polar polar
hvorfor trippel quadrupol? ionekilde Q 1 Q2 Q3 detektor molekylion fragmention Q hvorfor MSMS: A-B-C-D A-C-B-D samme mw QQQ A-B C-D A-C B-D ulik fragmentering
molekylion LC-MS positiv ionisering typisk MH+ ved m/z mw +1 negativ ionisering typisk M at m/z mw -1 ADDUKTER Adduct ion Kilde m/z av adduct [M + COOH] - format M + 45 [M + CH3COO] - eddiksyre M + 59 [M + Cl] - klorinerte løsemiddel M + 35 [M + NH4] + ammonia M + 18 [M + Na] + Na-salter / glass M + 23 [M + K]+ K salter M + 39 [M + CH3CNH] + acetonitril M + 42 [M + CH3OHH] + metanol M + 33
Fragmentering Et molekyls fragmenteringsmønster er dets fingeravtrykk og er uavhengig av prøvematriks. Fragmenteringsmønster er vanskelig å prediktere. benyttes ofte i kvantitativ analyse, for eksempel MRM, precursor ion scan. O O CH 3 CH 2 CH 2 CH 2 O C C O CH 2 CH 2 CH 2 CH 3 kun fragment som bærer ladning detekteres NH 2 CH 2 -C CH 2 -CH 3
Utvikle en kvantitativ LC-MSMS metode 1. Q1 scan, finne molekylion 2. Product Ion Scan av referansestoff Q1 Q2 Q3 40 180 185 Intensitet (cps) 56 75 180 M Finner fragmentene til molekylionet Q1 låst på molekylionet (precursor) Q2 = kollisjonscelle Q3 skanner produktene Finner produktionet som gir høyest intensitet 40 m/z 110 Produktene av 180
3. Multiple Reaction Monitoring MRM Q1 Q2 Q3 180 75 Intensitet (cps) 180-75 Q1 låst på molekylionet (precursor) Q2 = kollisjonscelle Q3 låst på produktion Optimaliserer alle MSMS parametere. tid
Precursor Ion Scan Q1 Q2 Q3 100 75 250 Intensitet (cps) 170 220 Finner hvilke molekylioner som gir ett bestemt fragment. Q1 scanner (precursor) Q2 = kollisjonscelle Q3 låst på ett produkt Brukes for klasse spesifikk analyse ( f.eks acylkarnitiner ) 100 m/z 250
Utvikle eller sette opp en LC-MSMS metode MSMS-metoden er nå klar, basert på rent referansestoff. Metoden skal fungere for reell prøve. Behov for prøveopparbeidelse? Hva vil vi bli kvitt? Behov for kromatografi? Finnes det interferenser som ikke lar seg fjerne med prøveopparbeidelse? Hvordan vet vi det? ser ingenting er det dannet adducter?
Eksempel på applikasjon A Kvantitering av acylcarnitiner i plasma : plasma + IS + acetonitril for felling av proteiner sentrifuger, avpippeter dampe inn til tørrhet derivatiserer til butylestere dampe inn til tørrhet ingen kromatografi direkte MSMS
Tandem MS, klassespesifikk analyse av acylcarnitiner CH 3 H O H 3 C N CH 2 C C CH 3 O O C O CH 2 -CH 2 -CH 2 -CH 3 CH 3 CH 3 C2 C3 C2D 3 IS C3D 3 IS isotopmerket internstandard CH 3 CH 3 CH 3 CH 3 CH2 CH CH COOH m/z 85 C4 C5 C6 C7 C4D 3 IS C6D 3 IS
Multiple Reaction Monitoring av acylcarnitiner Q1 Q2 Q3 C2 260,6 85,0 C16-OH 472,4 85,0 acylcarnitine
MRM av acylcarnitiner
Hvorfor MRM? bedre sensitivitet, bruker ikke tid på å scanne uinteressante m/z enkelt å tolke, enkelt å behandle data Hvorfor ikke MRM? med MRM ser vi kun det vi har bedt om å få se (det man ikke ser kan man få vondt av!)
Precursor Ion Scan av acylcarnitiner Q1 Q2 Q3 C2 260,6 85,0 C16-OH 472,4 85,0 acylcarnitine
6.9e4 6.5e4 6.0e4 acylcarnitinprofil, precursors av 85 normal C2 IS 263.4 459.6 C16 IS 5.5e4 5.0e4 4.5e4 4.0e4 3.5e4 3.0e4 2.5e4 2.0e4 C0 218.4 347.4 C2 260.4 C3 IS 277.4 C4 IS 291.6 C8 IS C12 IS 403.6 1.5e4 372.6 1.0e4 C3 456.6 5000.0 274.2 288.2 344.2 400.2 200.0 302.4 370.2 414.6 447.4 482.6 0.0 200 220 240 260 280 300 320 340 360 380 400 420 440 460 480 500 m/z, amu 431.4
1.4e5 acylcarnitinprofil, precursors av 85 274.4 propionsyreemi 1.3e5 1.2e5 1.1e5 C3 1.0e5 9.0e4 C0 218.4 8.0e4 7.0e4 6.0e4 5.0e4 4.0e4 C2 260.4 3.0e4 2.0e4 C2 IS 263.6 C3-IS C4 IS C8 IS C12 IS C16 IS 1.0e4 347.4 403.6 277.4 291.6 200.4 215.4 431.8 0.0 200 220 240 260 280 300 320 340 360 380 400 420 440 460 480 500 m/z, amu 459.6
Acylcarnitiner, oppsummert : Selektiviteten i MSMS-metoden for butylesterne er meget god. God kjennskap til interferenser. Kun proteinfelling derivatisering direkte MSMS uten kromatografi. MRM for kvantitering, Precursor Ion Scan for acylcarnitinprofil.
Hvorfor kromatografi? for å unngå interferenser fra andre stoffer med samme m/z for å minske ionesuppresjon og med det øke følsomheten.
kompleks prøve HPLC total ion chromatogram tid 287 287 Q1 m/z MSMS Q2 287 287 Q3 57 86 187 57 86 187 m/z
Eksempel på applikasjon B Kvantitering av metylmalonsyre i plasma : plasma + IS fast fase ekstraksjon, sterk anionbytter dampe inn til tørrhet derivatiserer til butylestere dampe inn til tørrhet løs i mobilfase omvendt fase kromatografi positiv MSMS med MRM
LC-MSMS av plasma, MRM 231-119 og 233-121 metylmalonsyre IS ravsyre metylmalonsyre
Hvorfor fast fase ekstraksjon? gir grundigere opprensing av prøve enn proteinfelling og medfører at prøven som injiseres er mindre kompleks. bra for kromatografiske kolonner! økt levetid.
fast fase ekstraksjon 1. load 2. vask SAX prøve 4. opprenset prøve 3. eluer
Metylmalonsyre, oppsummert : Derivatisering gir god følsomhet, fast fase ekstraksjon gir meget robust analyse. Ravsyre har samme mw som metylmalonsyre og gir samme fragmentering (samme MRM). Må ha kromatografi. Fast fase ekstraksjon derivatisering omvendt fase kromatografi, positiv MRM for kvantitering.
Eksempel på applikasjon C LC-MSMS av puriner og pyrimidiner i urin puriner pyrimidiner thymine uracil
Kvantitering av puriner og pyrimidiner i urin : mål kreatinin med standard klinisk kjemi (nedbrytningsprodukt av kreatinfosfat i muskel) fortynn til kreatinin på 1 mmol/l og tilsett IS omvendt fase kromatografi (lang kolonne) gradient negativ MSMS med MRM Mobilfase A: 50mM eddiksyre ph4,0 Mobilfase B: 50mM ammonium format ph5,0/meoh/acn (2:1:1)
pyrimidiner : Metabolitt MW Produkt/Fragment-ion RT minutter Anvendt internstandard uracil 112,1 111/42 3,2 uracil IS uracil int.std. 114,1 113/43 3,2 thymin 126,1 125/42 4,4 thymin IS thymin int. std. 130,1 129/42 4,4 adenin 135,1 134/107 6,4 adenin IS adenin int.std. * Q1 136,1 135/108 6,4 hypoxantin * Q1 136,1 135/92 3,7 hypoxantin IS hypoxantin int.std. * Q1 138,1 137/93 3,7 xantin 152,1 151/108 3,8 xantin IS xantin int.std. 154,1 153/109 3,8 orotsyre 156,1 155/111 2,5 uracil IS N-carbamyl-β-alanin 132,1 131/88 2,6 N-carb.-β-alanin IS N-carb.-β-alanin int.std * Q1 138,1 137/89 2,6
puriner : Metabolitt *mw og MRM MW Produkt/Fragment-ion RT minutter Anvendt internstandard thymidin 242,2 287/241 5,9 thymin IS pseudouridin * MRM 244,1 289/243 2,7 uracil IS uridin * MRM 244,2 289/243 3,3 uracil IS deoxyadenosin 251,2 296/45 8,6 adenosin IS deoxyinosin 252,2 297/251 4,9 adenin IS deoxyguanosin * MRM 267,2 312/266 5,5 adenin IS adenosin * MRM 267,2 312/266 7,5 adenosin IS adenosin int.std. 268,2 313/267 7,5 inosin 268,2 267/135 4,1 adenin IS guanosin 283,2 328/282 4,4 adenosin IS
Puriner XIC of -MRM og (21 pairs): pyrimidiner 111.1/42.0 amu from i Sample urin 17 (20051969 F*8) of 061205.wiff LC-MSMS negativ Max. 1370.0 cps. ionisering. 1.10e4 1.00e4 9000.00 8000.00 7000.00 6000.00 5000.00 4000.00 3000.00 2000.00 1000.00 3.31 0.00 1 2 3 4 5 6 7 8 9 Time, min
1.00e4 9000.00 8000.00 7000.00 6000.00 5000.00 4000.00 3000.00 2000.00 1000.00 3.31 0.00 1 2 3 4 5 6 7 8 9 Time, min 1500.00 1000.00 500.00 0.00 1 2 3 4 5 6 7 8 9 Time, min XIC of -MRM (21 pairs): 137.0/93.0 amu from Sample 17 (20051969 F*8) of 061205.wiff 3.82 2.0e4 1.9e4 1.8e4 1.7e4 XIC of -MRM (21 pairs): 151.0/108.0 amu from Sample 17 (20051969 F*8) of 061205.wiff Max. 7210.0 cps. XIC of -MRM(21 pairs): 153.0/109.0 amu from Sample 17 (20051969 F*8) of 061205.wiff Max. 1.1e4 cps. 1.6e4 3.90 1.5e4 7210 3.90 1.05e4 7000 1.4e4 1.00e4 6500 151-108 1.3e4 9500.00 153-109 137-93 9000.00 1.2e4 6000 8500.00 1.1e4 5500 1.0e4 xantin 8000.00 xantin IS hypoxantin IS 5000 7500.00 9000.0 7000.00 8000.0 4500 6500.00 7000.0 4000 6000.00 6000.0 5500.00 3500 5000.0 5000.00 4000.0 3.31 3000 4500.00 3000.0 2500 4000.00 2000.0 9.96 3500.00 1000.0 2000 3000.00 0.0 1500 2500.00 1 2 3 4 5 6 7 8 9 2000.00 Time, min 1000 500 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 Time, min 5.22 ekstrahert 6.95 Max. 2.0e4 cps.
Puriner og pyrimidiner i urin, oppsummert : Urin langt enklere prøvematriks enn plasma kun fortynning nødvendig. Negativ ionisering gir god nok følsomhet i urin. Kromatografi nødvendig da flere stoffer har samme MRM Måler overgang fra format-adduct til molekylion for purinene. Mål kreatinin fortynn i hht kreatininverdi omvendt fase kromatografi med format i mobilfase - negativ MRM for kvantitering.
Sluttbemerkninger LC-MS generelt om prøvematriks : blod/plasma/serum : mye proteiner som må fjernes. Lav konsentrasjon av analytt. urin : høy ionestyrke som må reduseres. Høy konsentrasjon av analytt og interferenser. generelt om tubinger/kolonner osv: ha egne overganger/tubinger/kolonner for hver applikasjon hvis mulig. lag gode loggsystemer, spesielt hvis flere brukere. vurder helheten ved oppgradering/endring av metoder.
Sluttbemerkninger LC-MS om du setter opp en publisert metode : forstå din analysemetode, hva skjer ved hvert trinn og hvorfor. om du utvikler metoden selv : heller for omfattende enn for lettvint til du har grundig kunnskap og oversikt over interferenser. sjekk robusthet av metoden bruk eksterne kvalitetskontroller i tillegg til egne. en metode er aldri ferdig validert.