Hva er kromatografi?

Hva er kromatografi? Adsorpsjonskromatografi, LSC. Løste stoff er i likevekt mellom mobilfasen og overflaten av stasjonærfasen. (Denne type kromatografi har vi tført på organisk lab. Vi brkte TLC plater med silika som stasjonærfase og forskjellige organisk løsningsmidler som mobilfase.) Fordelingskromatografi Løste stoff er i likevekt mellom mobilfasen og en væskefilm bndet til stasjonærfasen Ionebytterkromatografi Ioner i mobilfasen tilekkes motion kovalent bndet til en stasjonærfase. Eksklsjonskromatografi Løste stoff, med forskjellig størrelse, vil i forskjellig grad gå inn i stasjonærfasen. De største løste stoffene eleres først. http://sers.rcn.com/jkimball.ma.lanet/biologypages/e/eclsionchrom.html Affinitetskromatografi. Forbindelser i mobilfasen tilekkes spesifikke grpper kovalent bndet til en stasjonærfase. (Denne type kromatografi tføres ofte i biokjemilaboratorier.) http://sers.rcn.com/jkimball.ma.lanet/biologypages/a/affinitychrom.html Elering er den prosessen der løste stoff vaskes gjennom stasjonærfasen p. g. a. bevegelse av mobilfasen. Mobilfasen i kromatografi er den fasen som beveger seg over eller gjennom stasjonærfasen og bærer med seg analytten. Stasjonærfasen i kromatografi er den fasen som er fast enten i en kolonne eller på en plan overflate. 1

Kromatogrammet. Retensjonstid, t r, for en komponent er tiden fra injeksjon til maksimm av båndet for komponenten når detektoren. Ikke retardert mobilfase går gjennom kolonnen i løpet av tiden t m. Korrigert retensjonstid, t r ', er den tiden en komponent brker for å gå gjennom kolonnen frakket tiden mobilfasen brker gjennom kolonnen. t r ' t r - t m. Partisjonskoeffisienten, K, for en komponent er lik forholdet mellom konsenasjonen i to forskjellige faser f. eks. forholdet mellom konsenasjonen i stasjonærfasen og konsenasjonen i mobilfasen. Kapasitetsfaktor, k', (IUPACs anbefaling er retensjonsfaktor, k.) tm ns CsVs Vs k ' K t m nm CmVm Vm Relativ retensjon, α, ( separasjonsfaktor) α t' t' r r1 k' k' 1 K K 1 der t r ' > t r1 ' slik at α alltid er større enn 1. Volmeisk hastighet, V, er hastighet målt som volm per tidsenhet. Retensjonsvolm, V r er volmet av mobilfase som er nødvendig for å elere en spesiell komponent fra kolonnen. V r t r v der v er volmeisk mobilfasehastighet. Platehøyde, H L/N i en kromatografisk kolonne er definert ved sammenhengen. H σ /L der σ er variansen, som fås fra en gassformet kromatografisk topp, og L er lengde av kolonnen. Platetall, N Nyttige tykk for platetallet: N 16 5,55 w w1/ der t r er retensjonstiden, w bredden ved basis og w 1/ er bredden av toppen ved halvhøyden. Oppløsningsevne har ofte eget symbol R s. Vr Rs t r eller V r er avstanden mellom toppene, målt fra senter av toppene, tykt i tidsenheter eller volmenheter. w av er den gjennomsnittlige bredden av toppene ved basis.

Enkel oppskalering. Kromatografi tføres for analytiske formål eller preperative formål. Analytiske kolonner er lange og tynne og gir god separasjon. Preperative kolonner er tykkere og kan påsettes større prøvemengder. Samme kolonnelengde, men økt tverrsnitt. mlitenprøve Vlitenprøve rlitenprøve m storprøve Vstorprøve rstorprøve Effektivitet av separasjonen. En analytt som beveger seg gjennom en kolonne har en tendens til å spres t til et gassformet bånd. Jo lengre tid analytten brker gjennom kolonna, jo mer spres båndet. Et vanlig mål på båndbredde er w 1/ Man kan viser at w 1/,3σ og w 4 σ. I kromatografi er oppløsningsevnen definert slik R t V r r s w av er gjennomsnittlig bredde ved basis. 3

Diffsjon. Et bånd blir bredere når det går gjennom en kromatografisk kolonne. Ideelt vil et tynt bånd som påsettes innløpet av kolonne komme t gassformet ved tløpet. Under dre ideelle forhold vil båndet bli asymmeisk. Hovedårsaken til båndspredning er diffsjon. Man kan sette opp følgende likning for hvordan en sbstans går fra et område med lav konsenasjon til et område med høy konsenasjon. Proporsjonalitetskoeffisienten D kalles diffsjonskoeffisienten. Den er 10 4 ganger større i gasser enn i væsker. Longitdinell diffsjon skjer derfor hrtigere i GC enn i HPLC. Platetallet. Et mål på kolonneeffektivitet. N 16t r N 5,55 σ w w 1/ H L N Asymmeiske topper, Oppgave 3-38 Et asymmeiske kromatogrammet i figr 3-13 har retensjonstid lik 15 cm på skriverpapiret, og verdiene A og B er henholdsvis 3,0 cm og 1,0 cm. Bestem antall teoretiske plater. Brker likning 3-9 side 564 N 41,7(t r /w 0,1 ) / (A/B + 1,5) 41,7(15/4 ) / (3,0/1,0 + 1,5) 138 plater. Faktorer som påvirker oppløsningsevnen. Oppløsningsevnen: RS ' N α 1 k ' 4 α 1+ kav N: kolonnens platetall α: relativ retensjon 4

k : k av : er kapasitetsfaktoren for forbindelsen som holdes mest tilbake er gjennomsnittlig kapasitetsfaktor for de to komponentene. R s øker når kolonnelengden øker. R s øker når kapasitetsfaktoren k og dermed tiden analytten tilbringer i stasjonærfasen øker R s øker når α øker, α kan forandres ved at stasjonærfasen (væskekromatografi og gasskromatografi) eller mobilfasen (væskekromatografi) forandres. Årsaker til båndspredning. 1. Spredning tenfor kolonna i injektor og detektor.. Spredning i kolonna. Variansen er additiv. Van Deemter likningen: H A + B/ + C A-leddet Mltiple path. Noen veier gjennom kolonna er lengre enn andre. B/ leddet, spredning p.g.a. longitdinell diffsjon avtar når flowhastigheten øker. C leddet skyldes at det tar tid før likevekt å innstilles mellom stasjonærfasen og mobilfasen. 5

3-3 Hva er den optimale flowhastighet i figr 3-15 for best separasjon av løste stoff? H A + B/ + C H -B - + C 5,8mm H 1,64mm + + 0,036mm 5,8mm H ' 5,8mm 0,036mm + 0,036mm 33,1 0 6