Direkte identifikasjon av mikrober fra positive blodkulturer ved hjelp av MALDI-TOF Aleksandra Jakovljev Kjersti Haugum Siri Beate Nergård Valle Kåre Bergh
MALDI-TOF MS (Matrix Assisted Laser Desorption Ionisation Time-of-Flight Mass Spectrometry) «Ongoing revolution in bacteriology,» (Seng et al., 2009, CID). Introduksjon av MALDI TOF MS på mikrobiologiske laboratorier siden 1990-tallet i Europa. Hurtig identifikasjon direkte fra koloni.
Work flow and delay for matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight (MALDI- TOF) mass spectrometry identification of bacteria in this study. Piseth Seng et al. Clin Infect Dis. 2009;49:543-551
MALDI-TOF: Bakgrunnsinformasjon Id baseres på deteksjon av ratio av molekylmassen til bakterielle proteiner, i hovedsak ribosomale, i forhold til time-of-flight av ioniserte ioner gjennom vakuum rør (m/z ratio). Resultatet presenteres som massespekter, spesifikk for hver species. Sammenlignes med spektra i referansedatabaser. Identifikasjon skjer ved beste treff i en database. Score >2,0 for species og score >1,7 for genus identifikasjon.
Diagnostikk av bakteriemi og dens kliniske betydning Bakteriemi og sepsis: ledende årsak til mortalitet blant inneliggende pasienter. Hurtig identifikasjon av mikroorganismer adekvat antibiotika behandling. I Norge: påvist 4,26 bakteriemiepisoder per 1000 innleggelser i perioden fra 1974-1979; 8,71 per 1000 i 1988-1989 (Haug et al., Clin. Infect. Dis., 1994).
Tradisjonell rutinediagnostikk av bakteriemi Etter prøvetaking på avdelingen: sett av aerobe/anaerobe blodkulturflasker sendes snarest til laboratoriet og inkuberes i BD BACTEC blodkultursystem Identifikasjon utføres først etter subkultivering og oppvekst på faste medier Tidsintervall fra positiv blodkultur til id: 24-96 timer
Nyere metoder for hurtig id av mikroorganismer direkte fra positiv blodkultur PCR (polymerase chain reaction). FISH (fluorescence-in-situ-hybridization). Microarray
Metoder for direkte id av mikrober fra positive blodkulturer vha. MALDI-TOF Sepsityper Kit (Bruker Daltonics, Bremen, Germany) Ulike in-house metoder, publisert siden 2010 Sepsityper vs. tidligere beskrevet in-house metoder: ingen signifikante forskjeller i antall identifiserte mikrober (Martiny D et al, 2012; Chen JH et al, 2013; Meex C et al, 2012)
Målet ved utvikling av in-house metode på vårt mikrobiologiske laboratorium Hurtig og pålitelig diagnostikk. Robust og reproduserbar metode for rutinearbeid på laboratoriet. Helst ikke en arbeidsom og tidkrevende in-house prosedyre.
Utprøvingsperiode Sepsityper Kit og ulike in-house metoder utprøvd som pilotprosjekt i bacheloroppgave (februar-april 2014). Ikke vist signifikant forskjell av kommersiell metode sammenlignet med in-house-metoder. Konklusjon: videre testing nødvendig!
Utvikling av dagens in-house-metode Prosjektperiode: mai-september 2014. Utført på Avd. for Medisinsk mikrobiologi, St. Olavs Hospital. Basert på tidligere beskrevet in-house metode av Martiny et al. (Eur. J. Clin. Microbiol. Inf. Dis., 2012).
Materialer og metoder 152 positive blodkulturer inkludert i studien. Mikroskopi av Grampreparat fra alle positive blodkulturer. For monomikrobielle blodkulturer: kun en flaske (vanligvis første) ble videre testet for direkte identifikasjon vha. MALDI-TOF.
Materialer og metoder Rutineidentifikasjon av kolonier fra positive blodkulturflasker ble utført etter standard prosedyrer: hurtigtester standard biokjemiske- og agglutinasjonstester MALDI-TOF API Direkte påvisning med MALDI-TOF. Resultater fra direkte påvisning med MALDI-TOF og id med rutinemetoder fra kolonier ble sammenlignet.
1 ml blodkultur 200 µl saponin La stå 10 min. 2 min, 13200 rpm Supernatant kastes 1 ml sterilt H 2 O 2 min, 13200 rpm Supernatant kastes Bunnfall overføres 1 µl maursyre Matrix HCCA Avlesning Maldi-Tof
Fordeler med vår in-house metode vs. tidligere beskrevne metoder Robust metode som produserer pålitelige resultater. Bruker 1 ml av blodkulturflaska og hele prosedyren utføres i samme sentrifugerør. Forenklet ekstraksjonsprosess: kun bruk av maursyre. Hurtig metode: tar ca. 25 minutter.
Resultater fra prosjektet (mai-sept. 2014) Testet :152 blodkulturer 149 monomikrobielle: Gram positive bakterier: 82 (55%) Gram negative bakterier: 67 (45%) 3 polymikrobielle blodkulturer Generelt: direkte id av Gram negative bakterier var mer vellykket enn Gram positive
Resultater Score >1,7 122/149 (81,9 %) Score kategorisering Score > 2,0: 75/149 (50,3 %) Score > 1,7: 47/149 (31,5 %)
Resultater for Gram positive bakterier Korrekt id: 61/82 (74.4%) med score >1.7 Bakterie Score >1,7 (%) Score > 2,0 Staphylococcus aureus 17/17 (100%) 15 STKN 14 /21 (67%) 6 Β-hemolytiske streptokokker 9/9 (100%) 4 Viridans streptokokker 2/5 (40%) 0 Pneumokokker 1/6 (16.7%) 0 Enterococcus faecalis 11/12 (91.7%) 8 Andre enterokokker 4/4 (100%) 1
Resultater for Gram+ forts. Vellykket id: Aerococcus urinae (>2.0) Clostridium hathewayi (>1.7) Micrococcus luteus (>1.7) Ingen id (score < 1.7) : Propionibacterium Listeria monocytogenes Lactobacillus spp.
Resultater for Gram negative bakterier Korrekt Id: 61/67 (91%) med score >1.7 Bakterie Score >1,7 (%) Score > 2,0 Escherichia coli 35/35 (100%) 28 Andre Enterobacteriaceae 17/18 (94.4%) 8 Bacteroides fragilis 3/3 (100%) 2 Capnocytophaga sputigena 1/1 (100%) 0 Pseudomonas aeruginosa 3/4 (75%) 2 Acinetobacter spp. 1/3 (33.3%) 0 Haemophilus influenzae 1/1 (100%) 0
Resultater for Gram- forts. Ingen id: Moraxella nonliquefaciens Francisella tularensis
Samsvar mellom resultater fra direkte og endelig identifikasjon Samsvar genus 100 % Samsvar species 97,9 %
Uoverensstemmelser mellom resultater fra direkte og endelig identifikasjon Kun mindre uoverensstemmelser med score kategorisering >1,7: 1) en Streptococcus anginosus identifisert direkte som S. constellatus 2) en S. mitis identifisert som S. pneumoniae 3) en Salmonella typhimurium identifisert som Salmonella spp. Kjent problematikk med S. mitis- og S. pneumoniae-identifikasjon. Salmonella id kun mulig til genusnivå vha. MALDI-TOF.
Resultater avlest etter reduserte cutoffverdier Reduserte verdier for både genus (>1.5) og species (>1.7) kategorisering. Korrekt direkte id. oppnådd: 133/149 (89.3%) av positive blodkulturer. Samsvar med endelig id: 99.3% for genus og 96.6% for species. Korrekt identifiserte Gram positive: 70/82 (85.4%). Korrekt identifiserte Gram negative: 63/67 (94%).
Uoverensstemmelser ved reduserte cutoff-verdier Genus misidentifikasjon: en Citrobacter freundii feilidentifisert som Lactobacillus helveticus (score: 1,513) etterfulgt med tre id av C. freundii med score 1,474 1,453 1,420. Mindre uoverensstemmelser: en S. dysgalactiae identifisert som S. pyogenes (score 1,628) en Lactobacillus rhamnosus identifisert som L. sharpeae (score 1,568)
Spesifikke problemer ved direkte id Dårlig id av pneumokokker (scoreverdier rundt 1,1-1,2): celle lysering? Beskrevet tidligere av Prod hom et al (J. Clin. Microbiol., 2010). Pneumokokkid: Relativt pålitelig og hurtig id med direkte agglutinasjonstest (Slidex Pneumo-Kit, BioMeriéux)
Spesifikke problemer ved direkte id forts Blodkulturer med difteroide staver og Gram+ kokker som blir positive etter 3-4 dagers inkubasjon, representerer vanligvis forurensing. Ofte ikke høy nok konsentrasjon av bakterier i blodkulturflasken (<10⁵ CFU/ml) og bør ikke testes direkte.
Polymikrobielle blodkulturer Suspekt polymikrobiell blodkultur ved Gramfarging Forsiktighet i tolkningen av direkte id-resultater Resultater fra studien: 3/152 (2%) polymikrobielle blodkult. Enterococcus faecalis + Staphylococcus epidermidis i 4/4 flasker (kun S. epidermidis id) E. coli + Streptococcus mitis i 6/6 flasker, Streptococcus oralis i 2/6 flasker (kun E. coli id) Staphylococcus hominis + Staphylococcus epidermidis i 1/6 flasker (kun S. epidermidis id)
Implementering av in-house metoden på laboratoriet Blitt en del av rutinearbeidet. Testing utføres to ganger daglig. Oppdatering av MALDI-TOF-databasen med ca. 1000 nye stammer. Fordeler og ulemper av metoden beskrevet i prosjektet også merket i rutinearbeidet.
Konklusjon Robust in-house metode som gir hurtig og pålitelige identifikasjon. Enkel å implementere. God hjelp til leger på klinikker i tilfeller der identifiserte mikrober har kjent innebygd resistens.
Takk for oppmerksomheten!