Foredraget vil omhandle:

4 automatiserte hematologiinstrumenter med ulike prinsipper 1 Marthe Wedø Aune Avd. for immunologi og transfusjonsmedisin Nasjonalt hematologi kurs/bfi/ 190515 Foredraget vil omhandle: Oversikt instrumenter i norske laboratorier ADVIA 2120, CELLDYN SAPPHIRE, SYSMEX XN og Coulter DXH Analyseprinsipper Muligheter- begrensninger Holdbarhet FLAG-evaluering Kort om SLS, Cellavision og andre analyseinstr. 2 1

% fordeling analyseinstrumenter i 79 norske laboratorier 2014 106 instr( NOKLUS) 3 Analyseinstrumenter i 79 norske laboratorier (fra uts. NOKLUS 2014) 4 Instrument % fordeling ABX ( Bergman) 9,4 ADVIA ( Siemens) 17,9 CELLDYN ( ABBOTT) 19,8 Sysmex 50,9 Coulter ( Nerliens Mezansky) 1,9 Totalt 100,0 2

ADVIA 2120 CELLDYN SAPPHIRE 5 Sysmex XN 1000 Coulter DXH 800 6 Om de 4 instrumentene Kan tilkobles autovalideringssystemer har GOD analytisk kvalitet Flagger og teller kjerneholdige røde og korrigerer leukocyttall for medtelling av NRBC (NB! Hvis DIFF mode for ADVIA 2120 og UniCel DxH) Holdbarhet for de ulike parametrene varierer med metodene som benyttes i de ulike instrumentene Sysmex XN, ADVIA 2120 og Coulter Unicel DxH har Bodyfluid kanaler.alle teller TNC. Denne inneholder alle celler med kjerner også non-wbc. Disse ekskluderes i Sysmex XN i HF region. ADVIA 2120 har i tillegg egen CSF ( spinal kanal) Alle instrumenter har parametere for hemoglobininnhold retikulocytter, %hypo og %hyper 3

Om de 4 instrumentene forts DIFF: ADVIA 2120: 6-part ( N,L,M,E,B + LUC) Rapporterer antall blaster Sysmex XN: 6-part ( N,L,M,E,B + IG) Celldyn Sapphire: 5-part- men rapporterer i tillegg extended DIFF + andel non-viable cells UniCel DxH 800: 5-part Alle instr. flagger eller kvantifiserer tilstedeværelse av umodne eller abnormale celler- men med ulik sensitivitet og spesifisitet Analyseområde 8 ADVIA 2120 LPK EPK Hgb TPK MCV NRBC Retik 0,02 400,0 0,0 7,0 0,0 22,5 5-3500 30-180 0,2 24,5% CELL DYN Sapphire UniCel DxH 800 0 250,0 0,0 7,50 1,0 25,0 0-2000 (PLT-O) Instrument 0,000-400,0 0,000-8,50 0 1000 (CD 61) 0 25,5 0,0-3000 37-197 0,0 1,5 x 10*12/l 50-150 0 600/100 WBC 0 30% Sysmex XN 0,00-440,0 0,0 8,60 0 26,0 0-5000 0 600/100 WBC 0 30% 4

Om instrumentene ADVIA 2120 Coulter Unicel DxH CELLDYN Sapphire Sysmex XN Kapasitet 120 100 110 100 Prøvevolum 175 ul 165 ul 112,5 ul 88 ul Nedre nivå Bodyfluid kanal LPK Nedre nivå Bodyfluid kanal EPK Nedre nivå LPK CSF kanal > 20 10 6 /L > 20 10 6 /L > 50 10 6 /L 0 10 6 /L (CV 20% v/5 ) > 10 000 10 6 /L 0 10 6 /L (CV 20% v/2) PMN/MN rapp > 20 10 6 /L > 10 000 10 6 /L > 3000 10 6 /L > 1000 x 10 6 /L 9 Nedre nivå EPK CSF kanal 0 10 6 /L Analyseprinsipper Instrument LPK EPK Hgb TPK DIFF NRBC Retik 10 ADVIA 2120 CELL DYN Sapphire Peroxidase og optisk scatter (lobularitet/kj ernetetthet) Optisk scatter v/ 4 vinkler+ fluoroscence Cellene sfæres Optisk metode Cellene sfæres Impedanse + Optisk Cyanidfri Fotometri + cellulært målt Cyanid fri, Fotometri PLT-O 2 dim, refraktiv indeks PLT-O PLT-I PLT- CD61 ( imm.- met) Peroxidas e og optisk scatter Optisk scatter v/ 4 vinkler+ fluoroscen ce Utføres når DIFF er best. BAROX met. Måles i alle prøver fluoresecensce ( PI) Absorbance Oxazin 750 Fluorescence Modifisert thiazol orange UniCel DxH 800 Sysmex XN Impedanse WNR,WDF, WPC Fluorescence flowcytometri,kompleksitet, volum Impedanse + flowcytome tri ( nrbc) Impedanse m/hydrodyn fok + optisk Cyanidfri, fotometri Cyandidfri (SLS), fotometri Impedanse VCS+ 5 flowcytom etriske målinger PLT-I (imp m/hdf) PLT-O (fluoresc.)) PLT-F (fluoresc. Oxazine) ACAS, Fluorescense flowcytom etri Flowcytom etrisk metode når DIFF er bestilte Fluore-- scense i WNR kanalmåles i alle prøver Flowcytometrisk metode ( 5 målinger), ny metylen blå Fluorescence, flowcyt. (Polymethin) 5

CELL-DYN Sapphire - Technology Impedance Hydrodynamically focused Spectrophotometri MAPSS Immunology CD 61 CD4 & CD8 Multi Angle Polarised Scatter Separation (MAPSS) 90 90 D 7 0 0 o Light Loss: SIZE 7 o Scatter: COMPLEXITY 90 o Scatter: LOBULARITY 90 o D Scatter: GRANULARITY Førde 2010 6

CELL DYN Sapphire impedanse, light scatter, fluorescense, immunologiske metoder- CD61,CD4 & 8 WBC & 5-part DIFF: lys spredning v/4 vinkler+ fluorescense (propidium bromide) RBC og PLT: sfæring av cellene, hydrodynamisk fokusering, impedanse og lysspredningsmetode, antistoffmetode PLT(CD61) NRBC: fluorescense -FL3 (propidium bromide) & light scatter Retik: light scatter og fluorescense - FL1-(modifisert thiazoleorange- CD4k530) CD61,CD4 & 8:immunologiske metoder Hemoglobin: cyanidfri metode Optiske målinger vha blå laserdiode 488nm 7

CELLDYN Sapphire- 3 trombocyttmetoder; impedanse, optisk, antistoff Hydrodynamisk fokusering både for impedanse og optisk metode -impedanse metode : 0 35 fl 256 kanaler RBC coincidense korreksjon Fast telletid MPV og PDW genereres fra log normal kurven -optisk metode= default metode to-dimensjonalt light scatter 90* og 7*, søker etter 2000 events eller max 32 sek telletid PIC/POC delta ved uoverensstemmelse antistoff metode-, CD61- teller trombocytter i alle størrelser Nye parametere i Celldyn Sapphire 9 nye parametere 2 nye scatter og histogrammer 2 modifiserte scatter og histogrammer Put science on your side. ACS Hematology 16 8

CELLDYN 4000 CD3,CD4,CD8 CELLDYN SAPPHIRE Eneste hematologiinstrument med automatiserte immunologiske metoder Kan i prinsippet benyttes som et standard flowcytometer CD 61: imm PLT-metode- eneste metode som teller PLT uavhengig av størrelse Telles nøyaktig ned til 1 x 10 9 /L Stabilt i 96 timer ( rom og kjøl) Repeterbarhet : 1,6% ved PLT=19 CD4 & CD8- T-lymfocytter: benyttes for HIV pasienter. Ikke egnet for en del kreftpas.samt for pasienter med Sezary lymfom Korrelerer godt med Facscanto flowcytometer 18 9

Sysmex XN 19 Svært fleksibelt analysesystem kan velge/kjøpe moduler etter behov Standard: CBC + DIFF Kan velge ekstra: Retik, PLT-F, WPC, Bodyfluid kanal PLT-F: nøyaktig og presise målinger i lavt nivå Lav WBC mode Korrigerer for medtelling av NRBC i alle prøver ( CBC) Godt autovalideringssystem: Extended IPU 3 kanaler for telling av WBC: -WNR: telling av WBC,NRBC + basofile -WDF: klassifisering av Lymf,Mono,Eos, Neut+Baso -WPC: skiller mellom blaster og abnornmale lymfo Laser 10

WNR/kanal FSC SFL Metoder, WDF-kanal 11

Clusteranalyse i scattergrammet Y Mahalanobis Distanz XE-2100 Adaptive Cluster Analysis System A.C.A.S 1. cellesignal Når et cellesignal detekteres bliver afstanden målt og beregnet til centroiderne (Mahalanobis Distanz). Denne afstand / beregning bestemmer hvilken poputation cellen tilhører. X Clusteranalyse i scattergrammet Forudbestemt (1.) Centroid af lymphocytterne Y Forudbestemt (1.) Centroid af granulocytterne Adaptive Cluster Analysis System Forudbestemt (1.) Centroid af ghostområdet Forudbestemt (1.) Centroid af monocytterne A.C.A.S Udgangsværdien for centroiden er bestemt ud fra flere tusind prøver. Disse værdier er gemt i instrumentet og bruges kun som udgangsværdi ved beregningen. X 12

Metoder WPC-kanal Metoder, RET-kanal RET-Scattergram RBC FSC IRF WBC/ NRBC LFR MFR HFR PLT-O RET-Scattergram SFL 13

PLT- F kanal FSC RBC WBC diagnostic IPF% research IPF# H-IPF PLT-F SFL Sysmex XN Bodyfluid kanal- ingen forbehandling av prøven 28 LPK telles og klassifiseres i WDF kanal. Korrigeres for medtelling av non_wbc fra HF-BF Fortynning LPK: 1:20 Antall celler som telles i BF kanal er ca 10x høyere enn i WB mode. RBC: fortynning 1:498 ( DC metode) LPK: rapporteres fra 0 x 10*6/L, EPK fra 1 x 10*9/L 14

29 405 BF hvorav 125 maligne prøver God overenstemmelese XN/ manuell metode for andre kroppsvæsker enn CSF. Noe dårligere korrelasjon for CSF. Finner noe overestimering av LPK, PMN og MN sammenliknet med manuell metode v/ lave konsentrasjoner CV 20% på nivå 5,8 x 10*6/L I BF prøver med HF > 6,9/100 WBC- anbefaler kontroll med manuell metode pga mulig forekomst av maligne celler Coulter UniCel DxH 800 Ny design Korreksjon av CBC parametere ved høy WBC Ny RBC måling nrbc-for interferens korr. Utvidet måleområde for WBC,RBC ogplt Lavere bakgrunnsverdier ved analyse av Bodyfluid Ny flowcytometrisk metode for NRBC måles v/diff) DIFF: Fortsatt VCS teknologi, men med 5 lysspredningsmålinger i tillegg til volum og radiobølger- 29 målinger pr celle! 30 15

Cyto DIFF + FC 500 Beckman Coulter flowcytometer + Remisol 31 UniCel DxH+ CYTODIFF+ FC 500 = 16 parameters DIFF 100 ul blod + 10 ul CytoDIFF 20 min inkubasjon Analysering og autogating Resultatene fra CytoDIFF integreres med DIFF fra DxH i Remisol- 16 parameters DIFF Dvs- kan rapporteres 24 timer i døgnet 32 Direkte deteksjon av: WBC, NEU, LY, MO, EOS, BASO, IG, T+NK Ly, B Ly Indirekte deteksjon av: Blasts, T+NK blasts, B blasts, NRBC, reactive LY, myeloid blasts, plasma cells 16

ADVIA 2120 - analyseprinsipper 33 NRBC metoden ADVIA 2120 bruker størrelse og kjernestruktur for identifisering av NRBC Mindre enn lymfocytter Større enn de fleste trombocytter NRBC legger seg vanligvis i disse regionene Kjernetetthet forskjellige fra mononukleære celler 17

NRBC i Baso kanalen Ved å kombinere telletall fra regioner i Peroxidase og Baso kanalen beregnes NRBC telletallet, BAROX NRBC. WBC BA = MN + B M N B L E MN PMN NRBC NRBC WBC ROX = N + E Noise Korrelasjon NRBC % Sysmex XE og ADVIA 2120 % NRBC NRBC % ADVIA 2120 50,0 45,0 40,0 35,0 30,0 25,0 20,0 15,0 10,0 5,0 0,0 0 10 20 30 40 50 NRBC % Sysmex Xe 2100 Differanse %UTSTRYK-XE/2ADVIA 2120 %Utstryk-%XE2 %Utstryk-%advia 2120 40,0 30,0 20,0 %XE2 10,0 0,0-10,0-20,0-30,0-40,0 0 50 100 150 200 %UTSTRYK 18

CSF-kanal:to optiske målinger (høy og lav vinkel m/ laser), en Abs måling Måleområde og linearitet CSF kanal ADVIA 2120 Måleområde: Leukocytter: 0-5000 x 10 6 /L Erytrocytter: 0-2880 x 10 6 /L DIFF (%Neutro,%Lymfo,%Mono eller % PMN og %MN) kan rapporteres ved LPK> 20x10 6 /L Linearitet: Erytrocytter: lineært 0-2165 x 10 6 /L Leukocytter :lineært 0-5137 x 10 6 /L NB! Ved erytrocyttantall> 1500 x10 6 /L- prøven må fortynnes med 0,9% NaCl for å unngå at erytrocyttene interfererer med LPK ( 1+1, 1+19, etc.) 19

Nivå leukocytter funnet i spinalvæsker analysert ved St Olavs Hospital 1999 og 2011-transportert med portør (2009) og rørpost (2011) % fordeling av nivå leukocytter i spinalvæske År n Nivå 0-5 10 6 /L Nivå 6-50 10 6 /L Nivå 51-150 10 6 /L Nivå >150 10 6 /L Transportmåte 1999 263 78,3 14,4 4,2 3,0 2011 1356 77,7 14,5 4,4 3,4 Prøver bragt med portør Prøver bragt med rørpost/portør Method ADVIA 2120i Body Fluid, TNC + RBC TNC- Total Nucleated Cells (reportable >20 x 10 6/ L) RBC- Red Blood Cells (reportable >10 x 10 9/ L) 40 Absolute number of TNC includes nucleated blood cells, mesothelial cells and other non-haematopoietic cells. FDA approved: Dialysate Pleural Fluid Peritoneal Fluid ( Ascites) Sammenlikner Baso-og Perox-WBC MNs PMNs G.H. Hematologi,AIT 20

Kroppsvæsker og spinalvæsker St Olavs Hospital 2014: ca 1500 spinalvæsker Ca 600 andre kroppsvæsker Nivå LPK: 0 24000 x 10*6/L Mht automatiserte metoder: pga ca 80% av spinalvæsker har nivå 0-5 10 6/L- behov for metoder som kan telle nøyaktig i dette nivået. 41 CellaVision Forekomst av andre celletyper en leukocytter i kroppsvæsker 42 n = % of samples with included non-wbc s Most common non-wbc s Pleura 20 65 % Mesothel, Malignant cells Ascites 20 45 % Mesothel Dialysat 15 38 % Mesothel Synovial 20 30 % Synovial lining cells BAL 20 60 % Lungepithelial cells Total 95 48 % G.H. Hematologi,AIT 21

ADVIA 2120- PANDA- diagnostisk verktøy 43 Lab hem.11;47-61,2005, PANDA ( Peroxidase and Nuclear Density Analysis) 44 22

Metodeforskjeller retikulocytter- ekstern kvalitetskontroll NOKLUS ( uts. 2014-2015) 45 Retikulocytthemoglobin innhold (CHr/ Ret-He /MCHr)-NOKLUS uts 1 2015 46 23

Holdbarhet, St Olav, n=30-40 pr test oppsett 47 Parameter SYSMEX SYSMEX ADVIA Holdbarhet XE 2100 XE 2100 2120i rom kjøl rom ADVIA 2120i kjøl CELLDYN Sapphire rom CELLDYN Sapphire kjøl MICROS ES 60 rom MICROS ES 60 kjøl Sysmex K1000 rom Sysmex K1000 kjøl LPK 96 96 72 72 72 48 96 96 96 96 EPK 96 96 96 96 96 96 48 48 72 72 Hgb 96 96 96 96 96 96 48 48 96 96 EVF 14 96 14 48 8 48 <24 48 14 96 MCV 14 48 < 8 24 <8 72 14 96 14 48 MCH 96 96 96 96 96 96 48 96 14 96 MCHC 14 48 <8 24 <8 12 <24 72 - - TPK-Opt <24 48 <24 48 24 96 - - - - TPK-Imp 24 96 - - 96 96 24 48 24 96 TPK-CD61 - - - - 96 96 - - - - Neutro% 72 96 72 72 48 96 - - - - Lymfo% 72 96 24 24 72 48 - - - - Mono% 24 96 24 72 24 96 - - - - Eos% 96 96 24 <8 14 72 - - - - Baso% 72 <24 24 <8 72 <8 - - - - Retik% 24 96 <24 72 14 96 - - - - Ret-He 14 96 %Hypokrome 2 24 EPK %CD3/4/8 24 0 Holdbarhet UniCel DxH 800 og Sysmex XN UniCel DxH: CBC og DIFF: 24 t rom og 48 timer kjøl Retik: 24 timer rom og 72 timer kjøl Sysmex XN : WBC, RBC, Hgb: 96 t rom og kjøl MCV: 14 t rom, 48 t kjøl EVF:8 t rom, 48 t kjøl MCH: 96 t rom og kjøl PLT: 24 t rom, 96 t kjøl DIFF: 72 rom, 96 kjøl Retik: 24 rom, 96 kjøl 48 24

FLAG Evaluering 517 prøver tatt av pasienter med maligne hematologiske sykdommer ble analysert på Sysmex XN, Sysmex XE 2100, CELLDYN SAPPHIRE,ADVIA 2120 og Unicel DxH. Analysert innen 4 timer. 200 cellers manuell DIFF utført av 2 personer 49 International Journal of Lab Hematology; Optimal Flagging combinations for best performance of five blod celle analyzers.volume 37, Issue 1, side 63-70. Feb 2015. M Depoorter et al. Flag Evaluering 50 International Journal of Lab Hematology; Optimal Flagging combinations for best performance of five blod celle analyzers.volume 37, Issue 1, side 63-70. Feb 2015. M Depoorter et al. 25

FLAG Evaluering Blast FLAG: ADVIA 2120 best- fulgt av Sysmex XN 51 Atypiske LYMFO: DXH best, fulgt av Sysmex XN IG og Left shift: Sysmex XN NRBC: UniCel DXH Cellavision DM 9600 52 26

Utstryks og fargemaskiner Sysmex SP 10 SLS, Siemens- legger på film 53 Helaut.,just for HCT Helaut., 75 ul blod, aut.just for HCT, WBC cobas m 511 integrated hematology analyzer cobas m 511 blood printing ( blood smear ) technology 27