Automatisert fæcesdiagnostikk ved Haukeland Universitetssjukehus Therese Midtbø. Bioingeniør Haukeland Universitetssjukehus Introduksjon Molekylærbiologiskseksjon på Mikrobiologisk avdeling, Haukeland Universitetssjukehus. Seksjonen har 15 tilsette. 1
Fecesdiagnostikkenved HUS Oversikt Gjennomgang av vårt fullautomatiserte system (FLOW) for analysering av fecesprøver på PCR Fordelar og utfordringar ved bruk av FLOW Oppstart av feces-pcr april 2017: utfordringar og løysingar Fecesdiagnostikk ved HUS Prøvarmed spørsmål om tarmpatogene mikrober vert undersøkt med PCR Alle prøvarvert undersøkt for virus, bakterier og parasitter Prøver sendes på prøverøyrmed tilsetting 2
PCR-pakken vår Tarmpatogene virus Norovirus gg1 og 2, adenovirus, rotavirus, astrovirus(fast track diagnostics) Tarmpatogene parasitter Giardia lamblia, E. histolytica, Cryptosporidium spp. (fast track diagnostics) Tarmpatogene bakterier Salmonella, Campylobacter, Yersinia, Shigella/EIEC, EHEC (stx1, stx2, eae) (tibmolbiol) C. difficile(in house-pcr) Vårt fullautomatiserte system: FLOW FLEX 3
Feceslaboratoriet med MagNaPure96 og FLOW Flex pipetteringsrobot Prøveflyten Alle prøver som er registrert hos oss før kl 0800 vert analysert samme dag. Prøver vert analysert seks dager i veka Starter med forbehandling av prøver: fortynner 1:10 i PBS og plasserer ved -80 C Bygger arbeidslister i labdatasystemet vårt og sender til FLOW Software. 4
I FLOW Software får meoversikt over kvart agens som skal analyserast i kvar enkelt prøve. Den viser òg kor i systemet prøven befinn seg. FOTO Sender arbeidsliste frå FLOW Software til pipetteringsrobot FLOW PCR Setup Instrument 5
PSH-Primary Sample Handler Prøver vert plassert i prøverack som settes i pipetteringsrobot en. Prøvenummer vert scanna og roboten pipetterer prøvane i numerisk rekkefølge til djupbrønnsplate. MagnaPure 96 Djupbrønnsplateplasseres i ekstraksjonsinstrument MagnaPure96. Renseprotokoller forhåndsdefinert i FLOW Software. Me bruker reagensa «DNA and Viral NA Large Volume» med 500 µl prøvemateriale inn og 100 µl eluatut. 6
PSU-PCR Setup Unit Me nyttarden samme pipetteringsroboten til både primærprøver, og til pipettering av mastermiks og eluat til PCR-plater. Mange analyser på samme makro og multipleksing gjerat mange agens kan analyserast på samme PCR-plate. Eit oppsett med opptil 46 fecesprøver gir fire PCR-plater med totalt seks ulike multipleks-pcr analyser. LightCycler 480 PCR-plater plasseres i PCRinstrumenta LightCycler 480. Instrumentet mottar informasjon frå FLOW software om kva PCR protokoll som skal nyttast på kvar enkelt PCRplate. 7
Vår instrumentpark 8 LC480 tilkoblet FLOW Etter analysering på 480-instrumenta blir svara og PCR-kurver overført til FLOW software, der kurvanevert vurdert og svara sendt tilbake til labdatasystemet. 8
Utsvaringsbilde i labdatasystemet vårt Fordelar med FLOW Online kobling følger en prøve hele veien Sporbarhet Redusert «hands-on» og redusert risiko for feilpipettering Stor kapasitet 9
Ulemper med FLOW Lite fleksibelt, må ofte begynne frå start dersom eit av instrumenta får feilmelding Krever lang opplæring for å forstå heile prøveflyten og vite kva som kan gjerastdersom det stopparopp Oppstart av feces-pcr april 2017 Problem med negativ inhibisjonskontroll i ca halvparten av prøvane. Vert PCR-reaksjonen inhibert? Eller ligg problemet einanna stad i prosessen? 10
Oppstart av feces-pcr april 2017 Vert PCR-reaksjonen inhibert? -Ja. Fortynning av eluat gir positiv inhibisjonkontroll i dei fleste prøvane. Men framleis er det nokre prøver som gir negativ inhibisjonkontroll etter fortynning. Oppstart av feces-pcr april 2017 Mastermiks vart endra frå DNA Multiplex Master (Roche) til Probes Master (Roche). Forbehandling av prøver vart endra frå fortynning i vatn til fortynning i PBS. 11
Inhibisjonskontroll der prøver er fortynna i vatn før ekstraksjon Inhibisjonskontroll der prøver er fortynna i PBS før ekstraksjon 12