13.4.2012 SLUTTRAPPORT Listeria monocytogenes i småskala osteproduksjon 1.8.2009 31.10.2011 Bjørn C. Tisjø Schirmer, Solveig Langsrud, Even Heir, Trond Møretrø, Therese Hagtvedt Nofima, Osloveien 1, 1430 Ås
SLUTTRAPPORT LISTERIA MONOCYTOGENES I SMÅSKALA OSTEPRODUKSJON 1 1.8.2009 31.10.2011 Med bakgrunn i listerioseutbruddet ved Rikshospitalet / Radiumhospitalet i 2007 ble NFRprosjektet Listeria monocytogenes i småskala osteproduksjon igangsatt. Målet med prosjektet var å øke kunnskapen om risiko, forekomst, vekst og overlevelse av L. monocytogenes hos norske småskalaprodusenter av mykost. Denne rapporten oppsummerer resultatene fra prosjektet og gir noen praktiske råd til produsentene, samtidig som den viser til gjenstående problemstillinger og fremtidige utfordringer. Forskere ved Nofima (Ås), Veterinærinstituttet og Nasjonalt Folkehelseinstitutt har samarbeidet i prosjektet, som også har hatt løpende dialog med Mattilsynet, Innovasjon Norge og ostebransjen ved Norsk Gardsost. I tillegg var det tett dialog med de franske kompetansesentrene Actilaît og ANSES, og begge disse ble besøkt av forskerne ved Nofima. Totalt 37 norske småskala osteprodusenter bidro til prosjektet ved å svare på en innledende spørreundersøkelse, og syv av disse ble fulgt opp med bedriftsbesøk og prøvetaking. Prosjektet ble finansiert av Fondet for forskningsavgift på landbruksprodukter (FFL) og forskningsmidler over jordbruksavtalen. Denne rapporten er ment som et hjelpemiddel som fokuserer på å forbygge forekomsten av Listeria monocytogenes i småskala osteproduksjon. I tillegg til denne rapporten anbefaler vi alle å lese bransjeretningslinjene (Nasjonale retningslinjer for småskala mjølkeforedling). Vedlagt følger alle populærvitenskapelige artikler som så langt er skrevet i forbindelse med prosjektet. SAMMENDRAG AV RESULTATER OG ANBEFALINGER 1. Forekomst av Listeria og prøvetaking 2 Hva vet vi? Forekomsten av Listeria hos småskala osteprodusenter er lav i forhold til det man finner i mange andre bransjer Det er umulig å oppnå 100 % sikkerhet mot Listeria gjennom prøvetaking
Overvåking av Listeria i produksjonsmiljøet er mer effektivt enn produktkontroll for å unngå Listeria i produkter Hyppig prøvetaking av lokaler og miljø er nødvendig for å ha kontroll på forekomst av Listeria Det er en utfordring at hyppig prøvetaking er dyrt og tidkrevende Hurtigtester (alt-i-ett rør) fungerer ikke i ysteri og modningsrom. Dette skyldes at den naturlige bakgrunnsfloraen gir alt for mange falske positive Hva kan vi gjøre? Gjør smarte valg av prøvetakingssted. Prioriter: o Utstyr som er i kontakt med mykost (saltlake, modningsrister/planker) o Steder som kan være Listeria-nisjer eller hvor Listeria samler seg opp (sluk, fuktige sprekker). Velg prøvemetodikk som gir størst mulighet for å finne Listeria Hyppighet o Ta prøve fra størst mulig areal der det er mulig. Bruk gjerne fuktige kluter, men en kombinasjon av ulike prøvetakingsmetoder (f.eks. svabere) kan være nødvendig for å komme til for prøvetaking. Samleprøver er en mulighet, men pass på at du ikke sprer smitte o Prøvetakingsutstyr av Q-tipstypen kan brukes for å komme til i kriker og kroker o Prøve må analyseres i rutinelaboratorium dagens hurtigtester er ikke gode nok o Velg noen faste prøvepunkter fra kontaktflater og bytt mellom prøvetakingssteder fra andre punkter o Prioriter miljø- og utstyrsprøver framfor produktprøver Hva vet vi for lite om? Selv for industriell og meget standardisert produksjon er det vanskelig å sette klare retningslinjer for prøvehyppighet siden forekomsten av Listeria varierer fra bedrift til bedrift. Hva bedriftene anser som akseptabelt nivå varierer også. Vi vil likevel
anbefale hyppig prøvetaking etter en forhåndsoppsatt plan, i hvert fall en gang pr. måned. Vi har ikke nok kunnskap om forskjellene i bakgrunnsfloraen mellom produsenter som produserer ost av pasteurisert melk og produsenter som produserer av upasteurisert melk til å kunne gi separate anbefalinger for hyppighet og steder for prøvetaking. 2. Overlevelse av Listeria i produksjonsmiljøet 3, 4 Hva vet vi? Under forholdene vi finner i modningsrom (høy luftfuktighet, lav temperatur) vil Listeria kunne overleve i nesten ubegrenset tid. o Vanlig temperatur i modningsrom for ost er 12 C og relativ fuktighet er over 90 %. Under disse forholdene overlever Listeria lenge o Bakgrunnsfloraen på modningsrom varierer fra produsent til produsent og det er få bakterier som går igjen hos de forskjellige produsentene o Ingen av bakteriene vi fant ved våre analyser er i stand til å forhindre vekst og overlevelse av Listeria alene I forholdene vi finner i selve ysterommene (med lavere luftfuktighet, tørrere overflater og romtemperatur store deler av døgnet) vil Listeria overleve kortere enn i modningsrom o Vanlig temperatur i ysteri er mellom 20 og 25 C. Relativ fuktighet er rundt 40 % utenom produksjon, men kan øke til rundt 70 % under produksjon og renhold. Uten renhold og tilgang til næring vil Listeria under disse forholdene bli redusert med 99 % i løpet av fire uker, men det vil allikevel kunne være nok Listeria til stede til å vokse opp dersom betingelsene er egnet (som for eksempel ved melkesøl) o Økt lufttemperatur og fuktighet under renhold og produksjon vil normalt ikke ha lang nok varighet til at Listeria begynner å vokse Hva kan vi gjøre? Unngå at Listeria kommer inn i lokalene (se soneinndeling) Unngå smitte fra omgivelsene til produkt
o Beskytt osten fra drypp, sett ikke ost rett under ventilasjonsanlegg, rør eller lignende og dekk til på toppen o Regelmessig prøvetaking for å sjekke at ikke Listeria har etablert seg o Ikke lagre ost for lavt over gulvet dersom gulvet er vått kan det sprute opp på osten Sørg for å holde lokalene så tørre som mulig o Ventilasjon o Avrenning, drenering og tørking av flater som ikke har avrenning Hva vet vi for lite om? Vi vet ikke nok om hvordan bakterier i samspill påvirker vekst og overlevelse av Listeria. Konkurranse om næringsstoffer kan føre til at Listeria vokser langsommere eller ikke i det hele tatt, men dette kan være avhengig av type bakgrunnsflora. I og med at floraen er forskjellig fra sted til sted kan man ikke konkludere med at en bakgrunnsflora gir en sikkerhet mot Listeria 3. Lagringsoverflater og bruk av tre i kontakt med ost 5 Hva vet vi? Det brukes forskjellige materialer som lagringsoverflater, inkludert tre, stål og plast Lett vaskbare flater som stål er ofte anbefalt for matproduksjon Det finnes en rekke antibakterielle materialer i handelen, men våre undersøkelser viser at de har liten effekt mot Listeria under praktiske forhold over tid. Det er imidlertid mulig at kobber brukt i ystekar kan ha en antimikrobiell effekt Tre kan være gunstig for kvaliteten på osten siden tre kan ta opp og gi fra seg vann. Det er derfor vanlig å bruke tre som kontaktflate mot ost under modning Det er ikke mulig å si at tre er mer eller mindre trygt å bruke som lagringsoverflate enn for eksempel plast eller stål o Bakterier vil trekke inn i treet og vekk fra overflaten. Det betyr imidlertid ikke at de dør, og det er uvisst om de under visse betingelser kan komme tilbake til overflaten og overføres til osten
o Tre er vanskeligere å rengjøre enn plast eller stål Hva kan vi gjøre? Om det burde brukes tre eller plast eller stål må avgjøres for hvert enkelttilfelle. Vask tre med kokende vann for å drepe eventuelle Listeria. Tryggheten ved bruk av tre kan også økes ved å sørge for at treverket får tørke ut skikkelig iblant. Hva vet vi for lite om? Det er mye som er ukjent rundt bruken av tre i næringsmiddelproduksjon og det er i dag ikke mulig å si om bruk av tre er gunstig eller ugunstig med tanke på risiko for spredning av sykdomsfremkallende bakterier. Forskjellige studier av tre viser store variasjoner i resultater. Treets beskaffenhet og bruken av det varierer mye og kan påvirke risiko. 4. Produksjonslokalet Renhold 4 Hva vet vi? Listeria er ikke spesielt motstandsdyktig mot ordinære vaske- og desinfeksjonsmidler og et godt renhold kombinert med soneinndeling er viktig for å unngå Listeria i produksjonslokalene o Spyling med vann alene er ikke tilstrekkelig til å fjerne Listeria. o Desinfeksjon etter vask reduserer antall Listeria. Listeria kan overleve og noen ganger vokse opp i produksjonsmiljøet o Listeria som er til stede etter vask vil ikke kunne vokse uten tilgang til næring og fuktighet. De vil imidlertid kunne overleve i flere uker, for så å vokse opp igjen dersom de får tilgang til næring og det er høy luftfuktighet eller dårlig drenering. o Selv et meget lavt antall Listeria etter renhold kan representere et potensielt problem. Dersom de får tilgang til næring, for eksempel via melkesøl, vil de i løpet av en helg kunne vokse opp til store mengder. Dette er spesielt farlig dersom det finnes nisjer i lokalet der Listeria kan gjemme seg under vask.
Selv om prøvetaking etter renhold gir negativt resultat kan det være Listeria til stede, som med tilgang til næring kan vokse opp til store antall. Hva kan vi gjøre? Vask ysteri rett etter produksjonen er avsluttet for å unngå at bakterier fester seg og vokser opp Jevnlig renhold av modningsrommene uten at produkter er til stede. Ta ut modningsplankene / ristene av modningsrommet og vask / desinfiser de jevnlig Bruk utstyr som er lett å rengjøre og lett å demontere for rengjøring. Unngå sprekker og vær nøye med vask av mulige nisjer som lister, undersiden av dører, bryterpanel etc. Vask sluk og sørg for renhold og vedlikehold av ventilasjonsanlegg Bruk vaske- og desinfeksjonsmidler beregnet for matproduksjon. Velg en seriøs leverandør av midler og utstyr Sørg for at lokalet er rent og tørt etter vask for å unngå at gjenværende Listeria kan vokse opp igjen. Ta heller prøver rett før produksjonsstart enn rett etter vask dersom du ikke kan ta begge deler. Prøvetaking, spesielt i modningsrom og på flater som kommer i kontakt med osten, som for eksempel lagringsplanker / rister er viktig. Hva vet vi for lite om? Det er fortsatt uklart hvorfor vi ikke klarer å påvise Listeria rett etter vask og desinfeksjon selv om vi vet at de er til stede. Dette kan skyldes at Listeria gjemmer seg i ujevnheter på overflaten, eller at Listeria trenger lengre tid i mindre stressende omgivelser før den igjen begynner å vokse. 5. Soneinndeling og smittespredning Hva vet vi? Listeria er utbredt i naturen og kan komme inn i produksjonsmiljøet via råvarer, mennesker og dyr.
Utilstrekkelig tilrettelegging eller praktisering av soneinndeling er ikke uvanlig i småskala osteproduksjon Dersom Listeria først kommer inn i produksjonsmiljøet og etablerer seg der er den vanskelig å bli kvitt. Selv om prøvesvarene er negative kan Listeria ligge gjemt for plutselig å vokse opp når den får tilgang til fuktighet og næring. Hva kan vi gjøre? Tilrettelegg for en god soneinndeling mellom ytre miljø og produksjonslokaler gjennom praktiske løsninger for håndvask, klesskifte, hårnett og skoskifte Ta prøver av råvarer som kommer inn i produksjonsmiljøet Unngå å ta inn utstyr som ikke er strengt nødvendig. Dersom du trenger utstyr utenfra, sørg for at det er godt vasket og desinfisert Sørg for tilstrekkelig hylle/benkplass og kroker for å unngå å legge utstyr på gulvet Husk at klær, hansker og fottøy også må holdes rene Ha tydelige rutiner for hygiene og sørg for opplæring av alle medarbeidere. Alle som arbeider i ysteriet skal forstå hensikten med og viktigheten av soneinndeling og en god hygiene for å sikre trygge produkter. Hva vet vi for lite om? Per i dag vet vi ikke nok om hvordan nærhet av dyrehold og produksjonsanlegg påvirker risikoen for Listeria-smitte. 6. Saltlake 6 Hva vet vi? Saltlake kan være smittekilde for Listeria o Listeria ble funnet i store mengder i saltlaken ved Listerioseutbruddet i 2007 hos osteprodusenten i Trøndelag. o Listeria kan overleve i saltlaker i et halvt år og lenger. o Forskjellige Listeria-stammer oppfører seg forskjellig i saltlake. Det ser ut som om de mest hissige sykdomsfremkallende bakteriestammene overlever best.
o Kar til saltlake er ofte plassert slik at det er kan være utsatt for drypp fra urene flater. o Listeria-bakteriens evne til å fremkalle sykdom svekkes ikke av lagring i saltlake. Rutiner for bruk og overvåking av saltlake o Saltkonsentrasjonen i laker hos produsentene varierer mye (15 til 25 %). o Kontrollrutinene for saltlake er mangelfulle ved at man styrer metning på grunnlag av utfellinger og ikke målinger. o Saltlaker skiftes sjelden eller aldri, men det å skifte saltlaker vil i utgangspunktet ikke øke tryggheten, siden Listeria overlever lenger i ferske saltlaker enn i brukte. o Jo lavere ph i saltlaken er desto kortere tid vil Listeria overleve. Hva kan vi gjøre? Sørge for at saltlaken er mettet o Selv om forsøk viste at litt lavere saltkonsentrasjon har større drapseffekt på Listeria enn tilnærmet mettet saltlake er det likevel viktig å sørge for metning i laken. Dette skyldes at det er mye lettere å kontrollere metning enn en gitt konsentrasjon på ca 15 %. o Det er viktig med god røring i saltlaken. Forskjellen i saltkonsentrasjon før og etter røring kan være så stor som 5 %. o Hvitt bunnfall i karet er ikke nødvendigvis salt. Sjekk at det ikke er andre ting, som for eksempel ostemasse! Metoder for å måle saltkonsentrasjon i laken gir sikrere styring. Unngå smitte fra omgivelsene o Ha alltid lokk på karet og unngå å sette karet under ventilasjonsanlegg, rør, eller andre ting som kan samle fuktighet og dryppe ned i karet. Tiltak for hemming og dreping av Listeria o Når det lages ny lake, sørg for at ph er tilpasset osten. Tilsett gjerne melkesyre eller myse for å oppnå det. Dette er gunstig både i forhold til kvalitet og hemming av Listeria.
o En mulighet å sikre at det ikke er Listeria til stede i saltlaken er å koke den, hvis det er praktisk mulig. Her må man ta hensyn til eventuelle effekter på kvaliteten på osten. Hva vet vi for lite om? Resultater viste at lavere saltkonsentrasjon (15 %) kan være gunstigere mht. drap av Listeria enn mettet saltlake (~25 %). Det er imidlertid farlig å anbefale lavere saltkonsentrasjoner siden det er mye vanskeligere å overholde 15 % enn metning. Det er likevel spennende å undersøke nærmere hvorvidt forskjellige saltkonsentrasjoner kan påvirke overlevelsen av Listeria. 7. Genetisk uttrykk og stabilitet 7 Hva vet vi? Listeria monocytogenes gir matbåren sykdom hos mennesker ved å invadere vev fra tarmen. Det vil si at det bare er Listeria som overlever gjennom magesyre, og deretter er i stand til å invadere celler som kan gi sykdom. Det finnes mange Listeriastammer, og noen har større evne til å gi sykdom enn andre. Tidligere undersøkelser i modellstudier har vist at saltlake kan dempe bakteriens evne til å gi sykdom, fordi evnen til å gå inn i humane celler svekkes. Da prosjektet startet visste vi ikke om dette også gjaldt for Listeria som var overført til ost via saltlake MLVA analyser av forskjellige Listeriastammer viste at de undersøkte DNAsekvensene i genomet (og dermed MLVA-mønsteret) forble uforandret etter langvarig eksponering til saltlaker (opp til 6 måneder). Dette er oppmuntrende fordi det betyr at metoden kan brukes i sporingsstudier, f.eks. ved smitteoppsporing og identifisering av stammer ved utbrudd. Listeria i ost overlever godt i syntetisk magesyre (saltsyre). Det spiller liten rolle om Listeria har blitt tilført osten via saltlake eller ikke. Listeria i ost uttrykker virulensgenene etter at den har blitt eksponert for syntetisk magesyre, men det er forskjell mellom stammer på hvor sterkt genene uttrykkes. Utbruddsstammen fra 2007 hadde en større evne til å uttrykke virulensgenene enn andre Listeria-stammer. Det betyr at utbruddsstammen har en større evne til å fremkalle sykdom etter eksponering til magesyre i magesekken, og kan være med på å forklare hvorfor utbruddet gav så alvorlig sykdom.
Listeria kan uttrykke virulensgener etter flere måneders lagring i saltlake Hva vet vi for lite om? Det er uklart hvorfor utbruddsstammen har en økt evne til å uttrykke virulensgener enn de andre Listeria-stammene og om dette er en av årsakene til at den ga opphav til sykdom. Det vil være nyttig å undersøke flere utbruddsstammer for å se om dette er et fellestrekk blant Listeria knyttet til sykdom hos mennesker. 1 Se også vedlegg Oppstart av nytt forskningsprosjekt om Listeria i småskala osteproduksjon 2 Se også vedlegg Forekomst og overvåking av Listeria i norsk småskala osteproduksjon. 3 Se også vedlegg Kan en mikrobiell bakgrunnsflora i ysterier påvirke risikoen for Listeria? 4 Se også vedlegg Listeria i småskala osteproduksjon overlevelse under uttørking og desinfeksjon? 5 Se også vedlegg Bruk av tre i kontakt med mat 6 Se også vedlegg Overlevelse av Listeria monocytogenes i saltlaker et problem i osteindustrien 7 Se også vedlegg ˮListeria-stammen i utbrotet med mjukost i 2007 hissigare enn andre Listeria-stammerˮ
Vedlegg populærvitenskapelige artikler Vedlegg 1: Oppstart av nytt forskningsprosjekt om Listeria i småskala osteproduksjon Vedlegg 2: Forekomst og overvåkning av Listeria i norsk småskala osteproduksjon Vedlegg 3: Bakgrunnsflora mot Listeria / Kan en mikrobiell bakgrunnsflora i ysterier påvirke risikoen for Listeria? Vedlegg 4: Listeria i småskala osteproduksjon overlevelse under uttørking og desinfeksjon Vedlegg 5: Bruk av tre i kontakt med mat Vedlegg 6: Overlevelse av Listeria monocytogenes i saltlaker et problem i osteindustrien Vedlegg 7: Listeriastammen i utbrotet med mjukost i 2007 hissigare enn andre Listeriastammer Vedlegg 8: Listeria i småskala osteproduksjon
Forekomst og overvåking av Listeria i norsk småskala osteproduksjon. Bjørn Schirmer, Solveig Langsrud, Therese Hagtvedt Nofima, Osloveien 1, 1430 Ås Siden Listerioseutbruddet i 2007 som kostet fem pasienter ved Rikshospitalet livet, har det vært økt fokus på trygghet ved produksjon av mykoster i Norge. Osten som var kilden til utbruddet ble produsert ved et gårdsysteri i Trøndelag. Da det ble tatt prøver i produksjonslokalet ble det funnet store mengder Listeria monocytogenes både på gulv, sluk, ostekasser og i saltlaken. Likevel ble det aldri oppklart hva som var den opprinnelige kilden til denne forurensningen. L. monocytogenes er en miljøbakterie som kan vokse på mange typer overflater og ved lave temperaturer og det er mange potensielle steder i et ysteri der bakterien kan trives. Spesielt i fuktige områder kan Listeria overleve, vokse og danne et reservoar av motstandsdyktige bakterier som ikke lar seg lett fjerne ved vask. Dette betyr at Listeria kan etablere seg både på overflater som kommer i direkte kontakt med ost, men også, og spesielt, i områder som er vanskelig tilgjengelige for vask. I første omgang er det derfor veldig viktig å unngå at Listeria kommer inn i produksjonsmiljøet, noe som i praksis oppnås ved en strikt inndeling mellom rene og urene soner. Deretter er det viktig å forhindre at Listeria etablerer seg i lokalene ved å ha gode rutiner for renhold av lokaler og utstyr. Men hvor utbredt er egentlig L. monocytogenes hos norske småskala osteprodusenter? Mens de store aktørene på markedet har innarbeidet omfangrike sikkerhetsrutiner med regelmessige prøvetakinger og til dels egne laboratorier, har ikke småskalaprodusentene de samme ressursene til å opprettholde tilsvarende rutiner. En spørreundersøkelse i regi av Nofima Mat på Ås viste at, blant de 37 produsenter som besvarte undersøkelsen, var det kun fire som noensinne hadde funnet L. monocytogenes i produkt og to som hadde funnet L. monocytogenes i produksjonsmiljøet. Alle disse tilfellene var enkelttilfeller som ikke gjentok seg og dermed sannsynligvis sporadiske funn. Samtidig viste spørreundersøkelsen at prøvetaking av melk, produkt og miljø med få unntak skjer maksimalt en gang i måneden eller noen få ganger i året. Med så lav prøvetakingsfrekvens er det vanskelig å danne et sikkert grunnlag for å uttale seg om forekomst av Listeria. Gjennomføring I prosjektet Listeria monocytogenes i norsk småskala osteproduksjon i regi av Nofima Mat har det blitt gjennomført mer omfattende prøvetaking. Sju forskjellige gårdsysterier ble besøkt og prøver for L. monocytogenes ble tatt fra produksjonsmiljøet ved hver anledning. I prøvetakingen ble det fokusert på områder man vet potensielt kan være nisjer for Listeria og områder hvor risiko for smitte av produkt anses for høy (se tabell). Samtidig som det ble tatt rundt 20 prøver hos hver produsent med ordinære prøvetakingsmetoder ble det testet to alternative hurtigmetoder (alt-i-ett hurtigsvabere). Fordelen med disse hurtigmetodene er at hele påvisningen av Listeria sp. skjer i ett rør. Disse analysene kan dermed lett gjennomføres av enhver produsent selv og det er ikke nødvendig å sende prøver til laboratorier for undersøkelser. Prisen på disse svabrene er rimelig, slik at de
skulle kunne bidra til enklere og billigere analyser, som muliggjør hyppigere prøvetaking hos produsentene. Det må nevnes at disse hurtigmetodene i utgangspunktet er beregnet for hygieneprøver etter renhold, og ikke tidligere har vært testet i miljøer med kraftig bakgrunnsflora. Prøvetakningsmetoder som ble benyttet i prosjektet var: 1. Prøvetakingssvabere med Letheen buljong (3M) for et prøvetakingsareal på 5x5 cm (Bilde 1) 2. Prøvetakingskluter (SodiBox) for et prøvetakingsareal på 25x25 cm (Bilde 2 og 5) 3. Selektiv alt-i-ett Listeriasvaber Insite (Labolytic) for et prøvetakingsareal på 5x5 cm (Bilde 3 og 6) 4. Selektiv alt-i-ett svaber PathCheck (Interfarm) for et prøvetakingsareal på 5x5 cm (Bilde 4 og 7) 1 3 4 2 6 7 5 Bilder: 1: Prøvetakingssvabre med Letheen buljong (3M), 2: Prøvetakingskluter (SodiBox), 3: Selektiv alt-i-ett Listeriasvaber Insite (Labolytic), 4: Selektiv alt-i-ett svaber PathCheck (Interfarm), 5: Prøvetakingsklut etter positiv reaksjon med Listeria-selektiv half-fraser broth, 6: InSite svaber, negativ prøve til venstre, positiv prøve til høyre, 7: PathCheck svaber, negativ prøve til venstre, positiv prøve til høyre De vanlige svaberne og klutene (1. og 2.) ble analysert for Listeria med half-fraser broth, Fraser broth og selektive agarskåler som beskrevet i standard metodikk (NMKL metode 136). For selektive svabere (3. og 4.) som slo positivt ut ble det undersøkt om det virkelig var Listeria som ga et utslag, eller en annen bakterie, ved hjelp av NMKL-metoden. Det ble også undersøkt hvilke bakterier som kunne gi falske positive utslag ved å sekvensere isolatenes DNA og sammenlikne med sekvenser i sekvensdatabaser.
Resultater Det ble ikke funnet Listeria monocytogenes i noen av bedriftene, til tross for intensiv leting. Det ble imidlertid funnet en ufarlig type Listeria i en av bedriftene. Dette kan være en indikasjon på at rutinene bør skjerpes, siden tilstedeværelsen av en type Listeria kan tyde på at også farligere varianter av bakterien kan nå inn i produksjonen og overleve der. Selv om disse resultatene er svært oppløftende for norske småskala osteprodusenter, er det viktig å huske at sju ysterier kun er en liten del av alle produsentene i Norge. De produsentene som ble besøkt hadde dessuten svart på spørreundersøkelsen og vist interesse i Listeriaproblematikken. Dermed er de muligens også spesielt opptatt av å tilpasse rutinene sine til denne risikofaktoren. Hvordan situasjonen er hos andre produsenter kunne ikke dette prosjektet belyse. Resultatene av prøvetakingen med de kommersielle hurtigtestene var imidlertid skuffende. De selektive svabrene viste seg å være lite selektive, og resulterte i mange falske positive resultater. Grunnen til dette var at andre bakterier som er til stede i produksjonsmiljøene, spesielt Enterokokker, også ga positivt utslag. Som resultat av dette, må alle positive prøver testes videre med mer avanserte dyrkningsmetoder i laboratorier eller DNA-teknologi for å fastslå om det virkelig er Listeria til stede. Dermed går gevinsten i tid og penger tapt og det blir lite hensiktsmessig å bruke disse typer tester hos småskala osteprodusenter.. Tabell: Viktige prøvepunkter ved Listeriaovervåking Rom Prøvepunkter Mulig Listerianisje Garderobe Gulv, underside X støvler Ysteri Sluk, gulv X Ysteri Osteformer, slanger Ysteri/modningsrom List under dør, X hjul Modningsrom Saltlake, X modningsrister Modningsrom Gulv, sluk X Alle rom Kondensdrypp X (X) Kontaktflate produkt X X
Listeria i småskala osteproduksjon overlevelse under uttørking og desinfeksjon? Bjørn Tisjø Schirmer, Solveig Langsrud og Trond Møretrø Nofima AS, Osloveien 1, 1430 Ås Listeria monocytogenes har i en årrekke vært en av de mest fryktede sykdomsfremkallende bakterier som kan smitte via mat. For å unngå smitte til mat har matindustrien utviklet vaskeog desinfeksjonsrutiner som skal forhindre at Listeria etablerer seg i produksjonsanlegg. Samtidig har det vært fokus på å holde produksjonsanlegget rent og tørt når det ikke er i bruk. Siden Listeria trives dårlig i tørre omgivelser vil dette bidra til å redusere risikoen for Listeriasmitte til mat. Hvordan oppfører Listeria seg ved en gjentatt vask- og desinfeksjon? Flere studier i senere tid har imidlertid vist at vask og desinfeksjon ikke nødvendigvis er tilstrekkelig til å kvitte seg med uønskede bakterier når de først har nådd inn i produksjonsmiljøet. Som en del av prosjektet Listeria monocytogenes i norsk småskala osteproduksjon har Nofima i samarbeid med det franske institutt for mattrygghet (ANSES) nå sett nærmere på hvordan L. monocytogenes oppfører seg når den blir utsatt for regelmessig vask og desinfeksjon. Målet med forsøket var todelt. For det første ønsket vi å finne ut om Listeria kan overleve slike vaske- og desinfeksjonsrutiner, og om en gjentatt desinfeksjonsprosess på overflater gjør at Listeria utvikler resistens mot desinfeksjonsmiddelet eller selekterer for enkeltbakterier med høyere overlevelsesegenskaper. For det andre ville vi se om skadede bakterier kan reparere seg og vokse dersom de blir gitt nok tid mellom desinfeksjonssyklusene. Under flere bedriftsbesøk ble de ytre betingelsene i produksjonslokalene og modningsrom (temperatur og luftfuktighet) kartlagt, og disse dataene ble brukt som grunnlag i modellforsøk som ble gjennomført i laboratoriet ved ANSES og Nofima. Resultatene av modellforsøkene viste at Listeria under visse betingelser kan overleve til tross for regelmessig vask og desinfeksjon. I modellen ble det brukt keramiske gulvfliser som overflate. Flisene ble påført L. monocytogenes og bakteriene fikk en dag for å feste seg til overflaten før flisene ble skylt og desinfisert en gang daglig med vann og et klorholdig basisk desinfeksjonsmiddel i fire dager. Ved ukeslutt ble det tilsatt næring i form av en fortynnet skummetmelkløsning og flisene ble oppbevart ved 20 C. Etterfølgende mandag fortsatte daglig renholdsprosedyre. Resultatene i startfasen av forsøkene var som forventet: Listeriatallet ble redusert kraftig under vask og desinfeksjon. Det ble tatt prøver hver dag i forsøket, og mot slutten av en uke med daglig vask og desinfeksjon var de fleste prøvene negative for L. monocytogenes. Det man imidlertid så var at dersom det var tilgang til næring i løpet av helga (for eksempel melkesøl) og det ikke ble vasket og desinfisert de to dagene, kunne det på nytt vokse opp Listeria til svært høye tall. Dette ble også observert på overflater som før helga hadde blitt testet negativt for Listeria flere dager på rad. Det var likevel ikke slik at bakterietallet økte under uken, mens desinfeksjon pågikk, dvs. det ble ikke påvist resistensutvikling eller seleksjon av spesielt robuste bakterier. Det er uklart hvorfor Listeria ikke kan detekteres før helga når den åpenbart er til stede, siden den vokser opp igjen i løpet av en helg. Det kan skyldes at Listeria finner gjemmesteder på den noe ujevne overflaten, men det kan også skyldes at Listeria blir skadet eller går inn i en dvalemodus under desinfeksjon og trenger noen dager i mindre stressende omgivelser før den
igjen kan begynne å vokse. Uansett viser resultatene at negative Listeriaprøver ikke er noen garanti for at det ikke er Listeria til stede. Hvordan påvirker varierende produksjonssykluser overlevelse av Listeria? Resultatene fra renholdsforsøkene viser også at det er viktig at Listeria ikke får tilgang til næring etter vask og desinfeksjon. Det er med andre ord viktig at anlegget holdes tørt og rent mellom produksjoner. Små gårdsprodusenter av mat har gjerne en uregelmessig produksjonssyklus, og i perioder kan anlegget stå ubrukt i flere dager eller uker i strekk. Vi ville derfor finne ut hvordan perioder uten produksjon påvirker overlevelsen av Listeria, sammenliknet med perioder med regelmessig produksjon. Målinger viste at luftfuktigheten i ysteriet lå rundt 40 % mellom produksjoner, mens den under produksjon kunne stige til 70 80 %. Disse dataene ble brukt i modellforsøk i laboratoriet ved Nofima. Resultatene av modellforsøkene viste at Listeria ikke vokser, men at de likevel overlever godt, selv i lange perioder med lav luftfuktighet. Selv om bakterietallet ble redusert med mellom 90 og 99 % i løpet av tre til fire uker, vil det være mer enn nok bakterier til stede som kan begynne å vokse når næring tilføres. Det viste seg også at det hadde lite å si for overlevelsen om det var hyppig eller sjelden fuktighet som tilsvarer produksjonsliknende forhold, så lenge anlegget ble holdt tørt mellom produksjonene. I modningsrom med luftfuktighet over 90 % vil Listeria kunne overleve nærmest ubegrenset. Oppsummering Resultatene av disse studiene viste at Listeria er i stand til å overleve to viktige stressfaktorer de møter i næringsmiddelproduksjon desinfeksjon og tørke. Selv om begge faktorene påvirker overlevelsen av Listeria og reduserer dens forekomst, vil det likevel være mulighet for at en del av bakteriene overlever og blomstrer opp når de får ny tilgang til næring. Det er derfor viktig å redusere tilgang til næring i form av søl så mye som mulig under hele produksjonsprosessen og sørge for at vask- og desinfeksjonsrutiner gjennomføres regelmessig og uten lengre opphold. Videre kan det være nyttig å ta Listeriaprøver i starten av produksjonen, siden man ikke kan være sikker på at prøver tatt rett etter vask og desinfeksjon vil vise om det er Listeria til stede. Listeria monocytogenes: Sykdomsfremkallende bakterie som kan smitte via mat Sjelden, men svært alvorlig sykdom 25 % dødelighet, mer enn 90 % sykehusinnleggelser Hovedsakelig folk i risikogrupper som rammes eldre, gravide, nedsatt immunforsvar Listeria trives best der det er fuktig Kan vokse ved lave temperaturer Vanlige tiltak mot Listeria i bedrift er vask og desinfeksjon
Prosjektet Listeria monocytogenes i norsk småskala osteproduksjon Varighet: 1.8.2009 31.10.2011 Samarbeid mellom Nofima, Veterinærinstituttet, Norsk folkehelseinstitutt, Mattilsynet, Norsk Gardsost, Hanen, Sogn Jord- og hagebrukskole, Fjordane fylkeskommune, Innovasjon Norge, norske småskala osteprodusenter, ASNES og Actilaît Finansiert av Fondet for forskningsavgift på landbruksprodukter (FFL) og midler over Jordbruksavtalen (JA) Målet er å øke kunnskapen om risiko for L. monocytogenes i produksjonsmiljø Overlevende Listeria etter vask og desinfeksjon log cfu / ml 8 7 6 5 4 3 2 1 0 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 Tid (d) Figur 1: Resterende Listeria etter vask og desinfeksjon. Renhold ble ikke gjennomført i helgene (dag 8/9 og dag 15/16)
Overlevelse av Listeria monocytogenes i saltlaker et problem i osteindustrien Bjørn Schirmer, Solveig Langsrud, Even Heir Nofima, Osloveien 1, 1430 Ås Salting før lagring er et viktig steg i produksjonen av de fleste ostetyper. Mens noen ostetyper saltes ved å gni overflaten med tørt salt, blir de fleste ostene dyppet i et kar med saltlake i alt fra noen minutter til flere timer. Når produsentene lager fersk saltlake finner de ofte at de første par produksjonene av ost ikke blir like vellykket som vanlig. Dette skyldes at betingelser i saltlaken, som for eksempel ph og innhold av melkesyre, fett og proteiner trenger et par runder for å oppnå en likevekt med osten. Dette er en viktig grunn til at mange produsenter velger å ikke skifte ut saltlaken sin og bruker den samme laken i flere måneder eller år. I Listerioseutbruddet i 2007 som kostet fem pasienter ved Rikshospitalet livet, var det mykost produsert av pasteurisert melk, som var årsaken. Nærmere undersøkelser viste at saltlaken hos produsenten inneholdt store mengder Listeria monocytogenes. Flere vitenskapelige studier har vist at L. monocytogenes kan overleve i uker og måneder i saltlaker, og dette har reist spørsmål om sikkerheten ved bruken av saltlaker til salting av ost. Så langt har rådene til produsentene vært klare metning av saltlaken er det viktigste for å unngå oppvekst og overlevelse av sykdomsfremkallende bakterier. Metning oppnås som regel ved at det tilføres ferskt salt etter hver produksjon eller med jevne mellomrom. Bunnfall av salt i karet blir brukt som indikator for at løsningen er mettet. Et forskningsprosjekt styrt av Nofima Mat på Ås har som mål å undersøke forekomsten av Listeria i småskala osteproduksjon og kartlegge forhold som kan påvirke denne. Blant annet har det vært fokusert på overlevelse av L. monocytogenes i saltlaker. Så langt er det ikke kjent om det faktisk er gunstig eller ugunstig å skifte saltlake jevnlig i forhold til å forhindre smitte av produktene med Listeria. Et delmål var derfor å finne ut om Listeria oppfører seg forskjellig i fersk og brukt saltlake. Til dette ble det samlet inn og analysert saltlaker fra fire forskjellige norske gårdsprodusenter. Analyseresultatene viste at, selv om metning regelmessig ble kontrollert ved å sjekke for bunnfall, varierte saltinnholdet i lakene mellom 14 og 25 % - en ren, mettet saltlake holder rundt 30 %. Videre ble det undersøkt i hvilken grad Listeria kunne overleve over tid i saltlakene. I laboratoriet ble det tilsatt fem forskjellige Listeriastammer til tre forskjellige brukte saltlaker og en fersk, mettet saltlake. Saltlakene ble oppbevart ved 12 C som er den mest vanlige temperaturen i modningsrom der saltlakenene som regel oppbevares, og det ble jevnlig tatt ut prøver for Listeria-analyse. Noe overraskende viste resultatene at Listeria overlevde bedre i fersk saltlake enn i de brukte, selv om saltkonsentrasjonen var høyest i den ferske. Det var også en tydelig forskjell på de fem stammene og resultatene viste at stammen som var ansvarlig for utbruddet i 2007 var en av de som overlevde best. Konklusjonen var at det ikke er noen automatikk i at høy saltkonsentrasjon betyr lavere overlevelse av Listeria. En mulig forklaring på dette kan være at de brukte lakene var surere enn den ferske laken (ph 4.5-5.0, sammenliknet med 5.8). Dette er interessant for produsentene,
siden ph er en parameter som relativt lett kan måles og endres innenfor visse rammer med den forutsetning at laken ikke forandrer produktets smak og tekstur. En ny forsøksserie der det kun ble brukt ferske laker ble startet for å se nærmere på hvordan saltkonsentrasjon og ph påvirker overlevelse av Listeria. Det ble undersøkt saltkonsentrasjoner mellom 15 % og 25 % og ph mellom 4,5 og 6. Som forventet døde Listeria raskere ved lav ph. Samtidig ble det bekreftet at høy saltkonsentrasjon ikke betyr mest drap. Mens Listeria overlevde godt med 20 % salt var det større nedgang i bakterietall med 25 % salt og overraskende med 15 % salt. Faktisk var det laken med kombinasjonen av mest nøytral ph og minst salt som hadde best drapseffekt på Listeria stikk motsatt av hva man intuitivt skulle forvente. Det er ikke klart hva dette skyldes, men en sannsynlig teori er at Listeria ved lave saltkonsentrasjoner opprettholder en viss metabolsk aktivitet, dvs. at de fortsetter å bruke energi og dermed sliter seg ut. Ved mer ekstreme betingelser, dvs. høyere saltkonsentrasjoner, kan de gå i en dvaletilstand der de ikke lenger er metabolsk aktive. I denne tilstanden kan de ligge og overleve i lang tid for så plutselig å vekkes til live igjen når de ytre betingelsene er bedre. Selv om disse resultatene er spennende sett med forskerøyne byr de på nye utfordringer for osteprodusentene. Det kan se ut som om saltlake, selv med høye saltkonsentrasjoner, kan være et reservoar for sykdomsfremkallende bakterier. Det er derfor svært interessant at lavere saltkonsentrasjoner kan øke tryggheten med tanke på overlevelse av Listeria. Samtidig er dette en kompleks problemstilling. Hvilken saltkonsentrasjon som er best med tanke på overlevelse av Listeria er igjen avhengig av andre betingelser, som for eksempel ph. Dermed blir det fort veldig vanskelig for en produsent å treffe akkurat de rette betingelsene. Videre må det til mer avanserte kontrollrutiner som sikrer at ikke betingelsene endrer seg underveis i prosessen. Det er dessuten farligere å ende opp med for lav saltkonsentrasjon enn for høy. Ved for høye konsentrasjoner vil bakteriene tross alt gå inn i en dvalemodus mens de ved for lave konsentrasjoner faktisk kan vokse og formere seg. Derfor er det sannsynligvis tryggest å holde på en høyest mulig saltkonsentrasjon og jobbe med andre tiltak for å redusere risikoen for at Listeria finner veien inn i saltlaken i første omgang.
Artikkelmanus til Gardsosten, studium i ListRisk prosjektet utført på Veterinærinstituttet Tittel: Listeriastammen i utbrotet med mjukost i 2007 hissigare enn andre Listeriastammer Av: Taran Skjerdal, Tone Mathisen Fagereng og Elin Reitehaug, Veterinærinstituttet Det har gått nokon år sidan det tragiske listerioseutbrotet på Rikshospitalet og Radiumhospitalet. Kjelda var camembertost frå ein småskalaprodusent. Korleis kunne det gå så gale? Vi har studert utbrotstamma og funne nokon svar. Bakteria Listeria monocytogenes gjev sjukdomen listeriose. Det er ein svært alvorleg sjukdom som kan gje varige skader og i verste fall død. Foster, barn, eldre og personar med nedsett immunforsvar er mest utsette for smitte og for å få alvorlege symptom. Smitte av Listeria monocytogenes kjem som oftast via mat, men for at mat skal gje sjukdom, må den innehalde Listeria over eit visst antal, dernest må bakteria overleva gjennom magesyre, og deretter gå inn i kroppsvevet frå tarmen. Mjuke og halvfaste ostar er kjent som risikoprodukt for Listeria, og gravide og folk med nedsett immunforsvar blir frårådde å eta slik ost. Før utbrotet i 2007 galdt rådet berre ost av upasteurisert mjølk, men etter utbrotet varr det utvida til ost av pasteurisert mjølk også. Ein trur at kjelda til Listeria i osten som gav utbrot i 2007 var saltlaken, fordi same stamme vart funnen der som i pasientane. Det er kjent at Listeria kan overleva lenge i saltlake, men, forsking dei siste åra har tyda på at Listeria mistar noko av evna til å gå inn i kroppsvev når den har vore ei tid i ca 20 % saltlake, og dermed fått nedsett evne til å påføre sjukdom. Det har ikkje vore kjent om Listeria blir varig endra etter ei tid i saltlake, eller om evna til å gå inn i kroppsvev kjem tilbake etter ei tid. Om effekta er varig, ville det vera eit teikn på at det slett ikkje var saltlaken, men noko anna som var kjelde til Listeriabakteriene i osten som gav utbrotet i 2007. Dette ville vi undersøke. Vi kjøpte ostemasse til studia våre frå ein produsent av Camembert. Vi tilførte Listeria til massen og modna massen på laboratoriet ved 12 grader og deretter ved 4 grader, slik produsenten fortalde oss. Etter modning målte vi Listeriatalet i osten. Vi blanda så osten med saltsyre, tilsvarande surleiksgraden som er i magesyre, for å etterlikne kva bakteria går gjennom når eit menneske et osten, og så målte vi Listeriatalet på nytt. Til sist undersøkte vi i kor stor grad virulensgena i Listeria vart uttrykte etter at den hadde vore gjennom magesyre. Til dette brukte vi moderne molekylærbiologiske metoder, kalla rt-real time PCR teknikk. Vi brukte fire Listeriastammer i forsøka: stamma som gav utbrot i 2007, ei anna stamme frå ost, samt ei normalvirulent og ei lågvirulent stamme som vi før hadde studert på liknande måte i andre matvarer. Kvar av desse fire stammene vart testa utan at dei hadde vore i saltlake, og etter at dei hadde vore 200 dagar i saltlake. Listeria voks til svært høgt antal i osten i løpet av modningstida. Dette var som forventa. Det at Listeria veks i ost, sjølv ved normalt modningsforløp, er nettopp grunnen til at mjuke og halvfaste ostar er risikoprodukt for Listeria. Ost blir eten utan varmebehandling, gjerne etter nokon timar eller dagar ved romtemperatur for å få fram den beste smaken. Resultatet av dette
er at antalet Listeriabakterier i Camembert og tilsvarande ostar kan bli svært høgt, sjølv om antalet er lågt tidleg i modninga. Det viste seg også at alle Listeriastammene vi testa overlevde godt i syntetisk magesyre. Antalet Listeria etter magesyre var 30-70 prosent av det det var i Camembertosten før vi hadde den i magesyre. I andre matvarer, for eksempel laks, blir Listeriatalet etter magesyre berre 1-10 % av det opprinnelege. Dette betyr at magesyre ikkje er eit særleg effektivt hinder for Listeria i Camembert. Dei to første føresetnadene for at Listeria i Camembert skal gje sjukdom, at den må finnast i høgt tal i maten og overleva gjennom magesyre, var altså oppfylte for alle Listeriastammene vi undersøkte. Siste test var om virulensgena til bakterien vart uttrykte. Dette testa vi på fleire kombinasjonar: Ost med Listeria som hadde vore i saltlake og ikkje, ost som hadde vore blanda med syntetisk magesyre og ikkje, og ost som hadde vorte temperert ved romtemperatur før den vart blanda med syntetisk magesyre. Her kom det fram forskjellar mellom Listeriastammene. Alle stammene uttrykte virulensgena enten dei kom frå saltlake eller ikkje. Temperering av osten hadde heller ikkje så stor påvirkning. Derimot hadde blanding med syntetisk magesyre ulik effekt på stammene. For den eine Listeriastamma gav magesyrebehandlinga ingen påviseleg nedgang i virulensuttrykk, men, for dei tre andre vart uttrykket redusert med heile 60-90 %, Sjølv om infeksjonsmekanismene til Listeria er mykje meir samansette enn vi har kunna undersøke i dette studiet, er det grunn til å tru at den første stamma har større potensiale til å påføre sjukdom enn dei tre siste. Stamma som skilde seg ut som meir virulent enn dei andre var utbrotsstamma frå 2007. Kva kan ein så lære av dette? Utbrotet i 2007 var ein sum av uheldige hendingar. Det var ei spesielt hissig Listeriastamme, eit matprodukt der den fekk vekse til høge antal, og osten vart gjeve til personar/pasientar som var spesielt sårbare. Studia viser at saltlaken godt kan ha vore smittekjelde for Listeria i osten som gav sjukdom og død i 2007. Det gjev imidlertid ikkje grunn til å sjå på saltlake som ei farlegare smittekjelde enn andre smittekjelder i produksjonslokalet. Sjølv om Listeria kan overleva i saltlake, så kan den ikkje vekse der. Det betyr at smitte frå saltlake kan samanliknast med eit gamaldags stempel utan stempelpute: Dei første merka blir tydlege, men dersom ikkje smitten (trykksverta) blir tilført på nytt, blir smitten (stempelmerket) etter kvart borte. Kanskje var det dette som gjorde at utbrotet ikkje fekk endå større konsekvensar enn det gjorde. Om kjelda verkeleg var saltlaken, kan det ha vore massiv smitte i nokon ostar, men lite og ingenting i dei andre ostane i partiet. Hadde kjelda vore ein stad der Listeria kunne vekse, og som alle ostar hadde vore i kontakt med, kan ein frykte at ein endå større del av partiet ville ha vorte smitta, og endå fleire personar kunne vorte ramma. Lærdomen er derfor at ein ikkje kan rekne med at anlegget er Listeriafritt dersom saltlaken er Listeriafri, for Listeria kan vera over alt. Så, andre miljøprøver er vel så viktige som prøver av saltlake. Studiet er gjennomført i prosjektet: Listeria i småskala osteproduksjon, NFR