Biomanipulasjon og endosymbiose - en fremtidig løsning på flåttplagene? 1 ERIK GEORG GRANQUIST, 2 PER-ERIC LINDGREN; 3 ANDREAS MATUSSEK, 3 MALIN KRISTIANSSON, 1 WENCHE OKSTAD, 1 SNORRE STUEN. 1 Norges veterinærhøgskole, 2 Linköpings universitet, 3 Länssjukhuset Ryhov, Jönköping. Bakgrunn Flått har en nærmest global utbredelse og flåttbårne sykdommer er et økende problem både for dyr og mennesker. Eksempler på sykdomsfremkallende bakterier som overføres med flått er; Borrelia spp., Anaplasma phagocytophilum, Francisella spp., Rickettsia helvetica, Bartonella spp., Babesia spp. og tick-borne encephalitis(tbe) virus. Klimatiske forhold kan virke inn på en stadig større geografisk utbredelse av flått, men andre faktorer som endringer i viltpopulasjoner, fugletrekk og beiteforhold spiller også en viktig rolle. Rundt 80 % av verdens storfepopulasjon er eksponert for flått, noe som gjør flåtten til den ektoparasitten med størst økonomisk betydning for husdyrproduksjon på verdensbasis. Årlig smittes om lag 300.000 lam med flåttbakterien A. phagocytophilum (sjodogg-bakterien) i Norge. Dette påfører landbruket et årlig tap på over 30 mill. NOK og store dyrevelferdsmessige utfordringer. I nyere tid har det blitt et økende fokus på biologiske virkemidler for kontroll av flåttpopulasjoner og sykdommer som følge av en økende resistensutvikling hos parasitter og mikrober. Flåttens sykdomsfremkallende smittestoff har fått mye oppmerksomhet, men flåtten bærer også ikke-patogene organismer som antakeligvis er endosymbionter. Én teori er at endosymbionter tidligere har vært sykdomsfremkallende smittestoff hos dyr som flåtten en gang i løpet av evolusjonen har tilegnet seg ved blodsuging. Disse kan få stor betydning i biologisk kontroll av flåttsykdommer i framtida. Et pilotprosjekt ble startet opp i 2010. Målet var å undersøke om symbionter som Midichloria forekommer hos flått (Ixodes ricinus) og sau/vilt i norsk fauna. Rogaland og Sunnhordland ble valgt ut som områder for prøvetaking da dette er regioner der flått og flåttrelatert sykdom er svært utbredt. Midichloria mitochondrii Midichloria mitochondrii ble først beskrevet i 2004 (Beninati et al, 2004) (Mikroben har forøvrig fått navnet sitt etter midi-chloriene i Star Wars etter samtykke fra George Lucas). Denne encellete bakterien er påvist i eggceller og andre ovarieceller fra flått. Den finnes ikke bare i cytoplasma, men også i cellens mitokondrier, noe som kan bety at den er involvert i vert-organismens energiomsetning. I motsetning til A.phagocytophilum, overføres Midichloria vertikalt mellom flåttgenerasjoner ((I. ricinus). DNA av Midichloria og nært beslektede bakterier er tidligere påvist hos pattedyr og en helt fersk studie fra Italia påviste også Midichloria fra spyttkjertler hos I. ricinus og en serologisk prevalens av Midichloria på 58 % (n=80) hos humane pasienter med flåttbitt. Hos friske blodgivere var prevalensen kun 1,2 % (n=169)(skarphedinsson et al, 2005;Mariconti et al, 2012). Følgende spørsmål kan da stilles: Har M. mitochondrii en biologisk funksjon hos flåtten (reproduksjon/energiomsetning)? Er bakterien, i stand til å infisere flåttens spyttkjertler og overføres den til pattedyr ved blodsuging og mellom flått ved suging (co-feeding)?
Hovedproblemstilling Prosjektet hadde som mål å undersøke om symbionter, og særlig M. mitochondrii, forekommer hos flått og sau/vilt i Norge. Resultater Det er samlet inn 76 blodprøver fra sau, 533 flåttprøver fra terrenget, 14 vevsprøver (12 fra hjort, 2 fra sau). Vevsprøver fra hjortedyr er tatt ut under jakta høsten 2010 i samarbeid med lokale jegere og blodprøver fra sau er samlet fra tre geografiske områder langs kysten av Sør- Norge gjennom flåttsesongen 2010. De foreløpige resultatene konsentrerer seg kun om flåttprøver da prøvene fra dyr ikke er ferdig analysert. Prøvene ble analysert for forekomst av Borrelia spp., Anaplasma phagocytophilum, Rickettsia spp., Wolbachia pipientis og Midicloria mitochondrii med spesifikke primere ved PCR-amplifisering av områder i bakteriens DNA. Larver og nymfer ble analysert i «pools» på fem stk. og voksne som enkeltindivider. Tabell 1. Fordelingen av flåttprøvene samlet fra tre ulike områder i Sunnhordaland (SH) og Rogaland (R). Nymfer og Larver ble analysert i pools på 5 flått. *Voksne ble analysert enkeltvis.
Figur 1. Figuren viser fordelingen av forekomsten av Anaplasma phagocytophilum hos flått fra tre ulike områder i Sunnhordaland og Rogaland. Figur 2. Figuren viser fordelingen av forekomsten av Borrelia spp. hos flått fra tre ulike områder i Sunnhordaland (Tysvær og Etne) og Rogaland (Sandnes). Figur 3. Figuren viser fordelingen av forekomsten av Rickettsia spp. hos flått fra tre ulike områder i Sunnhordaland og Rogaland. Det var 13/84 positive flåttprøver som inneholdt to eller tre agens (co-infiserte). Blant disse var det én flått (nymfe) som inneholdt Borrelia, Anaplasma og Midichloria (7,70 %), åtte flått (kun nymfer) som inneholdt Borrelia og Midichloria (61,54 %), to flått (kun voksne) som inneholdt Anaplasma og Midichloria (15,38 %) og to flått (en voksen og en nymfe) som inneholdt både Rickettsia og Midichloria (15,38 %). Blant de infiserte prøvene som fikk påvist kun ett agens (71/84) var det én flått som inneholdt kun Borrelia (1,40 %), to med kun Rickettsia (2,82 %), to kun Anaplasma (2,82 %) og 66 kun Midichloria (92,96 % ).
Figur 4. Figuren viser prosentvis fordelingen av flått positive for Midichloria i de ulike utviklingsstadiene fra tre ulike områder i Sunnhordaland og Rogaland. Antall positive prøver (totalt) fra hvert område var; Tysvær 51/93, Etne 14/42, Sandnes14/17. Det er spesielt nymfestadiene som viser høy forekomst av M. mitochondrii. Diskusjon Tidligere studier har vist at nesten 100 % av hunnflått er bærere av M. mitochondrii (Lo et al, 2006). Flåtten ble ikke skilt på kjønn i denne studien. I denne studien ble M. mitochondrii funnet i 100 % av larveprøvene, 60,44 % av nymfeprøvene og 35,09 % av voksne flått. Resultatene viser at kun enkelte av de voksne individene synes å være bærere, noe som kan bety at viktigheten i forplantning har en mindre betydning enn tidligere antatt. På den annen side, er dette vanskelig å slå fast da individene ikke ble separert på kjønn. Det er imidlertid interessant at samtlige larveprøver (kun representert som 2,63 % av prøvene og 3,76 % av individene) og en stor andel nymfer er positive for M. mitochondrii. Dersom dette gjenspeiler virkeligheten, kan det bety at Midichloria er en viktig del av de tidlige utviklingsstadiene (larve og nymfe). Om alle larvene og nymfene var smittet gjenstår imidlertid å undersøke, siden de i denne studien var «poolet». Det er altså nye spørsmål som utkrystalliserer seg med disse resultatene. Hva skjer i de ulike gruppene dersom man fjerner Midichloria? Vil noen av de fysiologiske prosessene som for eksempel forplantning og metabolisme endres? Videre er det ønskelig å undersøke om denne endosymbiosen er involvert i overføring av sykdomsfremkallende smittestoff da det ikke ble påvist kombinasjoner av to eller flere smittestoff uten at Midichloria var til stede. Videre undersøkelser Basert på resultatet av denne studien bør det gjennomføres et større forskningsprosjekt vedrørende betydningen av endosymbionter hos flått i Norge og Skandinavia. Det er viktig å kartlegge nærmere om bakteriene har en biologisk betydning hos flått og vertsdyr. Tidligere studier har indikert at symbionter kan spille en viktig rolle i flåtten fysiologi og påvirke populasjonsdynamikken samt innvirke på overføringen av patogene rickettsier (Baldridge et al, 2005). Endosymbionter forårsaker endringer i forplantningsevnen hos en rekke insekter ved å bidra til tidlig embryodød, male killing, forskjøvet kjønnsratio (parthenogenesis:
haploide egg utvikles til levende hunner), feminisering (kjønnsskifte fra hann til hunn) og mislykket paring mellom infiserte hanner og uinfiserte hunner eller individer infisert med ulike stammer av symbionter (cytoplasmisk inkompatibilitet). Sistnevnte kan resultere i sterile hanner eller mangel på avkom (Breeuwer & Werren, 1990;Zchori-Fein et al, 2004). Denne inkompatibiliteten kan ha stor evolusjonsmessig betydning ( speciation ) og være svært viktig for genetisk manipulasjon av flåttbestanden ved introduksjon av symbionter. Dette kan videre brukes til å redusere dyre og folkehelseproblemer knyttet til flått (O'Neill et al, 1992). Videre vil det være viktig å vurdere hvorvidt mennesker og dyr kan være bærere av endosymbionter som ledd i en fremtidig strategi for bruk av endosymbionter i populasjonskontroll og biomanipulasjon. Referanser Baldridge,G.D., Burkhardt,N., Herron,M.J., Kurtti,T.J., & Munderloh,U.G. (2005) Analysis of fluorescent protein expression in transformants of Rickettsia monacensis, an obligate intracellular tick symbiont. Applied and Environmental Microbiology, 71, 2095-2105. Beninati,T., Lo,N., Sacchi,L., Genchi,C., Noda,H., & Bandi,C. (2004) A novel alpha-proteobacterium resides in the mitochondria of ovarian cells of the tick Ixodes ricinus. Applied and Environmental Microbiology, 70, 2596-2602. Breeuwer,J.A.J. & Werren,J.H. (1990) Microorganisms Associated with Chromosome Destruction and Reproductive Isolation Between 2 Insect Species. Nature, 346, 558-560. Lo,N., Beninati,T., Sassera,D., Bouman,E.A.P., Santagati,S., Gern,L., Sambri,V., Masuzawa,T., Gray,J.S., Jaenson,T.G.T., & Bouattour,A. (2006) Widespread distribution and high prevalence of an alphaproteobacterial symbiont in the tick Ixodes ricinus. Environmental Microbiology, 8, 1280-1287. Mariconti,M., Epis,S., Gaibani,P., Valle,D.C., Sassera,D., Tomao,P., Fabbi,M., Castelli,F., Marone,P., Sambri,V., Bazzocchi,C., & Bandi,C. (2012) Humans parasitized by the hard tick Ixodes ricinus are seropositive to Midichloria mitochondrii: is Midichloria a novel pathogen, or just a marker of tick bite. Pathogens and Global Health, 106, 391-396. O'Neill,S.L., Giordano,R., Colbert,A.M., Karr,T.L., & Robertseon,H.M. (1992) 16S rrna phylogenetic analysis of the bacterial endosymbionts associated with cytoplasmic incompatilbility in insects. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 89, 2699-2702. Skarphedinsson,S., Jensen,P.M., & Kristiansen,K. (2005) Survey of tickborne infections in Denmark. Emerging Infectious Diseases, 11, 1055-1061. Zchori-Fein,E., Perlman,S.J., Kelly,S.E., Katzir,N., & Hunter,M.S. (2004) Characterization of a 'Bacteroidetes' symbiont in Encarsia wasps (Hymenoptera : Aphelinidae): proposal of 'Candidatus Cardinium hertigii'. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, 54, 961-968.