Resistensbestemmelse av anaerobe bakterier Truls Leegaard AFA-kurs 2015
Anaerober - utfordring Langsomtvoksende Identifikasjon Krever spesielle vekstvilkår Opprettholdes anaerobe forhold? Hvilke funn skal resistensbestemmes? Polymikrobielt
Hva skal vi resistensbestemme? Viktig å identifisere anaerober korrekt har tradisjonelt vært vanskelig Dermed risikerer man å sammenligne resistensen til forskjellige grupper Nå endelig mulig, med: MALDITOF MS matrix-assisted laser desorption ionization timeof-flight mass spectrometry 16S RNA NORM 2014: Standardisering av identifikasjon og resistensbestemmelse
Resistensmekanismer Penicilliner β-laktamase klasse A (cefalosporinaser) Hemmes av tazobactam og klavulansyre Karbapenemer Metallo-β-laktamase cfia Bacteroides spp. Prevotella spp. Fusobacterium spp. Bacteroides fragilis gruppen
Resistensmekanismer Klindamycin Metylaser Høygradig, konstitutiv MLS-resistens Metronidazol nim-gener (nitromidazol reduktase) Bacteroides spp. Peptostreptococcus spp.
Referansemetode: Agar-fortynning (CLSI) / Buljongfortynning (B.fragilis gruppen)
Anbefalt metode: Agar gradientdiffusjon Medium: Brucella agar med 5 % saueblod 1 mg/l vitamin K 1 5 mg/l hemin Inokulum: Brucella-buljong (eller tilsvarende) 1 McFarland (3 McF for C. difficile)
Agar gradientdiffusjon Inkubering Inkuberes innen 1 2 timer Anaerob atmosfære (4-7 % CO 2 ) 20-24 timer ( - 48 timer)
Supplerende tester Nitrocefintest Påvisning av β-laktamaser Som regel positiv innen 30 minutter MBL-kombinasjonsstrips
Tolkning S-I-R-kategorisering iht brytningspunkttabell Nitrocefin + R for penicilliner Penicilliner Nitrocefin - MIC? Karbapenemer MIC > S ID? Repeter test Klindamycin (Induserbar resistens) Peptostreptokokker Erythromycin MIC > 8 mg/l Bacteroides Erythromycin MIC > 32 mg/l R for Klindamycin R for Klindamycin Metronidazol MIC > S ID? Repeter test
Kvalitetskontroller Anbefales inkludert ved hvert oppsett B. fragilis (ATCC 25285) - metronidazol P. aeruginosa (ATCC 27853) på laktose agar
Hvilke midler bør være med i et Penicillin resistensoppsett? Piperacillin-tazobactam Meropenem Klindamycin Metronidazol (Kloramfenikol) Brytningspunkter fra Eucast/NordicAST/AFA: www.nordicast.org
Resistensbestemmelse av anaerober i Norge Kommedal O, Nystad TW, Bolstad B, Digranes A. Antibiotic susceptibility of blood culture isolates of anaerobic bacteria at a Norwegian university hospital. APMIS. 2007; 115: 956-61 Hannula R, Iversen G. Resistance of Bacteroides species in Trondheim, Norway. Poster ECCMID 2008. Available from: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=hannula+2008 N Handal, SB Jørgensen, HS Tunsjø, BO Johnsen, TM Leegaard. Anaerobic blood culture isolates in a Norwegian university hospital: identification by MALDI-TOF MS vs 16S rrna sequencing and antimicrobial susceptibility profiles. APMIS 2015; 123: 749-58 NORM rapport 2014: www.antibiotikaresistens.no
Kilder NordicAST metodedokument: Resistensbestemmelse af anaerobe bakterier. NordicAST 2012. Strategirapport nr. 23, 2009 Anaerob diagnostikk. FHI 2010. M11-A8 Methods of Antimicrobial Susceptibility Testing of Anaerobic Bacteria; Approved Standard Eight edition. CLSI 2012.
Identifikasjon For å få en god oversikt over resistensforholdene er det essensielt at identifikasjonen er korrekt. Artikkelen sammenligner MaldiTOF identifikasjon med 16S identifikasjon Viser at MaldiTOF fungerer godt, med unntak av GPAK og non-fragilis bacteroides group pga dårlige databaser hos produsenten. Fusobacterier må forbehandles for å få akseptabel identifikasjon Pga utbredelsen av MaldiTOF er nå overvåkning av anaerob resistens mulig
Hvilke resistens kan jeg finne i mitt eget laboratorium? Resistens mot β-laktam + β-laktamase inhibitor kombinasjoner er vanlig i Bacteroides fragilis gruppen Resistens mot metronidazol på grunn av nim gener. Sjeldent, men er påvist over hele verden og det er også påvist overføring til andre arter. PCR påvisning av nim gener er ikke tilstrekkelig for å påvise resistens mot metronidazol, man må utføre en MIC bestemmelse, noe som tyder på at nim alene ikke er nok til å gi metronidazol-resistens Klindamycin resistens (20% av alle anaerobe bakterier) Beta-laktamaseproduksjon i 2/3 av Prevotella isolatene Penicillinaseproduksjon i Fusobacterium og Clostridium butyricum Bred-spektrum beta-laktamase hos Clostridium clostridioforme og Clostridium ramosum Karbapenemase produksjon hos B. fragilis (3%)
Bacteroides fragilis (n=74) % R 0,064 0,125 0,25 0,5 1 2 4 8 16 32 Metronidazol 1.4 0 2 9 32 29 0 1 0 0 1 Penicillin 100 0 0 0 0 0 2 5 6 37 24 Pip-tazo 2.7 2 4 18 33 11 1 2 1 2 0 Meropenem 6.8 6 45 13 5 0 0 1 1 2 1 Klindamycin 12.2 5 6 7 14 15 10 8 0 0 9
Non-fragilis Bacteroides spp. (n=48) % R 0,064 0,125 0,25 0,5 1 2 4 8 16 32 Metronidazol 2.1 0 0 2 23 20 2 0 0 0 1 Penicillin 97.9 0 0 1 1 2 2 3 4 12 23 Pip-tazo 43.7 0 0 2 1 3 6 7 8 15 6 Meropenem 2.1 0 11 29 7 0 0 1 0 0 0 Klindamycin 29.2 6 1 4 3 4 9 7 4 1 9
Fusobacterium spp. (n=13) % R 0,064 0,125 0,25 0,5 1 2 4 8 16 32 Metronidazol 0 11 0 2 0 0 0 0 0 0 0 Penicillin 15.4 10 1 0 1 0 0 0 0 0 1 Pip-tazo 0 13 0 0 0 0 0 0 0 0 0 Meropenem 0 13 0 0 0 0 0 0 0 0 0 Klindamycin 0 13 0 0 0 0 0 0 0 0 0
Gram-positive anaerobic cocci (n=15) % R 0,064 0,125 0,25 0,5 1 2 4 8 16 32 Metronidazol 0 2 4 3 3 0 3 0 0 0 0 Penicillin 0 12 2 1 0 0 0 0 0 0 0 Pip-tazo 0 11 1 1 1 0 1 0 0 0 0 Meropenem 0 13 1 1 0 0 0 0 0 0 0 Klindamycin 20 3 3 3 1 2 0 0 0 0 3
Prevotella spp. (n=13) % R 0,064 0,125 0,25 0,5 1 2 4 8 16 32 Metronidazol 15.4 0 3 2 0 3 3 0 1 0 1 Penicillin 69.2 3 1 0 2 1 0 1 3 2 0 Pip-tazo 0 9 3 0 1 0 0 0 0 0 0 Meropenem 0 9 4 0 0 0 0 0 0 0 0 Klindamycin 0 12 0 1 0 0 0 0 0 0 0
Clostridium spp. (n=32) % R 0,064 0,125 0,25 0,5 1 2 4 8 16 32 Metronidazol 0 2 1 3 3 9 10 4 0 0 0 Penicillin 34.4 13 7 1 2 6 1 1 0 1 0 Pip-tazo 3.1 16 5 1 0 4 1 1 3 1 0 Meropenem 0 18 1 1 5 7 0 0 0 0 0 Klindamycin 31.3 6 3 1 4 2 3 3 6 1 3
B. fragilis Penicillin: R Pip-tazo: R Meropenem: R Metronidazol: R Klindamycin: R Kloramfenikol: S Pasient fra Pakistan
Penicillin: R Pip-tazo: R Meropenem: S Metronidazol: S Klindamycin: S Kloramfenikol: S B. thetaiotaomicron
Penicillin: R Pip-tazo: S Meropenem: S Metronidazol: 2 (S) -> 8 (R) Klindamycin: S Kloramfenikol: S P. bivia