Pakningsvedlegg for QuantiFERON -TB Gold (QFT ) ELISA

Transkript

1 Pakningsvedlegg for QuantiFERON -TB Gold (QFT ) ELISA 2 x 96 (katalognr ) 20 x 96 (katalognr ) IFN-γ-test med fullblod måler reaksjoner på peptidantigenene ESAT-6, CFP-10 og TB7.7(p4) Til bruk i in vitro-diagnostikk , Cellestis, a QIAGEN Company Level 2, Office Tower 2, Chadstone Centre 1341 Dandenong Road, Chadstone, Victoria, 3148 Australia Telefonnr.: (Australia) QIAGEN GmbH, QIAGEN Strasse Hilden, TYSKLAND NO Rev

2

3 Innhold 1. Tiltenkt bruk 4 2. Sammendrag og forklaring av testen 4 Analyseprinsipp 5 Tiden som er nødvendig for utføre analysen 5 3. Komponenter og oppbevaring 6 Materiale som er nødvendig, men som ikke medfølger 7 Oppbevaring og håndtering 7 4. Advarsler og forholdsregler 8 Til bruk i in vitro-diagnostikk 8 Advarsler 8 Forholdsregler 9 5. Prøvetaking og -klargjøring Bruksanvisning 12 Trinn 1 Inkubasjon av blod og innhenting av plasma 12 Trinn 2 Human IFN-γ ELISA Beregninger og tolkning av tester 17 Fremstilling av standardkurve 17 Kvalitetskontroll av testen Begrensninger Ytelseskarakteristikker 20 Kliniske studier Teknisk informasjon 22 Ubestemte resultater 22 Koagulerte plasmaprøver 22 Feilsøkingsveiledning Bibliografi Teknisk service Forkortet testprosedyre 28 Trinn 1 inkubasjon av blod 28 Trinn 2 IFN-γ ELISA 28 Signifikante endringer 30 Pakningsvedlegg for QuantiFERON-TB Gold (QFT) ELISA 07/2013 3

4 1. Tiltenkt bruk QuantiFERON-TB Gold (QFT ) er en in vitro-diagnostisk test som bruker en peptidblanding som simulerer ESAT-6-, CFP-10- og TB7.7(p4)-proteiner for å stimulere celler i heparinisert fullblod. Påvisning av interferon-γ (IFN-γ) med enzymkoblet immunsorbent analyse (ELISA) brukes til å identifisere in vitro-reaksjoner til disse peptidantigenene som forbindes med Mycobacterium tuberculosis-infeksjon. QFT er en indirekte test for M. tuberculosis-infeksjon (inkludert sykdom) og skal brukes sammen med risikovurdering, røntgenavbildning og andre medisinske og diagnostiske vurderinger. 2. Sammendrag og forklaring av testen Tuberkulose er en smittsom sykdom som forårsakes av infeksjon med organismer av M. tuberculosiskomplekset (M. tuberculosis, M. bovis, M. africanum), som normalt spres til nye smittebærere via dråpesmitte i luften fra pasienter med tuberkulose i lungene. En person som nettopp er blitt smittet, kan bli syk av tuberkulose i løpet av uker eller måneder, men de fleste som smittes, blir ikke syke. Latent tuberkuloseinfeksjon (LTBI), en ikke-smittsom asymptomatisk tilstand, vedvarer hos noen, og disse kan utvikle tuberkuløs sykdom etter noen måneder eller år. Det viktigste med diagnostisering av LTBI er å vurdere hvilken medisinsk behandling som må til for å forhindre tuberkulose. Helt til nylig var tuberkulintesten (TST) den eneste metoden for å diagnostisere LTBI. Hudreaksjoner overfor tuberkulin utvikler seg 2 til 10 uker etter infeksjon. Enkelte infiserte personer, inkludert de som har andre sykdommer som forhindrer immunforsvaret å fungere, men også andre uten slike sykdommer, reagerer imidlertid ikke på tuberkulin. Og motsatt vil enkelte personer som mest sannsynlig ikke har en M. tuberculosis-infeksjon, være sensitive overfor tuberkulin og dermed få positive TST-resultater etter vaksine med Bacille Calmette-Guérin (BCG), infeksjon med andre mykobakterier enn M. tuberculosis-kompleks eller andre uavklarte faktorer. Det må skilles mellom LTBI og tuberkuløs sykdom, en rapporterbar tilstand som normalt omfatter lungene og nedre luftveier, selv om andre organsystemer også kan bli berørt. Tuberkuløs sykdom diagnostiseres på bakgrunn av historiske, fysiske, radiologiske, histologiske og mykobakteriologiske funn. QFT tester cellemediert immunitet (CMI-respons) på peptidantigener som simulerer mykobakterielle proteiner. Disse proteinene, ESAT-6, CFP-10 og TB7.7(p4), er fraværende i alle BCG-stammer og i nesten alle ikke-tuberkuløse mykobakterier med unntak av M. kansasii, M. szulgai og M. marinum.(1) Personer som er smittet med organismer fra M. tuberculosis-komplekset, har normalt lymfocytter i blodet som gjenkjenner disse og andre mykobakterielle antigener. Denne gjenkjennelsesprosessen omfatter generering og sekresjon av cytokinet IFN-γ. Påvisning og etterfølgende kvantifisering av IFN-γ danner grunnlaget for denne testen. Antigenene som brukes i QFT er en blanding av peptider som simulerer proteinene ESAT-6, CFP-10 og TB7.7(p4). Flere studier har vist at disse peptidantigenene stimulerer IFN-γ-respons i T-cellene fra personer infisert med M. tuberculosis, men generelt ikke fra usmittede eller BCG-vaksinerte personer som ikke er syke eller har risiko for LTBI.(1 32) Medisinsk behandling eller tilstander som kan svekke immunforsvaret, kan imidlertid redusere IFN-γ-reaksjonene. Pasienter med bestemte andre mykobakterielle infeksjoner kan også reagere på ESAT-6, CFP-10 og TB7.7(p4), da genene som koder disse proteinene er til stede i M. kansasii, M. szulgai og M. marinum.(1, 23) QFT-testen er både en test for LTBI og et nyttig hjelpemiddel ved diagnostisering av infeksjoner av M. tuberculosiskomplekset hos syke pasienter. Et positivt resultat støtter diagnostisering av tuberkuløs sykdom, meninfeksjoner av andre mykobakterier (f.eks. M. kansasii) kan også gi positive resultater. 4 Pakningsvedlegg for QuantiFERON TB Gold (QFT) ELISA 07/2013

5 Andre medisinske og diagnostiske vurderinger må også tas for å bekrefte eller ekskludere tuberkuløs sykdom. Analyseprinsipp QFT-systemet bruker spesielle blodprøverør for innsamling av fullblod. Inkubasjon av blodet skjer i rørene i timer, hvoretter plasma innhentes og testes for tilstedeværelse av IFN-γ produsert som reaksjon på peptidantigener. QFT-testen utføres i to trinn. Først blir fullblod innsamlet i de ulike QFT-blodprøverørene, som består av et Nil-rør, TB-antigenrør og et Mitogen-rør. Mitogen-røret kan brukes med QFT-testen som positiv kontroll. Dette kan være spesielt berettiget i tilfeller der det er tvil om pasientens immunstatus. Mitogen-røret kan også brukes som en kontroll for riktig blodhåntering og -inkubasjon. Rørene må inkuberes ved 37 C så snart som mulig, innen 16 timer etter innsamling. Etter en timer lang inkubasjonsperiode blir rørene sentrifugert, plasma fjernet og mengden IFN-γ (IU/ml) målt av ELISA. En test anses som positiv dersom en IFN-γ-reaksjon på TB Antigen-røret ligger langt høyere enn Nil IFN-γ IU/ml-verdien. Plasmaprøven (om den brukes) fra Mitogen-røret fungerer som en IFN-γ-positiv kontroll for hver prøve som testes. En lav reaksjon på mitogen (<0,5 IU/ml) indikerer et ubestemt resultat når en blodprøve også har negative reaksjon på TB-antigenene. Dette mønsteret kan oppstå ved utilstrekkelig mengde lymfocytter, redusert lymfocyttaktivitet grunnet feil prøvehåndtering, feil påfylling/blanding av Mitogen-røret eller hvis pasientens lymfocytter ikke klarer å fremstille IFN-γ. Nil-prøven justerer bakgrunnen, effektene av heterofile antistoffstoffer eller for ikke-spesifikk IFN-γ i blodprøver. IFN-γ-nivået i Nil-røret trekkes fra IFN-γ-nivået for TB-antigenrøret og Mitogen-røret (dersom det brukes). Tiden som er nødvendig for utføre analysen Tiden som kreves for å få utført QFT-analysen er beregnet nedenfor; tiden som kreves for testserier av flere prøver er også angitt: 37 C-inkubasjon av blodrør: timer ELISA: Cirka 3 timer for én ELISA-plate (28 44 personer) <1 times arbeid Legg til minutter for hver ekstra plate Pakningsvedlegg for QuantiFERON-TB Gold (QFT) ELISA 07/2013 5

6 3. Komponenter og oppbevaring Blood Collection Tubes (blodprøverør)* 300 rør 200 rør 100 rør Katalognr. T T Antall klargjøringer QuantiFERON Nil Tube (Nil-rør) (grå hette, hvit ring) 100 rør 100 rør QuantiFERON TB Antigen Tube (TB-antigen-rør) (rød hette, hvit ring) QuantiFERON Mitogen Tube (Mitogen-rør) (lilla hette, hvit ring) 100 rør 100 rør 100 rør 100 rør Pakningsvedlegg for QFT-blodprøverør High Altitude (HA) Blood Collection Tubes (blodprøverør for høy stedshøyde) (brukes mellom 1020 og 1875 moh.) 300 rør 100 rør 100 rør Katalognr. T T QuantiFERON HA Nil Tube (HA Nil-rør) (grå hette, gul ring) QuantiFERON HA TB Antigen Tube (HA TB-antigenrør) (rød hette, gul ring) QuantiFERON HA Mitogen Tube (HA Mitogen-rør) (lilla hette, gul ring) 100 rør 100 rør 100 rør 100 rør 100 rør 100 rør Pakningsvedlegg for QFT-blodprøverør * Ikke alle produktkonfigurasjoner er tilgjengelig i alle land. Ta kontakt med QIAGEN-kundesenteret (mer informasjon på for å få mer informasjon om hvilke konfigurasjoner som kan bestilles. 6 Pakningsvedlegg for QuantiFERON TB Gold (QFT) ELISA 07/2013

7 ELISA-komponenter Sett med 2 ELISA-plater Referanselabpakke Katalognr Mikroplateremser (12 x 8 brønner) belagt med murint anti-humant IFN-γ-monoklonalt antistoff Human IFN-γ Standard, lyophilized (human IFN-γstandard, lyofilisert) (inneholder rekombinant human IFN-γ, bovint kasein, 0,01 % vekt/volum timerosal) 2 sett mikroplateremser med 12 x 8 brønner 1 x ampulle (8 IU/ml rekonstituert) 20 sett mikroplateremser med 12 x 8 brønner 10 x ampuller (8 IU/ml rekonstituert) Green Diluent (grønn fortynner) (inneholder bovint kasein, normalt museserum, 0,01% vekt/volum timerosal) 1 x 30 ml 10 x 30 ml Conjugate 100X Concentrate, lyophilized (konjugatkonsentrat 100X, lyofilisert) (murin anti-human IFN-γ HRP inneholder 0,01 % vekt/volum timerosal) 1 x 0,3 ml (rekonstituert) 10 x 0,3 ml (rekonstituert) Wash Buffer 20X Concentrate (vaskebufferkonsentrat 20X) (ph 7,2, inneholder 0,05 % vekt/volum ProClin 300) Enzym Substrate Solution (enzymsubstratløsning) (inneholder H 2O 2, 3,3, 5,5 tetramethylbenzidin) Enzyme Stopping Solution (enzymstoppende løsning) (inneholder 0,5M H 2SO 4) 1 x 100 ml 10 x 100 ml 1 x 30 ml 10 x 30 ml 1 x 15 ml 10 x 15 ml Pakningsvedlegg for QFT ELISA 1 1 Inneholder svovelsyre. Se side 9 for forholdsregler. Materiale som er nødvendig, men som ikke medfølger Inkubator (37 C). CO 2 kreves ikke Kalibrerte pipetter med variabelt volum og spisser til engangsbruk for levering av 10 µl til 1000 µl Kalibrerte pipetter for flere kanaler og spisser til engangsbruk for levering av 50 µl til 100 µl Mikroplaterister Avionisert eller destillert vann, 2 liter Oppvaskmaskin for mikroplater (automatisert vaskemaskin anbefales) Mikroplateleser med 450 nm-filter og 620 nm- til 650 nm-referansefilter Oppbevaring og håndtering Blodprøvetakingsrør Blodprøvetakingsrør skal oppbevares ved 4 C til 25 C. Pakningsvedlegg for QuantiFERON-TB Gold (QFT) ELISA 07/2013 7

8 Reagenser i settet Reagenser i settet skal oppbevares ved 2 8 C. Enzymsubstratløsningen må alltid beskyttes mot direkte sollys. Rekonstituerte og ubrukte reagenser Du finner instruksjoner om hvordan du kan rekonstituere reagensene i avsnitt 6 (side 13) Det rekonstituerte standardsettet kan oppbevares i opptil 3 måneder dersom det lagres ved 2 8 C. Skriv ned datoen for rekonstituering av standardsettet. Etter rekonstituering må konjugatkonsentratet 100X returneres til oppbevaring ved 2 8 C og må brukes innen 3 måneder. Skriv ned datoen for rekonstituering av konjugatet. Working strength-konjugat må brukes innen 6 timer etter klargjøring. Working strength-vaskebuffer må oppbevares ved romtemperatur i opptil 2 uker. 4. Advarsler og forholdsregler Til bruk i in vitro-diagnostikk Advarsler Et negativt QFT-resultat utelukker ikke muligheten for M. tuberculosis-infeksjon eller tuberkuløs sykdom: et falskt negativt resultat kan avhenge av infeksjonens stadium (f.eks. prøven ble tatt før utvikling av celleformet immunreaksjon), felles sykelige tilstander som påvirker immunforsvaret, feil håndtering av blodprøverør etter venepunksjon, feil utført analyse eller andre immunologiske variabler. Et positivt QFT-resultat bør ikke danne eneste eller endelige grunnlaget for diagnostisering av M. tuberculosis-infeksjon. Feil utført analyse kan føre til falsk positiv reaksjon. Et positivt QFT-resultat bør følges opp med ytterligere medisinsk vurdering og diagnostisk vurdering av eventuell aktiv tuberkuløs sykdom (f.eks. AFB-utstryk og -dyrkning samt røntgen av thorax). Mens ESAT-6, CFP-10 og TB7.7(p4) er fraværende i alle BCG-stammer og de mest kjente ikke-tuberkuløse mykobakteriene, er det mulig at et positivt QFT-resultat er forårsaket av infeksjon av M. kansasii, M. szulgai eller M. marinum. Hvis det er mistanke om slike infeksjoner, bør alternative tester vurderes. 8 Pakningsvedlegg for QuantiFERON TB Gold (QFT) ELISA 07/2013

9 Forholdsregler Kun til bruk i in vitro-diagnostikk. Bruk alltid egnet laboratoriefrakk, engangshansker og vernebriller ved arbeid med kjemikalier. Se gjeldende sikkerhetsdatablader (SDS) hvis du ønsker mer informasjon. Disse er tilgjengelige i praktisk og kompakt PDF-format på der du kan søke etter, vise og skrive ut sikkerhetsdatabladet for hvert QIAGEN-sett og hver settkomponent. FORSIKTIG: Håndter humant blod som potensielt smittefarlig. Følg relevante retningslinjer for blodhåndtering. Følgende risiko- og sikkerhetssetninger gjelder for komponenter i QuantiFERON-TB Gold ELISA. QuantiFERON enzymstoppende løsning Xi Inneholder svovelsyre: Irriterende stoff. Risiko- og sikkerhetssetninger: R36/38, S26-36/37/39 Grønn fortynner inneholder normalt museserum og kasein som kan utløse allergiske reaksjoner; unngå kontakt med huden. Ved kjemisk nødsfall Søl, lekkasje, eksponering eller ulykke Ring CHEMTREC dag eller natt I USA og Canada: Utenfor USA og Canada: (noteringsoverføring aksepteres) Ytterligere informasjon Sikkerhetsdatablad: Avvik fra pakningsvedlegg for QuantiFERON-TB Gold (QFT) ELISA kan føre til feilaktige resultater. Instruksjonene må leses nøye før bruk. Ikke bruk settet hvis noen av reagensflaskene viser tegn til skade eller lekkasje før bruk. Mikroplateremser, human IFN-γ-standard, grønn fortynner og konjugatkonsentrat 100X fra ulike QFT-sett må ikke blandes og brukes. Andre reagenser (vaskebufferkonsentrat 20X, enzymsubstratløsning og enzymstoppende løsning) kan byttes mellom sett, forutsatt at partiinformasjon er registrert og reagensene ikke er utløpt på dato. Kast ubrukte reagenser og biologiske prøver i samsvar med lokale og statlige forskrifter. Blodprøverør og ELISA-settet skal ikke brukes etter utløpt holdbarhetsdato. Se til at laboratorieutstyr som platevaskere og -lesere er kalibrert/godkjent for bruk. R36/38: Irriterer øynene og huden; S26: Ved kontakt med øynene, skyll omgående med store mengder vann og kontakt lege; S36/37/39: Bruk egnede verneklær, hansker og vernebriller/ansiktsskjerm. Pakningsvedlegg for QuantiFERON-TB Gold (QFT) ELISA 07/2013 9

10 5. Prøvetaking og -klargjøring QFT bruker følgende prøvetakingsrør: 1. QuantiFERON Nil-rør (grå hette med hvit ring brukes mellom moh.) 2. TB-antigenrør (rød hette med hvit ring brukes mellom moh.) 3. QuantiFERON Mitogen-rør (lilla hette med hvit ring brukes mellom moh.) HA-rør (blodprøverør for høy stedshøyde): 4. QuantiFERON HA Nil-rør (grå hette med gul ring brukes mellom moh.) 5. HA TB-antigenrør (rød hette med gul ring brukes mellom moh.) 6. QuantiFERON HA Mitogen-rør (lilla hette med gul ring brukes mellom moh.) Antigen er tørket på innsiden av blodprøverørene, så det er viktig at innholdet i rørene blandes godt med blodet. Rørene må overføres til en inkubator som holder 37 C så snart som mulig og innen 16 timer etter prøvetaking. Følgende prosedyrer må følges for å få best resultater: 1. Fyll 1 ml blod via venepunksjon direkte inn i et QFT-blodprøverør. Denne prosedyren bør utføres av en fagperson som har opplæring i blodprøvetaking. Standard QFT-blodprøverør skal brukes opptil en høyde på 810 moh. High Altitude (HA) QFT-blodprøverør skal brukes mellom 1020 og 1875 moh. Hvis QFT-blodprøverør brukes utenfor disse høydeområdene, eller ved mindre prøvevolum, kan en sprøyte benyttes til blodprøvetaking, og 1 ml overføres deretter umiddelbart til hvert rør (totalt tre). Av sikkerhetsmessige årsaker er det best å fjerne sprøytenålen i tråd med egnede sikkerhetsprosedyrer. Ta av hettene på de tre QFT-rørene, og tilsett 1 ml blod til hvert rør (til det svarte merket på siden av etiketten). Sett hettene godt på igjen, og bland slik det er beskrevet nedenfor. I og med at rørene på 1 ml tapper blod relativt sakte, skal røret ikke fjernes fra nålen 2 3 sekunder etter at det ser ut som om røret er fylt, for å sikre at riktig mengde er tatt. Det svarte merket på siden av rørene angir 1 ml fyllvolum. QFT-blodprøverør er godkjent for mengder fra 0,8 1,2 ml. Hvis blodnivået i et rør ikke er nær indikatorlinjen, anbefales det å ta en ny blodprøve. Hvis en "butterfly-nål" brukes for å ta blodprøven, må man ved hjelp av et tomt rør sikre at forbindelsen fylles med blod før QFT-rørene tas i bruk. Alternativt kan blodprøver tas i et enkelt generelt blodprøverør med litiumheparin som antikoagulant og deretter overføres til QFT-rør. Bare litiumheparin skal brukes som blodantikoagulant, siden andre antikoagulanter vil påvirke analysen. Fyll et blodprøverør (minstevolum på 5 ml), og bland forsiktig ved å snu røret opp og ned flere ganger for å løse opp heparinen. Blodet bør holde romtemperatur (22 C ±5 C) før det overføres til et QFT-rør for inkubering, noe som må startes opp innen 16 timer etter blodprøven er tatt. 10 Pakningsvedlegg for QuantiFERON TB Gold (QFT) ELISA 07/2013

11 2. Rett etter at rørene er fylt, skal de ristes ti (10) ganger, såpass kraftig at hele innsiden av røret dekkes av blod, for å løse opp antigenmateriale på veggene i røret. Rørene bør holde en temperatur på mellom 17 C og 25 C under fyllingen. For kraftig risting kan føre til gelforstyrrelse og feil resultater. Hvis blodet er tatt i et heparinrør, må prøvene blandes godt før dispensering i QFT-rørene. Se til at blod er grundig blandet med lett vending av rørene umiddelbart før dispensering. Dispenser mengder på 1,0 ml (én i hvert QFT-rør) i et egnet Nil-, TB-antigen- og Mitogen-rør. Dette bør gjøres med aseptisk teknikk i tråd med egnede sikkerhetsprosedyrer. Ta av hettene på de tre QFT-rørene, og tilsett 1 ml blod i hvert rør (til det svarte merket på siden av etiketten). Sett hettene godt på rørene igjen, og bland slik det er beskrevet over. 3. Rørene må merkes riktig. Kontroller at alle rørene (Nil, TB-antigen, Mitogen) har identifiserbar etikett eller kan identifiseres på annen måte så snart hetten er tatt av. 4. Etter påfylling, risting og merking, må rørene overføres til en inkubator som holder 37 C± 1 C så snart som mulig, og innen 16 timer etter prøvetaking. Før inkubasjon må rørene holde romtemperatur (22 C ±5 C). Blodprøvene må ikke settes i kjøleskap eller fryses. Pakningsvedlegg for QuantiFERON-TB Gold (QFT) ELISA 07/

12 6. Bruksanvisning Trinn 1 Inkubasjon av blod og innhenting av plasma Materialer som medfølger QFT-blodprøverør (se avsnitt 3). Materialer som er nødvendige (men som ikke medfølger) Se avsnitt 3. Prosedyre 1. Hvis blodet ikke inkuberes umiddelbart etter prøvetaking, må rørene blandes igjen ved å snus opp og ned 10 ganger umiddelbart før inkubering. 2. Inkuber rørene STÅENDE ved 37 C ±1 C i timer. Inkubatoren krever ikke CO 2 eller fukting. 3. Etter inkubering ved 37 C må blodprøverørene oppbevares mellom 4 27 C i opptil 3 dager før sentrifugering. 4. Etter at rørene er inkubert ved 37 C, kan plasma innhentes ved å sentrifugere rørene i 15 minutter ved 2000 til 3000 RCF (g). Gelpluggen vil skille cellene fra plasma. Hvis dette ikke skjer, bør rørene sentrifugeres på nytt ved en høyere hastighet. Det er mulig å samle inn plasma uten sentrifugering, men man må være ekstra forsiktig for å fjerne plasma uten å forstyrre cellene. 5. Plasmaprøver må bare samles inn ved hjelp av en pipette. Etter sentrifugering må du unngå å pipettere opp og ned eller blande plasma på noen måte før innsamling. Du må til enhver tid passe på å ikke å forstyrre materialet på geloverflaten. Plasmaprøver kan lastes direkte fra sentrifugerte blodprøverør og inn i QFT ELISA-platen, også ved bruk av automatiske ELISA-arbeidsstasjoner. Plasmaprøver kan oppbevares i 28 dager ved 2 8 C eller, ved innsamling, under 20 C i lengre perioder. Minst 150 µl plasma bør innhentes for å ha nok til en prøve. 12 Pakningsvedlegg for QuantiFERON TB Gold (QFT) ELISA 07/2013

13 Trinn 2 Human IFN-γ ELISA Materialer som medfølger QFT ELISA-sett (se avsnitt 3). Materialer som er nødvendige (men som ikke medfølger) Se avsnitt 3. Prosedyre 1. Alle plasmaprøver og reagenser, unntatt konjugat 100X-konsentrat, må oppnå romtemperatur (22 C ±5 C) før bruk. La det gå minst 60 minutter for å oppnå likevekt. 2. Fjern remser som ikke er nødvendige fra rammen, forsegl i folieposen og sett tilbake i kjøleskapet for oppbevaring frem til de blir nødvendige. Bruk minst 1 remse til QFT-standardene og tilstrekkelig med remser til antall personer som skal testes (se figur 2A og 2B for hhv. 3-rørs- og 2-rørsformater). Etter bruk beholder du rammen og lokket for bruk med gjenværende remser. 3. Rekonstituer det frysetørkede standardsettet med volumet med avionisert eller destillert vann angitt på etiketten til standardampullen. Bland forsiktig for å forhindre skumming, og sørg for at det løser seg fullstendig opp. Rekonstituering av standarden til angitt volum vil gi en løsning med en konsentrasjon på 8,0 IU/ml. Merk: Det rekonstituerte volumet av standardsettet vil variere fra parti til parti. Bruk det rekonstituerte standardsettet til å lage en 4:1 fortynningsserie med IFN-γ i grønn fortynning (GD) (se figur 1). S1 (Standard 1) inneholder 4 IU/ml, S2 (Standard 2) inneholder 1 IU/ml, S3 (Standard 3) inneholder 0,25 IU/ml, and S4 (Standard 4) inneholder 0 IU/ml (kun GD). Standardene bør analyseres minst to ganger. Anbefalt prosedyre for doble standarder Anbefalt prosedyre for triple standarder a. Merk 4 rør "S1", "S2", "S3", "S4". a. Merk 4 rør "S1", "S2", "S3", "S4". b. Tilsett 150 µl GD i S1, S2, S3, S4. b. Tilsett 150 µl GD i S1. c. Tilsett 150 µl av settstandarden til S1, og bland godt. c. Tilsett 210 µl GD i S2, S3, S4. d. Overfør 50 µl fra S1 til S2 og bland godt. d. Tilsett 150 µl av settstandarden i S1 og bland godt. e. Overfør 50 µl fra S2 til S3 og bland godt. e. Overfør 70 µl fra S1 til S2 og bland godt. f. GD alene fungerer som null-standard (S4). f. Overfør 70 µl fra S2 til S3 og bland godt. g. GD alene fungerer som nullstandard (S4). Pakningsvedlegg for QuantiFERON-TB Gold (QFT) ELISA 07/

14 150 µl 50 µl 50 µl Rekonstituert settstandard Standard 1 4,0 IE/ml Standard 2 1,0 IE/ml Standard 3 0,25 IE/ml Standard 4 0 IE/ml (grønn fortynningsløsning) Figur 1. Klargjøring av standardkurve. Klargjør ferske fortynninger av settstandarden for hver ELISAprosedyre. 4. Rekonstituer frysetørket konjugat 100X-konsentrat med 0,3 ml avionisert eller destillert vann. Bland forsiktig for å forhindre skumming, og sørg for at det løser seg fullstendig opp. Working strenght-konjugat klargjøres ved å fortynne nødvendig mengde rekonstituert konjugatkonsentrat 100X i grønn fortynning slik det er angitt i tabell 1 Klargjøring av konjugat. Tabell 1. Konjugatklargjøring Antall remser Volum av konjugatkonsentrat (100X) Volum av grønn fortynning 2 10 µl 1,0 ml 3 15 µl 1,5 ml 4 20 µl 2,0 ml 5 25 µl 2,5 ml 6 30 µl 3,0 ml 7 35 µl 3,5 ml 8 40 µl 4,0 ml 9 45 µl 4,5 ml µl 5,0 ml µl 5,5 ml µl 6,0 ml Bland grundig men forsiktig for å unngå skumming. Ubrukt 100X-konjugatkonsentrat skal umiddelbart etter bruk settes tilbake i en temperatur på 2 C til 8 C. Bruk kun den grønne fortynningsløsningen. 14 Pakningsvedlegg for QuantiFERON TB Gold (QFT) ELISA 07/2013

15 5. Plasmaprøver som er innhentet fra blodprøverør og deretter fryses eller oppbevares i mer enn 24 timer før analyse, må blandes godt før tilsetting i ELISA-brønnen. Hvis plasmaprøver skal tilsettes direkte fra de sentrifugerte QFT-rørene, må enhver form for blanding av plasma unngås. 6. Tilsett 50 µl fersk Working strenght-konjugat til de aktuelle ELISA-brønnene ved hjelp av en pipette for flere kanaler. 7. Tilsett 50 µl testplasmaprøver til de aktuelle brønnene ved hjelp av en pipette for flere kanaler (se anbefalt plateoppsett på side 15, figur 2A og 2B). Tilsett til slutt 50 µl hver til standard A 1N 1A 1M S1 S1 S1 13N 13A 13M 21N 21A 21M B 2N 2A 2M S2 S2 S2 14N 14A 14M 22N 22A 22M C 3N 3A 3M S3 S3 S3 15N 15A 15M 23N 23A 23M D 4N 4A 4M S4 S4 S4 16N 16A 16M 24N 24A 24M E 5N 5A 5M 9N 9A 9M 17N 17A 17M 25N 25A 25M F 6N 6A 6M 10N 10A 10M 18N 18A 18M 26N 26A 26M G 7N 7A 7M 11N 11A 11M 19N 19A 19M 27N 27A 27M H 8N 8A 8M 12N 12A 12M 20N 20A 20M 28N 28A 28M Figur 2A. Anbefalt prøveoppsett for Nil-, TB-antigen- og Mitogen-rør (28 tester per plate). S1 (standard 1), S2 (standard 2), S3 (standard 3), S4 (standard 4) 1N (prøve 1. Nil-plasma), 1A (prøve 1. TB Antigen-plasma), 1M (prøve 1. Mitogen-plasma) A 1N 5N 9N 13N 17N S1 S1 25N 29N 33N 37N 41N B 1A 5A 9A 13A 17A S2 S2 25A 29A 33A 37A 41A C 2N 6N 10N 14N 18N S3 S3 26N 30N 34N 38N 42N D 2A 6A 10A 14A 18A S4 S4 26A 30A 34A 38A 42A E 3N 7N 11N 15N 19N 21N 23N 27N 31N 35N 39N 43N F 3A 7A 11A 15A 19A 21A 23A 27A 31A 35A 39A 43A G 4N 8N 12N 16N 20N 22N 24N 28N 32N 36N 40N 44N H 4A 8A 12A 16A 20A 22A 24A 28A 32A 36A 40A 44A Figur 2B. Anbefalt prøveoppsett for Nil- og TB Antigen-rør (44 tester per plate). S1 (standard 1), S2 (standard 2), S3 (standard 3), S4 (standard 4) 1N (prøve 1. Nil-plasma), 1A (prøve 1. TB-antigenplasma) 8. Bland konjugatet og plasmaprøvene/-standardene grundig ved hjelp av en mikroplaterister i 1 minutt. 9. Dekk til hver plate med et lokk, og inkuber ved romtemperatur (22 C ±5 C) i 120 ±5 minutter. Platene må ikke utsettes for direkte sollys under inkubasjon. Pakningsvedlegg for QuantiFERON-TB Gold (QFT) ELISA 07/

16 10. Ved inkubasjon skal en del vaskebufferkonsentrat (20X) fortynnes med 19 deler avionisert eller destillert vann og blandes grundig. Tilstrekkelig vaskebufferkonsentrat (20X) følger med for å klargjøre 2 liter Working strength-vaskebuffer. Vask brønner med 400 µl Working strenght-vaskebuffer i minst 6 sykluser. En automatisert oppvaskmaskin for plater anbefales. Grundig vask er svært viktig for analyseytelsen. Se til at hver brønn er helt fylt med vaskebuffer øverst i brønnen for hver vaskesyklus. La vaskebufferen virke i minst 5 sekunder mellom hver syklus. Standard laboratoriedesinfeksjonsmiddel må tilsettes til avløpsvannreservoaret, og etablerte prosedyrer for dekontaminering av potensielt smittefarlig materiale må følges. 11. Vend platene med oversiden ned på et absorberende, lofritt håndkle for å fjerne overflødig vaskebuffer. Tilsett 100 µl enzymsubstratløsning til hver brønn, og bland grundig ved hjelp av en mikroplaterister. 12. Dekk til hver plate med et lokk, og inkuber ved romtemperatur (22 C ±5 C) i 30 minutter. Platene må ikke utsettes for direkte sollys under inkubasjon. 13. Etter inkubasjonstiden på 30 minutter, skal 50 µl enzymstoppende løsning tilsettes hver brønn og blandes. Den enzymstoppende løsningen skal tilsettes brønnene i samme rekkefølge og ved cirka samme hastighet som substratet i trinn Mål den optiske tettheten (OD) for hver brønn innen 5 minutter etter at reaksjonen er stoppet ved å bruke en mikroplateleser montert med et 450 nm-filter og et 620 nm- til 650 nm-referansefilter. OD-verdier brukes til å beregne resultatene. 16 Pakningsvedlegg for QuantiFERON TB Gold (QFT) ELISA 07/2013

17 7. Beregninger og tolkning av tester QFT-analyseprogramvare brukes til å analysere rådata og beregne resultater. Dette er tilgjengelig fra Pass på at den nyeste versjonen av programvaren benyttes. Programvaren utfører en kvalitetskontrollvurdering av analysen, genererer en standardkurve og avgir et testresultat for hver person, slik det er gitt nærmere informasjon om i avsnittet om tolkning av resultater. Som et alternativ til å bruke QFT-analyseprogramvaren, kan resultater bestemmes i henhold til følgende metode. Fremstilling av standardkurve (hvis QFT-analyseprogramvaren ikke brukes) Bestemme OD-middelverdien for settstandardreplikater på hver plate. Lag en log (e)-log (e)-standardkurve ved å legge inn log (e) av gjennomsnittlig OD (y-akse) mot log for (e) for IFN-γ-konsentrasjonen av standardene i IU/ml (x-akse). Nullstandarden tas ikke med i disse beregningene. Beregn den best tilpassede linjen for standardkurven ved regresjonsanalyse. Bruk standardkurven for å bestemme IFN-γ-konsentrasjonen (IU/ml) til hver av testplasmaprøvene ved å bruke OD-verdien for hver prøve. Disse beregningene kan utføres ved hjelp av programvarepakker som er tilgjengelige med mikroplateleserne, samt standard regnerark eller statistisk programvare (f.eks. Microsoft Excel ). Det anbefales at disse pallene brukes til å beregne regresjonsanalysen, variasjonskoeffisienten (%CV) til standardene, samt korrelasjonskoeffisienten (r) til standardkurven. Kvalitetskontroll av testen Nøyaktigheten til testresultatene er avhengig av at standardkurven som genereres er nøyaktig. Derfor må resultatene som utledes fra standardene undersøkes før testprøveresultatene kan tolkes. For at ELISA skal være gyldig må: Middelverdien for OD for standard 1 må være 0,600. %CV for standard 1 og standard 2s replikat OD-verdier må være 15 %. Replikat-OD-verdier for standard 3 og standard 4 må ikke variere med mer enn 0,040 OD-enheter fra gjennomsnittsverdien. Korrelasjonskoeffisienten (r) beregnet fra gjennomsnittlige absorbansverdier for standardene må være 0,98. QFT-analyseprogramvaren beregner og rapporterer disse kvalitetskontrollparameterne. Hvis kriteriene over ikke tilfredsstilles, er analysen ugyldig og må tas på nytt. Gjennomsnittlig OD-verdi for nullstandarden (grønn fortynner) skal være 0,150. Hvis gjennomsnittlig OD-verdi er >0,150, bør vaskeprosedyren av plater undersøkes nærmere. Pakningsvedlegg for QuantiFERON-TB Gold (QFT) ELISA 07/

18 Tolkning av resultater QFT-resultater tolkes ved hjelp av følgende kriterier: Merk: Diagnostisering eller ekskludering av tuberkuløs sykdom, samt vurdering av sannsynligheten for LTBI, krever en kombinasjon av epidemiologiske, historiske, medisinske og diagnostiske funn som må vurderes ved tolking av QFT-resultater (tabell 2 og 3). Tabell 2. Når Nil-, TB-antigen- og Mitogen-rør brukes Nil (IU/ml) 8,0 TB-antigen minus Nil (IU/ml) TB-antigen minus Nil (IU/ml) QFT-resultat Rapport/tolkning <0,35 0,5 Negativ M. tuberculosis-infeksjon er IKKE sannsynlig 0,35 og <25 % av Nil-verdi 0,35 og 25 % av Nil-verdi 0,5 Negativ Hvilket som helst resultat Positiv <0,35 <0,5 Ubestemt 0,35 og <25 % av Nil-verdi <0,5 Ubestemt M. tuberculosis-infeksjon er IKKE sannsynlig M. tuberculosis-infeksjon er sannsynlig Resultatene er ubestemmelige for følsomhet for TB-antigen Resultatene er ubestemmelige for følsomhet for TB-antigen >8,0 Hvilket som helst resultat Hvilket som helst resultat Ubestemt Resultatene er ubestemmelige for følsomhet for TB-antigen * Reaksjoner på mitogenpositiv kontroll (og innimellom TB-antigen) kan være vanlig utenfor området til mikroplateleseren. Dette har ingen påvirkning på testresultatene. Hvis det ikke er mistanke om M. tuberculosis-infeksjon, kan initielt positive resultater bekreftes ved å teste de originale plasmaprøvene på nytt to ganger i QFT ELISA. Hvis gjentatt testing av en eller begge replikatene gir et positivt resultat, bør testen betraktes som positiv. Les avsnittet om feilsøking for eventuelle årsaker. I kliniske studier hadde mindre enn 0,25 % av kandidatene IFN-γ-nivåer på >8,0 IU/ml for Nil-verdien. Hvor høyt det målte IFN-γ-nivået er, har ingen sammenheng med infeksjonsstadiet eller hvor omfattende infeksjonen er, hvordan immunforsvaret er eller sannsynligheten for progresjon til aktiv sykdom. Tolkning Nei TB-antigen Nil 0,35 IU/ml Nei Ja TB-antigen Nil 25 % av Nil IU/ml-verdien Ja Validering Ja Nei Mitogen Nil <0,50 IU/ml og/eller Nil >8,0 IU/ml Ubestemt Nil 8,0 IU/ml Nei Ja Negativ Positiv Figur 3. Flytskjema for tolkning når Nil-, TB-antigen- og Mitogen-rør brukes. 18 Pakningsvedlegg for QuantiFERON TB Gold (QFT) ELISA 07/2013

19 Tabell 3. Når kun QuantiFERON Nil- og TB-antigenrør brukes Nil (IU/ml) 8,0 TB-antigen minus Nil (IU/ml) QFT-resultat <0,35 Negativ 0,35 og <25 % av Nil-verdi Negativ Rapport/tolkning M. tuberculosis-infeksjon er IKKE sannsynlig M. tuberculosis-infeksjon er IKKE sannsynlig 0,35 og 25 % av Nil-verdi Positiv* M. tuberculosis-infeksjon er sannsynlig >8,0 Hvilket som helst resultat Ubestemt Resultatene er ubestemmelige for følsomhet for TB-antigen * Hvis det ikke er mistanke om M. tuberculosis-infeksjon, kan initielt positive resultater bekreftes ved å teste de originale plasmaprøvene på nytt to ganger i QFT ELISA. Hvis gjentatt testing av en eller begge replikatene gir et positivt resultat, bør testen betraktes som positiv. I kliniske studier hadde mindre enn 0,25 % av kandidatene IFN-γ-nivåer på >8,0 IU/ml for Nil-verdien. Les avsnittet om feilsøking for eventuelle årsaker. Hvor høyt det målte IFN-γ-nivået er, har ingen sammenheng med infeksjonsstadiet eller hvor omfattende infeksjonen er, hvordan immunforsvaret er eller sannsynligheten for progresjon til aktiv sykdom. Tolkning Nei TB-antigen Nil 0,35 IU/ml Ja Nei TB-antigen Nil 25 % av Nil IU/ml-verdien Ja Validering Ubestemt Nei Nil 8,0 IU/ml Ja Negativ Positiv Figur 4. Flytskjema for tolkning når kun QuantiFERON Nil- og TB-antigenrør brukes. 8. Begrensninger Resultater fra QFT-testing må brukes i sammenheng med hver enkelt persons epidemiologiske historie, aktuelle medisinske status og andre diagnostiske vurderinger. Personer med Nil-verdier som er høyere enn 8 IU/ml, klassifiseres som "ubestemmelige" fordi en 25 % høyere respons til TB-antigener kan være utenfor analysens måleområde. Upålitelige eller ubestemte resultater kan oppstå på grunn av: Avvik fra prosedyren beskrevet i pakningsvedlegg for QuantiFERON-TB Gold (QFT) ELISA Høye nivåer av sirkulerende IFN-γ eller tilstedeværelse av heterofile antistoffer Mer enn 16 timer fra blodprøvetaking til inkubering ved 37 C Pakningsvedlegg for QuantiFERON-TB Gold (QFT) ELISA 07/

20 9. Ytelseskarakteristikker Kliniske studier Siden det ikke finnes en endelig standard for latent tuberkuloseinfeksjon (LTBI), kan ikke et estimat av sensitivitet og spesifisitet for QFT vurderes i praksis. Spesifisiteten for QFT ble anslått ved å vurdere falske positive rater hos personene med lav risiko (ingen kjente risikofaktorer) for tuberkuløs infeksjon. Sensitiviteten ble anslått ved å vurdere pasientgrupper med kulturbestemt aktiv TB-sykdom. Spesifisitet I en amerikansk studie som omfattet 866 frivillige, ble det tatt blod til QFT i forbindelse med en tuberkulintest. Demografisk informasjon og risikofaktorer for TB ble bestemt ved hjelp av en standardskjema som ble utfylt på testtidspunktet. Blant 432 frivillige uten kjente risikofaktorer for M. tuberculosis-infeksjon var QFT- og TST-resultatene tilgjengelige for 391 av dem. Ingen av dem var BCGvaksinert. En annen spesifisitetsstudie ble utført med QFT hos personer med lav risiko, i Japan, der ca. 90 % hadde tatt BCG-vaksinen. Resultater fra de 2 spesifisitetsstudiene er angitt i tabell 4. Tabell 4. QFT-spesifisitet: Resultater for personer uten rapportert risiko for M. tuberculosis-infeksjon Studie BCG-status (% vaksinert) Totalt testet Antall QFTubestemmelige Antall QFTpositive / antall gyldige tester QFTspesifisitet (95 % CI) Antall TSTpositive / antall testet TST*- spesifisitet (95 % CI) USA (ikke publisert) 0 % /390 99,2 % (98 100) 6/391 98,5 % (97 99) Japan (15) ~90 % /162 98,8 % (95 100) Totalt 559 7/559 (1,3 %) 5/552 99,1 % (98 100) * Bruk av 10 mm TST-cutoff hos personer ikke vaksinert med BCG. TST-testens spesifisitet er 99,1 % dersom en 15 mm cutoff benyttes. Sensitivitet for aktiv TB Personer med mistanke om TB fra USA, Australia og Japan, som hadde en kulturbekreftet M. tuberculosis-infeksjon ble testet for å vurdere QFT-sensitivitet. Siden det ikke finnes en endelig standardtest for latent TB-infeksjon (LTBI), vil et egnet surrogat være mikrobiologisk dyrking av M. tuberculosis siden pasienter med sykdommen per definisjon er smittet. Pasientene har fått mindre enn 8 dager med behandling før QFT-blodprøvetaking. Tabell 5 oppsummerer funn fra de 3 pasientgruppene med kulturbestemt M. tuberculosis-infeksjon. Den generelle sensitiviteten for QFT for aktive TB-sykdom var 89 % (157/177). 20 Pakningsvedlegg for QuantiFERON TB Gold (QFT) ELISA 07/2013

21 Tabell 5. QFT: Personer med kulturbekreftet M. tuberculosis-infeksjon Studie Antall QFT-positive / antall gyldige tester QFT-sensitivitet (95 % CI) TB-pasienter i Japan (15) 86/92 93 % (86 97 %) Australsk 24/27 89 % (70 97 %) Amerikansk 47/58 81 % (68 90 %) Totalt 157/ % (83 93 %) LTBI-diagnose Flere studier er publisert som viser ytelsen til QFT i ulike populasjoner utsatt for LTBI. Hovedfunnene til noen av de valgte studiene er angitt i tabell 6. Tabell 6. Utvalgte publiserte studier på QFT i populasjoner som er utsatt for LTBI Studie Totalt testet Resultater og funn Healthcare workers in India (Pai, et al 2005) (26) Danish HIV+ patients (Brock, et al 2006) (5) Hospitalized children in India (Dogra, et al 2006) (10) Contact investigations in Germany (Diel, et al 2006) (9) 726 Undersøkelse med svært høye TB-andeler. 40 % QFT-positive og 41 % TST-positive ved 10 mm. Høy konkordans med TST, ingen effekt av BCG på noen sider. Begge testene har tatt hensyn til risikofaktorer som alder og arbeid innen helsevesenet. 590 Allmenn forekomst av LTBI med QFT var 4,6 % (27/590) blant HIV+smittede. Positive resultater ble assosiert med TB-risiko. To pasienter med positive QFT-resultater utviklet aktiv TB i løpet av ett år. Ubestemmelige reaksjoner (n=20, 3,4 %) var sterkt knyttet til en CD4-verdi på <100/µl. 105 Barn med mistanke om TB eller tidligere hatt en historie med TB, ble testet med QFT og TST; 10,5 % QFT-positive og 9,5 % TST-positive ved 10 mm. Den generelle overensstemmelsen mellom testene var 95,2 % og 100 % blant de som ikke var BCG-vaksinert. 309 Nærkontakt til 15 ulike indekskasuser ble testet: 51 % var BCG-vaksinert, 27 % født i utlandet; 70 % av de BCG-vaksinerte og 18 % av de uvaksinerte var TST-positive (5 mm), mens hhv. 9 % og 11 % var QFTpositive. QFT ble forbundet med TB-risiko. TST ble bare forbundet med BCG-vaksinasjon. Mange andre publikasjoner beskriver effektiviteten til den mindre sensitive, flytende antigenversjonen av QuantiFERON-TB Gold (forgjengeren til QFT) og QFT-testen. Disse studiene omfatter bruk av testen(e) i kontakt med aktive TB-kasuser (9, 11, 19, 25), barn (6 10, 25, 28), HIV-positive pasienter (2, 5, 20), helsearbeidere (13, 26, 32), pasienter med nedsatt immunforsvar (3, 4, 22, 23, 27, 30, 31) i tillegg til pasienter med mistanke om TB (7, 8, 10, 18) samt personer med lav risiko (15). Repeterbarhet og effekt av TST på etterfølgende QFT-testing Som en del av den amerikanske spesifisitetsstudien ble en undergruppe av frivillige testet på nytt mellom 4 og 5 uker etter den første QFT- og TST-testen. QFT-resultatene for 260 rekrutterte deltakere var tilgjengelig på begge tidspunktene, og overensstemmelsesnivået var på 99,6 % (259/260). En tidligere TST medførte ikke positive QFT-reaksjoner. Pakningsvedlegg for QuantiFERON-TB Gold (QFT) ELISA 07/

22 10. Teknisk informasjon Ubestemte resultater Ubestemte resultater bør være sjeldne og kan knyttes til testpersonens immunstatus, men det kan også være en rekke tekniske faktorer involvert: Mer enn 16 timer fra blodprøvetaking til inkubering ved 37 C Oppbevaring av blod utenfor det anbefalte temperaturområdet (17 27 C) Utilstrekkelig blanding av blodtakingsrør For dårlig vasking av ELISA-platen Hvis det er mistanke om tekniske problemer ved prøvetaking eller behandling av blodprøver, må hele QFT-testen gjentas med en ny blodprøve. Det er mulig å utføre ELISA-testing på stimulert plasma på nytt dersom det er mistanke om utilstrekkelig vasking eller andre prosedyreavvik i forbindelse med ELISA-testen. Ubestemmelige tester som oppstår ved lave Mitogen- eller høye Nil-verdier er ikke forventet å endre seg ved gjentakelse, med mindre det var en feil med ELISA-testingen. Ubestemmelige resultater skal rapporteres som ubestemmelige. Legen kan velge å ta en ny prøve eller utføre andre egnede prosedyrer. Koagulerte plasmaprøver Hvis det dannes fibrin i forbindelse med langvarig oppbevaring av plasmaprøver, kan prøvene sentrifugeres for å sedimentere det koagulerte materialet og forenkle pipetteringen av plasma. 22 Pakningsvedlegg for QuantiFERON TB Gold (QFT) ELISA 07/2013

23 Feilsøkingsveiledning Denne feilsøkingsveiledningen kan være nyttig for å løse problemer som kan oppstå. Du finner mer teknisk informasjon på: Se baksiden for kontaktinformasjon. ELISA-feilsøking Ikke-spesifikk fargeutvikling Mulig årsak Løsning a) For dårlig vasking av platen Vask platen minst 6 ganger med 400 µl vaskebuffer per brønn. Mer enn 6 vaskesykluser kan være nødvendig avhengig av vaskemaskinen som brukes. La vaskebufferen virke i minst 5 sekunder mellom hver syklus. b) Krysskontaminering av ELISAbrønner c) Sett/komponenter er utløpt på dato d) Enzymsubstratløsningen er kontaminert e) Blanding av plasma i QFT-rør før innsamling Vær forsiktig ved pipettering og blanding av prøvene for å redusere risikoen for krysskontaminering. Se til at settet brukes før utløpsdatoen. Kontroller at rekonstituert standard og konjugat 100X-konsentrat brukes innen tre måneder etter rekonstitueringsdatoen. Kast substratet dersom det forekommer blå fargeskjær. Forsikre deg om at rene reagensbeholdere brukes. Etter sentrifugering må du unngå å pipettere opp og ned eller blande plasma på noen måte før innsamling. Du må til enhver tid passe på å ikke å forstyrre materialet på geloverflaten. Avlesninger av lav optisk tetthet for standarder Mulig årsak Løsning a) Standard fortynningsfeil Se til at fortynninger av settstandard klargjøres riktig i henhold til pakningsvedlegget for QFT ELISA. b) Pipetteringsfeil Sørg for at pipettene er kalibrert og brukes i henhold til produsentens instruksjoner. c) Inkubasjonstemperaturen er for lav Inkubasjon av ELISA skal utføres ved romtemperatur (22 C ±5 C) d) Inkubasjonstiden er for kort Inkubasjon av plate med konjugat, standarder og prøver skal være i 120 ±5 minutter. Enzymsubstratløsningen inkuberes på platen i 30 minutter. e) Feil filter brukes i plateavleseren Platen skal leses ved 450 nm med et referansefilter på mellom 620 og 650 nm. f) Reagensene er for kalde Alle reagenser, med unntak av 100X-konjugatkonsentratet, må bringes til romtemperatur før du begynner analysen. Dette tar ca. en time. g) Sett/komponenter er utløpt på dato Se til at settet brukes før utløpsdatoen. Kontroller at rekonstituert standard og konjugatkonsentrat 100X brukes innen tre måneder etter rekonstitueringsdatoen. Pakningsvedlegg for QuantiFERON-TB Gold (QFT) ELISA 07/

24 ELISA-feilsøking Høy bakgrunn Mulig årsak Løsning a) For dårlig vasking av platen Vask platen minst 6 ganger med 400 µl vaskebuffer per brønn. Mer enn 6 vaskesykluser kan være nødvendig avhengig av vaskemaskinen som brukes. La vaskebufferen virke i minst 5 sekunder mellom hver syklus. b) Inkubasjonstemperaturen er for høy c) Sett/komponenter er utløpt på dato d) Enzymsubstratløsningen er kontaminert Inkubasjon av ELISA skal utføres ved romtemperatur (22 C ±5 C). Se til at settet brukes før utløpsdatoen. Kontroller at rekonstituert standard og konjugatkonsentrat 100X brukes innen tre måneder etter rekonstitueringsdatoen. Kast substratet dersom det forekommer blå fargeskjær. Forsikre deg om at rene reagensbeholdere brukes. Ikke-lineær standardkurve og variabilitet mellom duplikat Mulig årsak Løsning a) For dårlig vasking av platen Vask platen minst 6 ganger med 400 µl vaskebuffer per brønn. Mer enn 6 vaskesykluser kan være nødvendig avhengig av vaskemaskinen som brukes. La vaskebufferen virke i minst 5 sekunder mellom hver syklus. b) Standard fortynningsfeil Se til at fortynninger av standarden klargjøres riktig i henhold til pakningsvedlegget for QFT ELISA. c) Dårlig blanding Bland reagensene grundig ved å snu dem opp og ned eller ved å vortekse dem før de settes på platen. d) Inkonsekvent pipetteringsteknikk eller avbrudd under oppsett av analysen Prøve- og standardtillegg skal utføres på kontinuerlig måte. Alle reagenser skal klargjøres før analysen starter. Aanalyseprosedyrevideo og løsninger på de fleste tekniske problemene er å finne på Gnowee ved å registrere deg direkte på for å få tilgang på nettet. Produktinformasjon og teknisk veiledning er gratis tilgjengelig fra QIAGEN via distributøren eller på 24 Pakningsvedlegg for QuantiFERON TB Gold (QFT) ELISA 07/2013

25 11. Bibliografi En fullstendig liste over QFT-referanser ligger på Gnowee QuantiFERON-referansebiblioteket på 1. Andersen, P. et al. (2000) Specific immune-based diagnosis of tuberculosis. Lancet 356, Balcells, M.E. et al. (2008) A comparative study of two different methods for the detection of latent tuberculosis in HIV-positive individuals in Chile. Int. J. Infect. Dis. 12, Bartalesi, F. et al. (2009) QuantiFERON-TB Gold and TST are both useful for latent TB screening in autoimmune diseases. Eur. Respir. J. 33, Bocchino, M. et al. (2008) Performance of two commercial blood IFN-gamma release assays for the detection of Mycobacterium tuberculosis infection in patient candidates for anti-tnf-alpha treatment. Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 27, Brock, I. et al. (2006) Latent tuberculosis in HIV positive, diagnosed by the M. tuberculosis specific interferon-gamma test. Respir. Res. 7, Chun, J.K. et al. (2008) The role of a whole blood interferon gamma assay for the detection of latent tuberculosis infection in bacille Calmette-Guerin vaccinated children. Diagn. Microbiol. Infect. Dis. 62, Connell, T.G. et al. (2008) A three-way comparison of tuberculin skin testing, QuantiFERON-TB gold and T-SPOT.TB in children. PLoS ONE 3, e2624. doi: /journal.pone Detjen, A.K. et al. (2007) Interferon-gamma release assays improve the diagnosis of tuberculosis and nontuberculous mycobacterial disease in children in a country with a low incidence of tuberculosis. Clin. Infect. Dis. 45, Diel, R. et al. (2009) Comparative performance of tuberculin skin test, QuantiFERON-TB-Gold In-Tube assay, and T-Spot.TB test in contact investigations for tuberculosis. Chest 135, Diel, R. et al. (2008) Predictive value of a whole-blood IFN-γ assay for the development of active TB disease. Am. J. Respir. Crit. Care Med. 177, Diel, R. et al. (2006) Tuberculosis contact investigation with a new, specific blood test in a low-incidence population containing a high proportion of BCG-vaccinated persons. Respir. Res. 7, Dogra, S. et al. (2007) Comparison of a whole blood interferon-gamma assay with tuberculin skin testing for the detection of tuberculosis infection in hospitalized children in rural India. J. Infect. 54, Drobniewski, F. et al. (2007) Rates of latent tuberculosis in health care staff in Russia. PLoS Med. 4, e Gerogianni, I. et al. (2008) Whole-blood interferon-gamma assay for the diagnosis of tuberculosis infection in an unselected Greek population. Respirology 13, Harada, N. et al. (2008) Comparison of the sensitivity and specificity of two whole blood interferongamma assays for M. tuberculosis infection. J. Infect. 56, Higuchi, K. et al. (2009) Comparison of performance in two diagnostic methods for tuberculosis infection. Med. Microbiol. Immunol. 198, Kang, Y.A. et al. (2005) Discrepancy between the tuberculin skin test and the whole-blood interferon gamma assay for the diagnosis of latent tuberculosis infection in an intermediate tuberculosis-burden country. JAMA 293, Katiyar, S.K. et al. (2008) Use of the QuantiFERON-TB Gold In-Tube test to monitor treatment efficacy in active pulmonary tuberculosis. Int. J. Tuberc. Lung Dis. 12, Pakningsvedlegg for QuantiFERON-TB Gold (QFT) ELISA 07/

26 19. Kipfer, B. et al. (2008) Tuberculosis in a Swiss army training camp: contact investigation using an Interferon gamma release assay. Swiss. Med. Wkly. 138, Luetkemeyer, A. et al. (2007) Comparison of an interferon-gamma release assay with tuberculin skin testing in HIV-infected individuals. Am. J. Respir. Crit. Care Med. 175, Mackensen, F. et al. (2008) QuantiFERON TB-Gold - A new test strengthening long-suspected tuberculous involvement in serpiginous-like choroiditis. Am. J. Ophthalmol. 146, Manuel, O. et al. (2007) Comparison of Quantiferon-TB Gold with tuberculin skin test for detecting latent tuberculosis infection prior to liver transplantation. Am. J. Transplant. 7, Matulis, G. et al. (2007) Detection of latent tuberculosis in immunosuppressed patients with autoimmune diseases performance of a Mycobacterium tuberculosis antigen specific IFN-gamma assay. Ann. Rheum. Dis. 67, Mirtskhulava, V. et al. (2008) Prevalence and risk factors for latent tuberculosis infection among health care workers in Georgia. Int. J. Tuberc. Lung Dis. 12, Nakaoka, H. et al. (2006) Risk for tuberculosis among children. Emerging Infect. Dis. 12, Pai, M. et al. (2005) Mycobacterium tuberculosis infection in health care workers in rural India: comparison of a whole-blood, interferon-g assay with tuberculin skin testing. JAMA 293, Ponce de Leon, D. et al. (2008) Comparison of an interferon-gamma assay with tuberculin skin testing for detection of tuberculosis (TB) infection in patients with rheumatoid arthritis in a TB-endemic population. J Rheumatol. 35, Richeldi, L. et al. (2008) Prior tuberculin skin testing does not boost QuantiFERON-TB results in paediatric contacts. Eur. Respir. J. 32, Rothel, J.S. and Andersen, P. (2005) Diagnosis of latent Mycobacterium tuberculosis infection: is the demise of the Mantoux test imminent? Expert Rev. Anti Infect. Ther. 3, Schoepfer, A.M. et al. (2008) Comparison of interferon-gamma release assay versus tuberculin skin test for tuberculosis screening in inflammatory bowel disease. Am. J. Gastroenterol. 103, Silverman, M.S. et al. (2007) Use of an interferon-gamma based assay to assess bladder cancer patients treated with intravesical BCG and exposed to tuberculosis. Clin. Biochem. 40, Stebler, A. et al. (2008) Whole-blood interferon-gamma release assay for baseline tuberculosis screening of healthcare workers at a Swiss university hospital. Infect. Control Hosp. Epidemiol. 29, Pakningsvedlegg for QuantiFERON TB Gold (QFT) ELISA 07/2013