FilmArray BioThreat panel

Transkript

1 FilmArray BioThreat panel Erfaringer fra Beredskapslaboratoriet NITO BFI kurs 2018 Tone Bjordal Johansen, FHI Beredskapslaboratoriet Biosikkerhet BSL3 agens BSL4 agens - hanskebenk 1

2 Nasjonalt Mikrobiologisk Beredskapslaboratorium Beredskapsvakt 24/7 Nasjonalt beredskapslaboratorium for mikrober knyttet til bioterror Pulverbrev Annen mistanke om bioterroragens Kliniske prøver med mistanke om høypatogene agens Tilgjengelig for politi, helseforetak, medisinsk-mikrobiologiske laboratorier og andre offentlige instanser Tilbyr RT-PCR og dyrkning av en rekke agens, ulike hurtigtester av toksiner og multiplex- analyser av høypatogene agens og toksiner Nasjonalt referanselaboratorium for Brucella spp., Bacillus anthracis, Burkholderia mallei / pseudomallei Avtale med Folkhälsomyndigheten i Sverige om ytterligere analyse av BSL4 agens Bioterror vs biologisk hendelse Biologisk hendelse: Mistankeom eller bekreftet eksponering for et biologisk agens som krever ekstraordinær handling og beredskap Naturlige utbrudd Ebola Pest Uhell / mislighold Laboratorieuhell Malpraksis Kriminell handling Bioterror intensjonell handling 2

3 Bioingeniøren, mars 2018 Våre viktigste agens Bacillus anthracis anthrax / miltbrann Yersinia pestis pest Coxiella burnetii Q feber Burkholderia mallei snive Burkholderia pseudomallei pseudosnive Brucella sp. brucellose Francisella tularensis- tularemi / harepest Virale hemorragiske febere(ebola / Marburg / CCHF) MERS-CoV Botulinumtoksin Ricin 3

4 Varsling av prøve til vakthavende lege ( ) Innsendelse (kategori A eller B transport) Mottak av prøve, prøveopparbeidelse i BSL3 laboratorium Hurtigdiagnostikk FilmArrayog RT PCR Dyrking og verifiserende analyser AST testing Slektskapsanalyser / utbruddsetterforskning Agens Analyse Referansefunksjon Bacillus anthracis Real-time PCR og dyrkning Ja Brucella spp. Real-time PCR og dyrkning Ja Burkholderia pseudomallei Real-time PCR og dyrkning Ja /mallei Yersinia pestis Real-time PCR og dyrkning Ja* Francisella tularensis ssp. Real-time PCR og dyrkning Coxiella burnetii Real-time PCR MERS CoV Real-time PCR Ja* CCHFV Real-time PCR Toksiner Ricin/agglutinin Hurtigtest Stafylokokk enterotoksin B (SEB) Hurtigtest Botulinum neurotoksin type A (BoNT-A) Multiplex analyser FilmArray TM BioThreat panel Annet AST testing WGS Hurtigtest Real-time PCR for BoNT-A, B, C og E 16 ulike target, høypatogene agens og toksiner Mikrobuljongfortynning Ved behov 4

5 FilmArray TM Black box«all-in-one» multiplex PCR system Kit for «syndromic diagnosis» Respiratory panel Blood culture identification panel Gastrointestinal panel Meningitis Encephalitis panel BioThreat panel Biomerioux BioFireDefense Bacillus anthracis, 3 Targets Brucella melitensis, 2 Targets Burkholderia mallei / pseudomallei, 2 Targets Clostridium botulinum Coxiella burnetii, 2 Targets Ebola virus (Zaire) EEE virus F. tularensis, 2 Targets Marburg virus, 2 Targets Ricinus communis Rickettsia prowazekii, 2 Targets Variola virus VEE virus, 2 Targets WEE virus Yersinia pestis, 2 Targets Orthopox virus, 2 Targets 5

6 Prosedyre og prinsipp Kvalitetskontroll Hver pouch har internkontroll (frysetørket Schizosaccharomyces pombe) target er RNA transkript Hver PCR analyseres i triplikat. Software evaluerer alle tre replikater ved positivt resultat, to av tre må være positive for å rapportere som påvist. Tmmå ikke avvike mer enn ±1 C Flere agens har to eller tre target 6

7 Biosikkerhet Fra BioFireDefence: The loading buffer contains high concentrations of Guanadinium salt. It is very effective at inactivating most bacteria and virus for samples without excessive biologic/organic load. It is NOT effective against sporulated bacillus. Understand that for pathogens like Ebola, the viral titers in body fluids of highly infected patients can be greater than 10e10/ml. Even with a high log kill for the buffer, it is hard to guarantee it will be completely effective against such numbers. In house testing av inaktivering P. aeruginosa 5, 10 og 15 min. i sample buffer Ingen vekst F. tularensis 10 min. i sample buffer Ingen vekst Biosikkerhetstiltak FilmArray maskinen inne på BSL3 laboratoriet Prøve tilsettes i sikkerhetsbenk(bscii) Hvis mistanke om B. anthracis sporer i pulver eller virale agens i kategori BSL4 - hanskeboks (BSCIII) Prosedyre for uhell 7

8 Validering Spikede prøver, ringtestprøver og pasientprøver ble analysert Generelt svært gode resultater Seiner DR et al. J ApplMicrobiol2013: -LOD 250 genomiske ekvivalenter (GE) per prøve for Bacillus anthracis, Francisella tularensis og Yersinia pestis -kryssreaksjon med nært beslektet DNA ikke påvist Filmarray brukt som supplement til diagnostikken siden 2016 Krav Evaluere praktisk bruk og eventuelle begrensinger med kitet Ikke mål å bestemme analytisk sensitivitet og spesifisitet Raskt og enkelt supplement til diagnostikken ved beredskapslaboratoriet for deteksjon av aktuelle BSL3 agens, og at den kan brukes ved analyse av de ulike prøvematerialer Beredskapslaboratoriet analyserer Metoden skal ha en sensitivitet som er i samsvar med publiserte data og som er sammenlignbar med resultater oppnådd med realtime PCR og evt. dyrking. Metoden skal være spesifikk, dvsat den i minst mulig grad skal gi falske positive resultater Begrensninger Kostnad på kit begrenser antall analyser Flere agens som kitetdetekterer har vi ikke tilgjengelig for testing Begrenset mengde prøvemateriale 8

9 Eksempel på kjøringer Prøve Målbakterie Matrix Realtime PCR FilmArray resultat Vurdering FBD14 ( ) Blank+ Y. p + B. mel serum 22,2 (Y.p) 25,2 (B. mel) Y. p og B. mel OK NBDN15 ( ) B. pinni + F. tul hol + Str. equi vann 27,0 (Bscp31), 27,4 (fopa) 28,3 (IsFtu2) Brucella sp. + F. tul OK NBDN15 (09) + inaktivert kultur B. abo +B. psm (10-10 fortynning) melk 21,8 (Bscp31) B.psm i.u Brucella sp. B. m / B. psmnot detected Detekterte ikke lav fortynning av B. psm Inaktivert kultur x 4 B. mel+ B. cereus+ BoNTA+BoNTB blod i.u B. mel + C. botulinum OK M2, pas. prøve B. mel (påvist ved dyrking) Blodkultur Ja, negativ på direkte realtime PCR. Inhibisjon B. mel OK Ikke inhibisjon på FilmArray Q3 (inaktivert 03+04) B. suis + Y. p blod 25,6(Bscp31) 21,7(ypo393) 17,5(pla) 21,2(Caf1) Brucella sp. + Y. p OK RKI E1 01 ringtest B. pinni bakterieopplsemming 32,9 (bscp31), 30,3 (BMeII0466) B. mel Skulle vært rapportert som Brucella sp. Fikk også resultat for B. mel på realtime PCR E1 inakt B. mel+ B.m + F tul tul Serum+ PBS 33 (Bscp31), 31(BMeII0466), 21 (B. m) 27 (tul4), 27 (fopa), 27 (F.tul tul) B. mel B. m / psm F.tul OK Q2-08 B. canis HCA softagar Brucella sp OK Erfaring Brucella spp. B. melitensis detekteres med Filmarray B. abortus, B. pinnipedialis og B. suis rapporteres som Brucella spp FilmArray positive nårvanligreal-time PCR var negativ pga PCR inhibitorer (blodkultur) OBS: Et isolat(slp) av B. pinnipedialis blerapporertsom B. melitensis (ID konfirmert med Bruceladder) Coxiella burnetii Detekterer C. burnetii Smeltekurveanalyse- falsk positiv B. pinnipedialis SLP prøve 9

10 Francisella tularensis F. tularenis tularensis, F. tularensis holarctica og F. tularensis novicida- alle rapporteres som F. tularensis F. philomiragiableogsårapportertsom F. tularensis Positiv pasient prøve(bal), som var analysertmhp B. pseudomallei. Real-time PCR ogdyrking; negativtfor beggeagens. Diagnose senere bekreftet m/ serologi Bacillus anthracis Positiv for pxo1 and pxo2 rapporteres som B. anthracis detektert Hvis en eller begge plasmider mangler rapporteres som Bacillus sp. detektert og med resultatet for hvert plasmid Bra resultaternårordinær real-time PCR viste hemming (SLP prøve) Beslektede Bacillus spp. ikke rapportert Melt curve analysis - false positive F. philomiragia Yersinia pestis Y. pestis -detekteres Y. pseudotuberculosis ikke rapportert Falskpositive pasientprøve(direkteogi oppdyrketbuljong). Ogsåpositive for plavedreal-time PCR, men ikkefor caf1 eller ypo393. Ulikeenterobakterier detektertveddyrking(citrobacter, Enterobacter, E. coli) Enterobacteriaceae positive for pla genet er tidlgere beskrevet (ArmougomF et al Front Microbiol 2016, HänschS et al BMC Res Notes 2015) 10

11 Andre agens Burkholderia mallei/pseudomallei: Detekterer begge arter, men skiller ikke mellom dem Clostridium botulinum Detekterer C. botulinum type A. Vi testet C. botulinum type A, B, E og F -OK Marburg virus Inaktiverte SLP prøver analysert Marburg virus detektert Ebola virus EBOV Zaire detektert(inaktivert SLP) EBOV Sudan ikke detektert Matriks Bakteriekultur Blodkultur Lysert DNA Ekstrahert DNA og RNA Pasientprøver (vevsprøver, blod, BAL, CSF, leddvæske mm) Miljøprøver (pulver, jord) SLP 11

12 Diagnostisk flow Vurdering: prøvetype, klinikk, arbeidstid eller vakt Prøve pasientprøve Miljø/ pulver FilmArray valgfritt (unntatt pulver) Direkte realtime PCR Dyrking Bekreftendetester (PCR, Maldi-tof, andre) Oppsummering FilmArray TM BioThreatpanel - Raskt og nyttig verktøy + - Enkel, raskogegnetfor ulikematriks God sensitivitet Verdifullt supplemang for diagnostisk panel Egnet i vaktsammenheng Kostnad Enprøveom gangen Skiller ikke mellom alle nært beslektede agens Falsk positiv Y. pestis Resulter må evalueres og bekreftes med andre metoder 12