Enzymer til forskning og diagnostikk: kunnskapsbasert forretningsutvikling Dag Rune Gjellesvik, Biotec Marine Biochemicals AS Norsk Kjemisk Selskap Avd Nordnorge 13. Desember 2010
Selskapsstruktur fra 2011 Biotec Pharmacon ASA Adm / QA Biotec Marine Biochemicals AS (ArcticZymes) Biotec BetaGlucans AS 2 December 14, 2010
Kuldetilpassede marine enzymer Marine organismer fra nordområdene er tilpasset kaldt miljø Enzymene må fungere i lav temperatur Nøkkelegenskaper for marine enzymer: Høy aktivitet ved lav temperatur Enkel inaktivering med moderat temperaturøkning Ofte overraskende forskjeller i andre egenskaper Gir av-knapp nyttig i mange sammenhenger!
Produksjon av pepsin fra torskeslo Basert på autolyse av torskemager: Pepsin-enzymene spalter opp andre proteiner Celler brytes ned, fett frigjøres og floteres, noe protein feller ut Pepsin konsentreres ved ultrafiltrering av klarfase, peptider fjernes Konsentratet spraytørkes Resultat: ca. 50 kg produkt fra 1 tonn 5 % renhet Avsluttet i 2000
Bruk av enzymer til fiskeforedling Anvendelser utviklet for fiskeindustrien Proteaser ble brukt til: Skjelling Produksjon av kaviar Skinning av akkar
Forskning og diagnostikk: Fordeler med varmeinaktivering Prosesser med mange trinn: Bytte av reagenser mellom trinn Fysiske separasjonsmetoder Mer hands-on tid Mindre utbytte Større feilrisiko Enzymatisk fjerning av reagens Enkel prosess Høyt utbytte Enzym fjernes med varmeinaktivering Lite hands-on tid Enkel prosess (oppvarming)
Hva gjør et enzym salgbart? Anvendelse og nytteverdi bestemmer Forenkling i prosedyrer Økt sikkerhet: fool proof faktor Mindre hands-on tid Automatiserbarhet Kunnskap om anvendelse absolutt kritisk Prosess Betingelser (kjemisk / fysisk) Begrensninger Markedsstørrelse In-house kompetanse best, ellers samarbeid med ekspertise Våre kunder er ikke enzymologer
Krav til produkt Produksjon Tilstrekkelig skala Tilstrekkelig kvalitet Dokumentert prosess Kvalitetssikret Reproduserbar Spesifikasjon Renhet Stabilitet Dokumentasjon Egenskaper Aktivitet / stabilitet / betingelser Anvendbarhet Praktiske eksempler Flere plattformer Komparative data
Tromsø Senter for marin bioprospektering MabCent SFI MARZyme NOFIMA UNIS Smallstruct UiT Norstruct (Norwegian Structural Biology Centre) Marbio Marbank 9 17 November 2010 Investorlunsj BioTech North
Veier til nye produkter Nytt enzym med nye egenskaper MabCent MarZyme Forskningsmiljø Teste / utvikle prosess / anvendelse Nytt produkt Applikasjon med mangler Kunder
Forskning: viktigste teknikker Kloning; overføre gen til mikroorganisme Lime gen inn i vektor Dyrke bakterier ved seleksjon PCR: Amplifisere DNA Milliardfold oppkopiering av spesifikke deler av DNA DNA sekvensering Bestemme koden i DNA Radikal omveltning i teknologi de siste år
Molekylær diagnostikk: viktigste teknikker Påvisning av virus/ mikroorganismer ved PCR Spesifikk amplifisering av virus/bakterie-dna RNA-virus: RNA kopieres til DNA først; RT-PCR Kvantifisering av virus ved PCR HIV viral load monitorering av infeksjon Genotyping individuell genetisk variasjon Varianter av CYP450 medikamentmetabolisme Mutasjoner i kreft (ex. NorDiag) Påvisning av arvelige sykdommer / bærere av slik Mye ny teknologi under utvikling Mønster av genuttrykk som indikator for sykdom (ex. DiaGenic)
Enzymer som forskningsverktøy Uten enzymer - ingen genteknologi Enzymer modifiserer DNA/RNA spesifikt Restriksjonsenzymer DNA ligaser Fosfataser Nukleaser eller kopierer DNA/RNA polymeraser DNA sekvensering PCR-amplifisering Små volumer lite enzym nanogram per reaksjon / analyse
Første finkjemikalie-enzym Shrimp Alkaline Phosphatase (SAP) Prosjektstart i 1986 Utnyttelse av biprodukter fra fiskerinæringen ( Fiskeriforskning ) Lansert av Marine Biochemicals (Norsk Hydro) i 1990 For konjugering til antistoff For DNA-modifisering av USB Fordel framfor enzymet fra kalv Produsert av Biotec fra 1993 (Annonse i Nature 1990)
Høyrenset enzym fra prosessvann Råstoffbasert start NFR finansierte åpent prosjekt ved Fiskeriforskning: Utnyttelse av biprodukter Rekeindustri Prosessvann fra tining av reker vasket ut proteiner Alkalisk fosfatase Verktøy i genteknologisk forskning Verktøy i diagnostikk Kuldetilpasset enzym Kan fullstendig varmeinaktiveres Høye krav til renhet Kontaminantnivå < 1:10 6
Fra avfall til finkjemikalie Tinevann: 1 µg/ml - 0.01% renhet Konsentrat: 100 µg/ml - 0,1 % renhet Kromatografi: 4 mg/ml 100% rent 4,000 x konsentrert 10,000 x renere
Usikker råstofftilgang Rekeindustrien har hatt problemer Kun to produsenter igjen i Troms Råstoff må hentes fra Senja Sikring mot endring i produksjon? Alternativ kilde: Genteknologi Genet som koder for enzymet er isolert Genet overført til gjærceller Gjærcellene dyrkes i kultur (fermentor) Gjærcellene produserer enzymet og skiller det ut i mediet
Vektor for transformasjon Pichia pastoris Methylotrof gjær Kan vokse på metan SAP-genet Alkohol oxidase (AOX) Metanol formaldehyd Induseres av metanol Høye nivå (20-30%) Promoter for AOX1 driver ekspresjon SAP-genet induseres med metanol SAP-gen skjøtes sammen med sekresjonspeptid Friskt His-syntesegen selekterer for rekombinanter 18
Homolog rekombinasjon og seleksjon 19 December 14, 2010
Genteknologi: sikker og bærekraftig Full kontroll med råstofftilgang Produsere etter behov Renere råstoff Høyere innhold Lite variasjon Null forbruk av ressurser Ett individ dekker produksjonsbehovet for all framtid! Mulighet for produktforbedring Egenskapene kan endres ved å endre genet.
SAP for å begrense tomme vektorer Defosforylering av vektor ( CIP ing ) Fjerner bakgrunn av tomme vektorer ved kloning av DNA-fragmenter
Sekvensering av PCR-produkter Sekvensering av DNA Benytter di-deoxy nukleotider (stopper syntesen) dda: A A A Krever et bestemt forhold mellom deoxy- og dideoxy nukleotidene. PCR produkt Inneholder alle nukleotidene som deoksy- Nukleotidene må fjernes før sekvensering
SAP/Exo metode: Enzymatisk fjerning av primere og dntp
Kontaminasjonskontroll i PCR PCR: Ekstremt sensitiv Eksponensiell amplifisering > 1,000,000,000 x template Deteksjonsgrense: 1-10 DNA-molekyler Høy risiko for kontaminasjon PCR produkter fra tidligere kjør Kan amplifiseres Finnes i store mengder (relativt til kilde-dna) Er mest sannsynlig kontaminant Carry-over contamination Kontaminasjonskontroll er kritisk for diagnostisk PCR / RT-PCR
Hvordan unngå problemet Fysiske metoder Aldri åpne rør etter PCR Bruk aerosol-beskyttede pipetter Eget rom for tillaging av templat Eget rom for tillaging av reagenser UV-behandling av utstyr Andre fysiske barrierer Aldri 100% idiotsikkert Enzymatiske metoder Behandling med Uracil-DNA glycosylase Idiotsikker closed tube metode krever dutp i nukleotidemix ALLTID! Polymerase må kunne bruke dutp dsdna-spesifikk DNase Trenger ikke modifisert nukleotidemix Kan brukes som førstehjelp
Bruk av Uracil-DNA N-glycosylase (UNG) Prinsipp: PCR produkt kjemisk forskjellig fra templat dutp erstatter dttp i alle PCR reaksjonsmixer Uracil erstatter thymidine i PCR produktene alle PCR produkter inneholder U PCR protokoll starter med UNG behandling Uracil-DNA N-glycosylase (UNG) fjerner Uracil-basen fra DNA Kilde-DNA inneholder T, degraderes ikke INGEN carry over PCR kontaminanter blir amplifisert U GAUCCUGGACAUUCGA U U U GA CC GGACA GA CC GGACA CGA Uracil-DNA glykosylase 95 C CGA
Hva er fordelen med UNG fra torsk? 0 E.c R E Cod Andre UNG-enzymer inaktiveres også med varme, men reaktiveres etterpå 0 E.c R E Cod Reaktivert UNG degraderer PCRprodukt Ubrukelig for seinere analyse UNG fra torsk reaktiverer IKKE PCR-produkt tilgjengelig for analyse Sekvensering Genotyping
UNG og RT-PCR? RT-PCR starter med RNA RNA må først kopieres til cdna med revers transkriptase (RT) Closed tube protokoll: cdna vil inneholde Uracil Et aktivt UNG enzym vil degradere U- cdna Lav eller ingen sensitivitet Men ikke med kuldetilpasset UNG UNG fra torsk er aktivt ved 25-30 C RT-enzymet lite aktivt cdna produseres ikke RT, 45-50 C UNG RNA U -DNA PCR SIGNAL UNG fra torsk inaktiveres raskt ved 50 C (temperatur i RT-trinn) UNG borte når cdna er produsert
UNG fra torsk i ny HIV-test Siemens lanserte RT-PCR analyse for HIV virus Har utviklet analysen siden 2005, med vårt UNG som komponent CE-godkjent i desember 2008, under godkjenning i USA Versant kpcr HIV viral load test Siemens har i tillegg flere nye under utvikling Hepatitt C Cytomegalovirus