KJ2050 Analytisk kjemi, GK (Analyse ved kromatografisk separasjon) 1. Innledning (og noe terminologi) 2. Noe generell teori A. Retensjonsparametre B. Sonespredning C. Sonespredningsmekanismer 3. Korte innføringer til spesifikke teknikker A. Væskekromatografi (Liquid Chromatography, LC) a) Innledning b) Instrumentering B. Gasskromatografi (Gas Chromatography, GC) 4. Kromatografi i analyser
Vi ser på: a : viktige kromatografiske elementer 1. & 6. b : viktige tekniske elementer : 2. & 8. 1. Elueringsmiddel 2. pumpe(r) 3. injektor 4. filter ("In-line"-filter) 5. "guard column" (beskyttelseskolonne) 6. kolonne 7. evt. kolonne-ovn 8. detektor 9. evt. fraksjonsoppsamler 10. skriver, integrator, PC 2
3.A. b. 1. Elueringsmiddelet = MF Elueringsmiddelet, MF, må ha evne til å transportere analyttene "passe rask" forbi den aktuelle SF. (Isokratisk system) 1. Elueringsmiddel Valget avhenger av type prøve & kolonne (= separasjonsproblemet) Kompatibel med SF Valgt slikt at (helst) k ~ 2 5 kompatibel med detektoren(e) (kan være vanskelig og kritisk), og høy renhet (særlig ved sporanalyse og ved prep. HPLC): destillert, filtrert, tørt, optisk gjennomsiktig Luftfritt (viktig ved gradient analyser, el. ved bruk av elektrokjemisk eller fluorscens-detektor). Oppnådd best v.h.a. avgassere (vakuum/membran-avgassere, He-bobling) minst mulig viskøs - hvis man har valget (ved ellers tilsvarende / tilfredsstillende egenskaper) "Typiske" HPLC-løsningsmidler: - NP: heksan, diklormetan, metyl-tert.-butyleter, THF (=tetrahydrofuran) - RP: vann, metanol, acetonitril, THF H 3 C H 3 C H 3 C 3
3.A. b. 1. Elueringsmiddelet Elueringsvarianter: NB: blandings-nøyaktighet kritisk (for riktig og reproduserbar k el. t R ) a) isokratisk : normal-eluering (tilsv. isotermisk GC) samme elueringsmiddel-sammensetning hele tiden samme MF-hastighet (ofte) - toppbredden øker ca. proporsjonalt med t R - t R øker eksponensielt for forbindelser i homologe serier. b) gradient-metoder : (s.n.; tilsv. T-programmert GC) løsningsmiddel-styrken forandres underveis - trinnvis eller kontinuerlig, som regel økning i styrke, 2 eller flere løsningsmidler - tillater større variasjon i prøvekomponentenes retensjon - kan tilpasses spesielle prøvers behov (f.eks.: variere ph in IEC) NP upolar polar RP polar upolar 4
3.A. b. 1. Elueringsmiddelet Isokratisk vs. gradient-eluering (eks.) Obs.: Isokratisk: 7 & 8: ca. k = 5, basis-linje-separert med god k-verdi; Gradient: Basislinje-separert topp 1,2 & 3; men ikke helt for 7 & 8. Noe endrede løsningsmiddel-forhold under eluering flytter topp 5 og 7 fra hhv. nært 4 og 6 til hhv. nært 8 og veeeldig nært 6. 5
3.A. b. 6. Kolonnen Utforming: Rør fylt med pakningsmateriale som er stasjonærfasen : Pakkede kolonner: Vanlige: rør-indre diam.: 2-4,6 mm, 10 mm ytre diam. : ca. 2,5-6 mm (flest) lengder: (3,) 5, 10, 15, 25 cm / ca. 4", 6", 10") SF holdes på plass i røret av : - filterskiver ("frits"), med pore-strørrelser 0,5-2 (?) m), og... - koblinger som "holder kolonnen sammen" (holder filterskivene på plass) og... brukes til å tilkoble MF inn- og utgangs-ledningene. Ofte (ikke alltid) symmetrisk bygget (mulig å bruke i begge retninger). Kapillærkolonner - pakkede kapillær-kolonner: (begynner å bli brukt, spesielt for LC/MS) 0,2-1 mm i.d., lengde 20-50 cm (MF-strøm: L/min : LC-MS-direkt-kobling) - WCOT kapillær-kolonner: (svært eksotiske) 0,01-0,03 mm i.d., lengde: mange meter (rekord-platetall: 10 6 - men også rekord-t R : dag). 6
3.A.b. 6. Kolonnen Kolonner kjøpes som regel ferdigpakket - bruksklare. Effektivitet: typisk analytisk HPLC-kolonne: N = ca. 10.000-20.000 H ca. 2,5 d p people.whitman.edu Trykkfast: må tåle høyt trykk både innhold og "forpakning" (noen ganger begrenset av mekanisk stabilitet til SF ): opp til 200-400 bar for partikler ned til 3 m, opp til over 1000 for mindre, < 2 m (UHPLC). www.waters.com 7
3.A.b. 6. Kolonnen Utforming av pakningsmaterialer: sfærisk,......... irregulær,.......... helt porøs (vanligst)......... kompakt,............ overflateporøs (core-and-shell, pellicular, superficially porous),....... monolitter (eng.: "Monoliths") ikke-partikkel-basert stasjonær fase - makro-/mikro-porøst faststoff som blokk/stav, som fyller ut kolonnerøret helt (- "in-situ"-støpt) 8
3.A.b. 6. Kolonnen Utforming av pakningsmaterialer: Partikkel-størrelser i dag (HPLC): ( ca. 2 m (kompakt) ca. 30-2 m (helt-porøs) Vanligst d p pr. i dag : 10-3 m (analytiske), 10-30 (mikro-)preparative kolonner www.kromasil.com Jevn størrelse viktig standardavvik for d p ca. 1 m (vanligvis) (monodispers - avvik på veldig få prosent (jfr. Ugelstad-kuler)) www.arcsceiences.com 9
3.A.b. 6. Kolonnen Hovedtyper pakningsmaterialer - separasjonsmekanismer : Jfr. Innledningen : "Klassifisering av kromatografi-teknikker" / "Etter separasjonsprinsipp" og 3.A.a: Fordelings-faser (RP og NP) Adsorpsjonsmidler : normalfase (NP) og omvendt fase (RP) Ionebyttere (for ionebytterkromatografi, IEC, og 'Ionekromatografi') Geler (mikroporøse, for eksklusjonskromatografi, SEC). Selektive faser ( sterisk/geometrisk selektive interaksjoner) bl.a. for kirale separasjoner og for affinitetskromatografi 10
3.A.b. 6. Kolonnen Spesielt viktig separasjonstype (den mest brukte i HPLC)) : Omvendt-fase stasjonærfase-materialer (RP): ( RP polar MF og upolar SF ) Retarderer upolare analytter mest - polare minst. Det brukes hovedsakelig derivatisert silika med upolare organiske substituenter ("Bonded (Silica) Phases"). 11
3.A.b. 6. Kolonnen Spesielt viktig separasjonstype (den mest brukte i HPLC)) : Omvendt-fase stasjonærfase-materialer (RP): ( RP polar MF og upolar SF ) Det brukes hovedsakelig derivatisert silika med upolare organiske substituenter - gruppene bundet til silika-silanol-gruppene (kjemisk stabil for ph 2-7). Typiske upolare substitutenter : C18, C8, C2 (m.fl.), c-c6h11, fenyl) mest brukte upolar fase i HPLC er oktadekyl-grupper, -n-c 18 H 37, (typiske forkortelser : "RP18", "C18", "ODS"). 12
3.A.b. 6. Kolonnen Omvendt-fase stasjonærfase-materialer (RP): Mest brukte upolar fase (RP-fase) i HPLC oktadekyl-grupper, -n-c 18 H 37, (typiske forkortelser : "RP18", "C18", "ODS"). Viktigst blant dem, såkalte Monomere faser ("Brushes"; enkelt-substituenter på ca. 50% av silanolgruppene) : \ -Si-OH / + Cl Si(CH 3 ) 2 C 18 H 37 -Si-O Si(CH 3 ) 2 C 18 H 37 Og evt. + Cl Si(CH 3 ) 3 (= end-capping) Polar fase - hydrofil Figur : Startmaterial (silikagel) og sluttprodukt ("end-capped" oktadekylsilika) av denne reaksjonen; litt urealistisk sterkt silylert (d.v.s. mer enn 50 %!) og med end-capping (som en TMS-gruppe). 13
3.A.b. 6. Kolonnen upolar polar Vekselvirkninger av analytten (eks. 4-propyl-benzylalkohol) med fasene for hhv. NP- og. for RP-Kromatografi Polar MF - hydrofil polar Upolar MF - hydrofobisk upolar upolar Polar SF - hydrofil polar 14
3.A.b. 6. Kolonnen Eksempel av eluering for RP-Kromatografi: R = polar upolar (1) (4) (11) (15) (16) (21) (24) (-di-opa) fluorescerende "Uspesifisert (hemmelig) SF-kjemi: trolig et omvendt-fase (RP) SF-material 15
3.A. b. 2. Pumper : må levere væske med nøyaktig kontrollert flow i fra 0,1-0,5 opp til 5-10 ml/min; fra få nl/min og opp ved kapillær-lc) lite pulsering programmerbare flow -endringer mot stort mottrykk (må levere høyt væsketrykk). svært ulike kjemiske egenskaper høy renhet mest brukt : - (Resiprokerende) stempelpumper (for større væskestrøm-mengder) eller - sprøytepumper (for lave MF-strøm, mikro- og kapillær-lc) 16
3.A.b. 8. Detektorer Mest vanlige i dag: UV-synlig detektor Følsomhet analytt-spesifikt, d.v.s. avhengig av bølgelengde og absorbtivitet). er fra temmelig følsomt til helt ufølsomt: For UV-synlig detektor kan en oftest velge bølgelengde (-område) for lysdeteksjon: v.h.a. - spesielle lamper (f.eks. Hg-lampa), - lysfiltre - gitter-monokromatorer. Avanserte versjoner av monokromator-detektorer kan også registrere fortløpende hele UV/synlig-spektra underveis ("Diode Array" detektorer). Noen noe mindre brukte LC-detektorer: brytningsindeks (RI), konduktometri (i IEC), laser-lysspredning ( light scattering ), fluorescens, elektrokjemisk, etc. Fra læreboken (SWHC8 (2004), kap. 32, s. 979) I dag mye (mer og mer) brukt: Massespektrometeret, i "koblet LC/MS": Rel. komplekst og dyrt, men (ofte) meget følsomt; med tilleggs-selektiviteten som massespektrometeret gir: (masse(-tall)-selektivitet. 17