KJ2050 Analytisk kjemi, GK Kromatografi (Analytiske separasjoner og kromatografi) Rudolf Schmid 1
Analytiske separasjoner og kromatografi Overblikk : (Lærebok SWHC, Fundam. Analyt. Chem. 8th/2004, s. 920 - ca. 1000; Kromatografi-del: Kap.30E, 31, 32, 33A &B) Tema: Hva er kromatografi Litt om benevning og inndeling av kromatografi-metodene Noe elementær teori (jfr. også læreboken) Litt spesifikt om LC og GC (bl.a. relevant for lab.-demonstrasjonen Demonstrasjoner seinere i semesteret Mer teori (og lab.) om dette tema i emnet : Kromatografi, KJ 2053 (vårsemester), påbygningsemnet Videregående kromatografi, KJ 3059 (masterkurs, høstsemester). 2 2
Analytiske separasjoner og kromatografi Arbeidsprogram «Kromatografi» : Forelesninger: Tir. 18. oktober & 25. (evt. m. noe øvingsopplegg hvis tid) Øvinger : 24.10. brukes til forelesning om kromatografi Lab/Demo GC og HPLC: (analyse av aromater i bensin) seinere i semesteret (anbefalt lesing, lab-tekst til forhenværende lab-forsøk) Planlagt framdrift : 2. Terminologi og noe generell teori 3. Korte innføringer til spesifikke teknikker: A: Væskekromatografi (Liquid Chromatography, LC) B: Gasskromatografi (Gas Chromatography, GC) 4. Om kromatografi i analyser 3 3
1.A. Noe historisk - (ultra-)kort-versjon : Kromatografi : før 1900 kun sporadisk og ubevisst / tilfeldig brukt. Ca. 1905 botanikker Mikhail Semenovich Tswett (1872-1919), russisk Første systematiske anvendelser (som tilsvarer adsorpsjonskolonnekromatografi). 4 4
1.A. Noe historisk - (ultra-)kort-versjon : Tsvett "spylte" porsjoner av plante-pigmenter ned gjennom et glassrør fylt med kalsiumkarbonat (kalk(-stein)) v.h.a. løsningsmidler, f.eks. petroleums-eter. Ulike fargede soner ble separert når pigmentene forflyttet seg med løsningsmiddelstrømmen med ulik hastighet ned gjennom kalsiumkarbonat-pulveret til ulike plasser lang kolonnen. Tsvett kalte fargemønstrene som oppsto : "kromatogram" og separasjonsmetoden : "kromatografi" (fra klassisk-gresk: chromos = farge 'grafein' = skrive). "Tsvett's resultater ble lite lagt merke til i 35-40 år. men deretter gikk det raskt 5 5
1.A. Noe historisk - (ultra-)kort-versjon : I dag er kromatografi en av de viktigste separasjons- og analyse-metoder innen analytisk kjemi: Både separasionsevne og følsomhet er i dag meget høye på det beste, f.eks. dusinvis-hundrevis av komponenter i samme prøve separeres, og ned til femtogram (10-15 g ) -mengder og innenfor minutter (noen ganger sekunder!!) Kromatografi-metodene kan være både skånsomme og raske. Kromatografi: Youtube TLC-Flu : (Chro-w-Fluorsc_pt2_lpColChro_DataApex_Youtube_gzpS0e9o8s_1501) 6 6
1.B. (Litt) definisjoner og nomenklatur : Prinsippet for kromatografi Definisjon iflg. IUPAC (1993) : " Chromatography is a physical method of separation in which the components to be separated are distributed between two phases, one of which is stationary (stationary phase) while the other (the mobile phase) moves in a definite direction. " International Union of Pure and Applied Chemistry, "Nomenclature for chromatography (IUPAC Recommendations 1993). Pure & Appl. Chem. 65, 819 (1993) " Kromatografi er en fysikalsk separasjonsmetode der komponentene som skal separeres fordeles mellom to faser, hvorav den ene er stillestående (den stasjonære fasen) mens den andre (den mobile fasen) forflytter seg i en bestemt retning. (Uautorisert norsk oversettelse ved Rudolf Schmid, 2008) 7 7
1.B. (Litt) definisjoner og nomenklatur : Prinsippet for kromatografi Ved kromatografi transporteres analyttene (prøvekomponentene) i en MOBIL FASE (MF) forbi en STASJONÆRFASE (SF) MF : fluid (væske, gass, superkritisk fluid) SF : fast stoff, væske Ulike prøvekomponenter separeres fordi den mobile fasen har varierende evne til å forflytte dem i forhold til den stasjonære fasen. Prøvekomponentene (analyttene) forflyttes bare når de befinner seg i den mobile fasen, MF. Når de er i / på den stasjonære fasen, SF, er de i ro (bortsett fra evt. ordinær diffusjon - som er ikke retningsbestemt, stokastisk bevegelse). 8 8
1.B. (Litt) definisjoner og nomenklatur : Prinsippet for kromatografi Hastigheten av hver komponent bestemmes av forholdet mellom "reisetid" og "hviletid", noe som - for et stort antall molekyler - tilsvarer hver komponents mengde-forhold i h.h.v. den mobile og den stasjonære fasen. Hastigheten som oppnås er et uttrykk for de enkelte komponentenes relative affiniteter til de to fasene, hhv. den mobile og den stasjonære. 9 9
1.B. (Litt) definisjoner og nomenklatur : Prinsippet for kromatografi Hastigheten som oppnås er et uttrykk for den enkelte komponentens relative affiniteter til de to fasene, hhv. den mobile og den stasjonære : høy affinitet til SF : komponenten er mest i/på SF, dermed i ro, og forflytter seg (elueres) langsomt; høy affinitet til MF : komponenten er mest i MF, dermed i "full fart", og forflytter seg (elueres) raskt. 10 10
1.B. (Litt) definisjoner og nomenklatur : Prinsippet for kromatografi Eksempel på analogi (på det molekylære nivået) : Flåtetur på en elv Den mobile fasen, MF : Den stasjonære fasen, SF : Prøvekomponent-molekyler : elvevannet elvebredden flåter (uten aktiv fremdrift) Hoved-regelen : "Øker affiniteten til elvebredden, minsker gjennomsnits-reisehastigheten." 11 11
1.B. (Litt) definisjoner og nomenklatur : Prinsippet for kromatografi Flåte-kjøring / rafting...... Eksperter, full fart, uten pauser rask framdrift (like raskt som elvevannet, maksimal fart) (stor "affinitet til flytende vann" / liten "affinitet til elvebredden")... med pauser av og til noe forsinket (i forhold til vannet) (mindre raskt, saktere enn elvevannet)... med vannskrekk, mange, lange pauser lite framdrift, meget langsom (i forhold til vannet) (stor affinitet til "elvebredden" / liten "affinitet til flytende vann") Uansett om det går raskt eller langsomt framover -- oppholdstiden på det strømmende elvevann er like lang for alle. Forskjellen ligger i tiden på landet / på bredden! 12 12
1.B. (Litt) definisjoner og nomenklatur : Prinsippet for kromatografi Litt terminologi: "Bremsvirkningen" av stasjonærfasen på prøvekomponentenes framdrift i MF: Retensjon (eller retardering) Utviklingen av et kromatogram (generelt) og framdriften av prøvekomponentene på grunn av den mobile fasens forflytting (spesielt) : Eluering 13 13
1.C. Klassifisering av kromatografi-teknikker : 1.C. 1. Etter separasjonsprinsipp : Metode Natur av hovedprosessen Parameter, bestemmende faktor(er) for affiniteten mellom prøve og SF, Adsorpsjonskromatografi Adsorpsjon Kad : Adsorpsjons-koeffisient / (-konstant) Fordelingskromatografi Fordeling ("ekstraksjon") KD : Fordelings-koeffisient / (-konstant) Ionebytterkromatografi Elektrostatisk tiltrekning, kompleksering Kompleks-likevekts-konstant ; ionestørrelse, ionladning Eksklusjonskromatografi (Hindret) diffusjon Kav KD : Fordelings-koeffisienter ; effektiv poreog molekylstørrelse (Bio-)affinitetskromatografi (Bio-)spesifikke vekselvirkninger mellom prøve og "selektiv ligand" Ingen generell parameter (evt. Michaelis-Menten konst. for enzym-substrat komplekser 14 14
1.C. Klassifisering av kromatografi-teknikker : 1.C. 2. Etter fasenes natur : Stasjonær fase (SF) Mobil fase (MF) gass fast stoff væske LSC Forkortelse (fra engelsk) GSC (Gas-Solid Chro.) (Liquid-Solid Chro.) _ superkritisk fluid SFC (Supercritical Fluid Chro.) væske væske gass LLC (Liquid-Liquid Chro.) GLC (GC) (Gas-Liquid Chro.) Navn adsorpsjons-gasskromatografi, gass-faststoff-kromatografi adsorpsjons- (væske-) kromatografi Superkritisk fluid kromatografi væskæ-væske-kromatografi Gass- (væske-) kromatografi (N.B.: helt utenom : elektroforese-teknikker, (SWHC 8. utg, kap. 33C)) 15 15
1.C. Klassifisering av kromatografi-teknikker : 1.C. 2. Etter fasenes natur : Flere varianter, innenfor denne inndelingen : GC: (er som regel gass-væske-kromatografi): - "klassisk" gasskromatografi (med pakkede kolonner) - kapillærkolonne -gasskromatografi ("høytoppløsende" GC; eng.: HRGC) LSC: (adsorpsjons-kromatografi) - klassisk adsorpsjons-kromatografi (søyle-kromatografi (inkl. "Flash"-kromatografi) og HPLC) - tynnsjikt-kromatografi (eng. TLC) (og tørr-kolonne-kro.) (men : obs! obs! TLC er ofte - men ikke bare - LSC : - ionebytter-kromatografi og (bio-)affinitetskromatografi (?) - omvendt fase (reversed phase) kromatografi (?) LLC: (fordelings-kromatografi ) - "klassisk" væske-væske-kromatografi ( historisk ) - papirkromatografi (nesten historisk), cellulose-tynnsjikt-kromatografi - motstrømsfordelings-kromatografi (CCC) - eksklusjonskromatografi (gelkromatografi, "SEC"). - omvendt fase (reversed phase) kromatografi (?) 16 16
1.C. Klassifisering av kromatografi-teknikker : 1.C. 3. Etter teknikker, apparaturer, m.m.:... bl.a. etter utformingen av systemet : - kolonnekromatografi (søylekromatografi) - planar kromatografi (tynnsjikt-, papirkromatografi)... bl.a. etter fasenes polaritet : - "normal fase"-kromatografi : stasjonær fase (SF) = polar mobil fase (MF) = upolar - "omvendt fase"-kromatografi: stasjonær fase (SF) = upolar mobil fase (MF) = polar... bl.a. etter framdriftsmetoden for MF : - hydrodynamisk drevet kromatografi (ved overtrykk/sug eller kapillærkrefter, den absolutt mest vanlige) - elektrokromatografi (ved elektro-osmotisk strømning (delvis fortsatt på forskningsstadium, (kanskje) på vei til mer generell anvendelse) 17 17
1.C. Klassifisering av kromatografi-teknikker : 1.C. 3. Etter teknikker, apparaturer, m.m.:... Etter utviklingsmetode : Den absolutt mest vanlige metoden (og eneste omtalte her): Eluerings-kromatografi (eng.: elution chromatography) Små prøvemengde i stort kromatografisystem: mye stasjonær fase og mobil fase i forhold til prøvemengden (typisk 1:100 1:10 x ). F.eks.: kolonnekromatografi : Mye MF ("elueringsmiddel") med rel. lav affinitet til SF (lavere enn analyttene). En liten prøvemengden (som regel fortynnet) - påsettes kolonnen, - vaskes inn i / gjennom SF av (og sterkt fortynnet i) den mobile fasen (som har svakere affinitet til SF enn prøvekomponentene). "Eluering" av komponentene, fortynnet i MF, skjer rel. sakte, (med (tilnærmet) likevektsinnstilling av analyttene mellom SF og MF) - Analyttene detekteres / registreres i MF når de forlater kolonnen (jfr. figuren). 18 18
1.C. Klassifisering av kromatografi-teknikker : 1.C. 3. Etter teknikker, apparaturer, m.m.:... Etter utviklingsmetode : Eluerings-kromatografi den mest vanlige metoden Jfr. : A.D.C. Skoog & al. : Fund.of An.Ch. 8 th (2004) : p. 922 - Ch. 30.E. Kromatografi: Youtube - TLC-Flu: (Youtube-com_Flash-Kromatog-fargestoffer_Buechi-ul2011_dl-1601_rs-ed) 19 19
1.C. Klassifisering av kromatografi-teknikker : 1.C. 3. Etter teknikker, apparaturer, m.m.:... Etter utviklingsmetode : Ideelt (i eluerings-kromatografi): Under den kromatografiske prosessen : Hvert analytt-molekyl konkurrerer med MF-molekylene om "å bli retardert" av stasjonærfasen (adsorbert på, oppløst i, "lagt stille" av) - altså konkurrerer ikke direkte men indirekte - med de øvrige komponentene av prøven. Ofte er fullstendig separasjon av alle prøve-komponenter mulig (som da foreligger som oppløsninger i elueringsmiddelet), som adskilte soner / bånd / "topper" ( / fraksjoner). Typisk (som vist i fig 30-6) : ved eluering over HELE kolonnelengde Karakterisering av "toppene" ved volum, eller tiden, det tar dem for å nå kolonneutgangen: retensjonsvolum, eller retensjonstid retensjonstids-akse 20 20
Som tilvenning - noen kromatogram (lånt fra kolonne-produsenters skrytesider : "Applications"). Her : Polysykliske aromater (PAH): analysert ved gass kromatografi GC) Fra Restek (fra en test-løsning) 21 21
Som tilvenning - noen kromatogram (lånt fra kolonne-produsenters skrytesider : "Applications"). Her : Aminosyreanalyse (etter derivatisering): analysert ved væskekromatografi (HPLC) Fra Grace Davison Discorevy Sciences (fra en test-løsning) 22 22