Hva bør man tenke på ved valg av kromatografi som analysemetodikk Ingeborg Amundsen 4. februar 2015
Agenda Kromatografiske metoder Ny analysemetode- viktige spørsmål Screening/bekreftelse Ny analysemetode-hvor starter vi Metodevalidering
Kromatografi- en svært anvendelig analyse metodikk Miljøgifter (mat og luft) Oljer, gasser og aromastoffer Proteiner og aminosyrer Gener Vitaminer og hormoner Legemidler og narkotiske stoffer
Kromatografiske metoder Kromatografisk separasjon Gasskromatografi Væskekromatografi Spesifikk detektor Massespektrometri
Prinsipp for Kromatografi (separasjon av stoffer) Eksempel: Væskeromatografi (LC) Mobil fase: Væske (ofte blanding av flere) Stasjonær fase: Kolonne pakket med små partikler <2µm Kromatografi; Separerer stoffer fra hverandre ved at de vandrer med forskjellig hastighet i et system med en mobil- og en stasjonær fase Opprenset prøve injiseres med sprøyte i systemet og føres med væskestrømmen gjennom kolonna Kolonne (5-10 cm) A Buffer B Organisk løsningsmiddel (metanol) Ectasy Amfetamin Morfin
Prinsipp for Massespektrometri (MS) Danner og analyserer ioner Stoffet ioniseres og spaltes (fragmenterer) Analyserer i vakuum (gassfase) Måler masse over ladning, m/z Svært spesifikk teknikk Vi veier ioner! Derav navnet massespektrometri
Ny analysemetode Viktige spørsmål Hvor mange komponenter skal være med i metoden Kvalitativ/kvantitativ Hva skal prøveresultatene brukes til Hvor mange prøver skal analyseres Hva slags prøvemateriale Hvor mye prøvemateriale
Viktige spørsmål forts. Skal metoden brukes til rutinedrift Skal metoden publiseres Hva er publisert tidligere Analyttenes egenskaper: pka verdi, polaritet, LogP verdi Tilgjengelige instrumenter Høydoserte/lavdoserte stoffer
Hva er viktigst Lav deteksjonsgrense Pålitelige resultater God separasjon Rene prøveekstrakter Rask kromatografi Lite løsemiddelforbruk Lite forbruk av matriks Ergonomi
IS-13 Prøveresultatet benyttes kun til behandling og diagnostikk Medisinske analyser Analysen trenger ikke å være spesifikk En screeninganalyse Positiv prøve 1 metode og 1 uttak
Screening metode Positive/negative prøver Prøveopparbeidelse som tar høyde for at alle komponenter ekstraheres UPLC-MS/MS: Benytter 1 MRM overgang for stoffene Mest fokus rund påvisningsgrensen
IS-14 Prøveresultatet kan danne grunnlag for alvorlige sanksjoner Rettstoksikologiske analyser Et positivt resultat skal alltid bekreftes med nytt uttak fra prøven med en spesifikk teknikk Positiv prøve 2 metoder og 2 uttak pos pos Mottak Registrering Screening Bekreftelse Vurdering påvist stoff(er) negativ negativ Ikke påvist Ikke påvist
Bekreftelsesmetode Ønsker metoder for komponenter med noenlunde samme kjemiske egenskaper Spesifikk prøveopparbeidelse Separasjonsprinsippet i UPLC forskjellig fra screeningen 2 MRM overganger Konsentrasjonsområde for komponentene
Eksempler på komponenter som kan ekstraheres sammen Mianserin pk a 8,3 MW 264,16 C 18 H 20 N 2 Mirtazapin pk a 7,1 MW 265,16 C 17 H 19 N 3 Nortriptylin pk a 9,9 MW 263,17 C 19 H 21 N Paroxetin pk a 9,9 MW 329,14 C 19 H 20 FNO 3 Trimipramin pk a 9,8 MW 294,21 C 20 H 26 N 2 Sertralin pk a 9,48 MW 305,07 C 17 H 17 Cl 2 N
Oppstart analysemetode UPLC-MS/MS Finne MRM-overganger til komponentene NH Mianserin m/z 265 m/z 208 NH N Mirtazapin m/z 266 m/z 195
Oppstart analysemetode UPLC-MS/MS Finne MRM-overganger til komponentene Finne aktuelle internstandarder
Intern standard Et kjemisk stoff som tilsettes i en konstant mengde til prøver, de blanke kontroller og kalibreringsstandarder Korrigerer for tap av analytt under prøveopparbeidelse Korrigerer for matrikseffekter Gjerne deuteriummerket analytt
Oppstart analysemetode UPLC-MS/MS Finne MRM-overganger til komponentene Finne aktuelle internstandarder Teste ulike kolonner og mobilfaser
TIC for BEH Fenyl kolonne med mobilfase bestående av 5 mm ammoniumbikarbonatbuffer ph 8 og MeOH
TIC for BEH C 18 kolonne med mobilfase bestående av 5 mm ammoniumacetatbuffer ph 5 og ACN
TIC for BEH C 18 kolonne med mobilfase bestående av 5 mm ammoniumbikarbonatbuffer ph 10,2 og MeOH
TIC for BEH C 18 kolonne med mobilfase bestående av 5 mm ammoniumbikarbonatbuffer ph 10,2 og ACN
Sammenligning av retensjonsrekkefølge med ulike separasjonssystemer
Oppstart analysemetode UPLC-MS/MS Finne MRM-overganger til komponentene Finne aktuelle internstandarder Teste ulike kolonner og mobilfaser. Prøveopparbeidelse
Prøveopparbeidelse Opparbeidelses teknikk avhenger mye av matriks BLOD (utfordring: fosfolipider, ioneundertrykkelse) - SPE, LLE, ACN-felling + fosfolipid-removal kolonne (96 format) URIN (utfordring: salter, overdrag, ioneundertrykkelse) - SPE, LLE, Fortynning (96 format), Fortynning + filtrering (96 format) SPYTT (utfordring: prøvetakingsbuffer + diverse tilsetningstoffer, overdrag, ioneundertrykkelse) - LLE LLE = væske-væske ekstraksjon, SPE = fast fase ekstraksjon
Sammenligning av EtG respons i blod med ulike filtreringsplater og utfellingsreagenser 25000 20000 15000 10000 5000 0 20000 18000 16000 14000 12000 10000 8000 6000 4000 2000 0 ACN (EtG) ACN:MeOH(85:15) (EtG)
Oppstart analysemetode UPLC-MS/MS Finne MRM-overganger til komponentene Finne aktuelle internstandarder Teste ulike kolonner og mobilfaser. Prøveopparbeidelse Validering av metoden!
Metodevalidering Robusthetstesting og retensjonstids stabilitet 2,6 2,4 2,2 2 1,8 1,6 1,4 1,2 9-OH Risperidon Risperidon Propranolol Klozapin Hydroxyzin Aripiprazol 1 ph 10 ionestyrke 2,5 mm ph 10,4 ionestyrke 2,5 mm ph 10 ionestyrke 7,5 mm ph 10,4 ionestyrke 7,5 mm ph 10,2 ionestyrke 5,0 mm
Metodevalidering Standardkurve, lineært konsentrasjonsområde Klonazepam Diazepam
Metodevalidering Matrikseffekter: Forhold i prøven som gjør at MS-responsen for en spesiell analytt forandres fordi en matriks er tilstede Exogene stoffer(andre legemidler/narkotika) Endogene stoffer (proteiner, lipider, karbohydrater og salter) MS-responsen kan forsterkes eller undertrykkes
Ioneundertrykking 0,211 0,266 0,369
Fosfolipider Felling kontra LLE 90 % MeOH 98 % MeOH Fosfolipid bakgrunn v/ PPT Fosfolipid bakgrunn v/ LLE 5 % MeOH
Fosfolipider- ulike fosfolipidfjerningsplater
Metodevalidering MDK= minste detekterbare konsentrasjon MKK= minste kvantifiserbare konsentrasjon Metodens presisjon og nøyaktighet Metodens reproduserbarhet og nøyaktighet
Metodevalidering Spesifisitet: Metodens evne til å bestemme analytten nøyaktig i nærvær av andre komponenter i prøven Prøveopparbeidelsen, kromatografisk separasjon og valg av detektor har betydning for metodens spesifisitet
God Spesifisitet N CH 3 Morfin C 17 H 19 NO 3 MV= 285,34 HO O OH N CH 3 Hydromorfon C 17 H 19 NO 3 MV= 285,34 HO O O NH Norkodein C 17 H 19 NO 3 MV= 285,34 H 3 C O O OH
% % UPLC 100 MS/MS N CH 3 201 Morfin HO O OH 183 165 185 155 173 211 229 181 209 145 157 193 268 227 219 123 121 141 161 237 239 107 131 269 255 0 m/z 100 120 140 160 180 200 220 240 260 N CH 3 100 185 Hydromorfon 227 157 HO O O 199 211 229 183 100 171 243 153 128 165 123 187 100 201 129 145 225 161 240 258 268 255 271 0 m/z 100 120 140 160 180 200 220 240 260 H 3 C O O NH OH 0% Norkodein 121 165 181 193 268 225 215 209 236 137 187 153 155 175 207 219 243 253 105 118 132 141 226 269 257 m/z 100 120 140 160 180 200 220 240 260
Metodevalidering Ekstraksjonsutbytte: Hvor mye av analytten går over fra matriks til organisk løsningsmiddel under ekstraksjonen
Metodevalidering Holdbarhet: Standard- og kontroll-løsningene Stoffene i matriks før ekstraksjon Ekstrakter etter ekstraksjon
Metodevalidering Sammenligne resultater Screening/bekreftelse Gammel bekreftelse/ny bekreftelse
Ulik reløsning-ulik respons 1) 10% ACN og 90% 5 mm ammoniumbikarbonatbuffer ph 10,2 2) 30% ACN og 70% 5 mm ammoniumbikarbonatbuffer ph 10,2 3) 25% ACN og 75% 5 mm ammoniumacatatbuffer ph 5.
Sammenligning ny og gammel metode (EtG)
«Krav» til positiv prøve Over påvisningsgrensen (cut-off) Riktig retensjonstid/relativ retensjonstid OK internstandard (høyde, retensjonstid) Krav til ioneratio (MS)
Kromatografiske metoder Ulemper: Vi finner kun de stoffene som er inkludert i metoden (MRM-metoder) Til dels arbeidskrevende og dyr instrumentering Fordeler: Sikrere identifikasjon siden denne gjøres på stoffnivå med krav til retensjonstid, ioneratio og intern standard Kvantitativ, kan si noe om påvirkning Kan raskt ta inn nye stoffer i metoden
Analytiske utfordringer Nye stoffer mangler renstoff Lave konsentrasjoner Veldig like stoffer Tilstrekkelig separasjon Isobare stoffer JWH-073, MW 327,42 JWH-015, MW 327,42
Oppsummering Kromatografiske metoder Sikker identifikasjon av stoff Kvantitativ Ser kun etter de stoff som er lagt inn i metoden Metodevalidering Grundig, for å vite at du har en robust analysemetode som du kjenner svakhetene til!