KJ2053 Kromatografi LSC Preparativ kolonnekromatografi Rapport Pia Haarseth piakrih@stud.ntnu.no Audun Formo Buene audunfor@stud.ntnu.no Laboratorie: C2-115 Utført: 18. februar 2013
Innhold 1 Resymé 1 2 Teori [1] 2 3 Eksperimentelt 5 4 Resultater 6 5 Diskusjon 7 6 Konklusjon 8 A Utregning av platetall 9 B TLC-plate for utvalgte fraksjoner 10 C Excelark med alle fraksjoner 11 1 Resymé Denne laboratorieoppgaven ble gjennomført som del av det obligatoriske laboratorieopplegget i faget KJ2053 Kromatografi ved NTNU våren 2013. Hovedmålet med denne oppgaven var å bli kjent med hvordan preparativ kolonnekromatografi (LSC) fungerer ved å separere en blanding bestående av benzofenon og vanillin. Dette ble gjort ved adsorpsjonskomratografi på en lavtrykkskolonne pakket med silikagel. Det skulle også lages et kromatogram av separasjonen basert på volumregistereringer og TLC-analyse av fraksjonene. Separasjonen fungerte veldig bra med en mobilfase som bestod av 1+2 etylacetat i petroleumseter. Kromatogrammet viste god separasjon mellom de to stoffene, og noe tailing for den siste toppen som var vanillin. Platetallene for kolonnen ble på 33 for benzofenon og 87 for vanillin. 1
2 Teori [1] I adsorpsjonskromatografi benyttes et finfordelt fast adsorpsjonsmiddel som stasjonærfase. Den mobile fasen kan være gass eller væske. Adsorpsjonskromatografi er den eldste av kromatografimetodene og kalles også væske-fast stoff kromatografi (LSC). En separasjon av ulike komponenter er i LSC basert på at de har ulik affinitet til adorpsjonsmiddelet, og at interaksjonen mellom adsorpsjonsmiddelet og analytten er reversibel. Graden av affinitet vil bestemme stoffenes hastighet gjennom kolonnen når mobilfase blir tilført. Interaksjonen mellom stoffmolekylene og adsorpsjonsmidelet skjer i adorpsjonskromatografi på overflaten av stasjonærfasen. Under adsorpsjonsprosessen er det fire intermolekylærekrefter som virker, dispersjon, dipol-dipol-interaksjoner, hydrogenbindinger og svake kovalente bindinger. Dispersjonskrefter er forårsaket av tiltrekningskrefter mellom midlertidige dipoler. Dipol-dipol-interaksjoner er krefter mellom permanente dipoler som dannes som følge av ulik elektronegativet for ulike atomer i molekylet. Hydrogenbindinger er krefter som oppstår mellom protondonorer og protonakseptorer. Svake kovalente bindinger er krefter mellom sure og basiske stoffer, for eksempel mellom sure adsorpsjonsseter på silika og basiske stoffer. Det finnes flere ulike typer adsorpsjonsmidler, de deles inn i de to hovedgruppene polare og uplore adsorpsjonsmidler. Silika, aluminiumoksid, magnesiumsilikat og magnesiumoksid er de viktigste polare adsorpsjonsmidler og aktivt kull er det viktigste upolare. De polare adsorpsjonsmidlene kan igjen deles inn i sure og basiske adsorpsjonsmaterialer. Silika er det vanligste adorpsjonsmiddelet. Silika lages ved å la natriumsilikat og en mineralsyre reagere. Silanolgrupper (Si-OH) gjør overflaten svakt sur. Ulik grad av hydrogenbindinger mellom silanolgruppene gir ulik surhetsgrad på overflaten. For å unngå dette og permanent adsorpsjon ved ved for lav ph, dekativerer man med vann. Vannet blokkerer overflaten og gjør den mindre effektiv. Stoffer blir adsorbert til silika hovedsakelig via hydrogenbindinger. Silika har høy lineær kapasitet og gir høyere effektivitet enn andre adsorpsjonsmidler. 2
Kolonnekromatografi kan gjøres både kvalitativt og preparativt. For kvalitative forsøk kan man bruke små kolonner og separere små mengder stoff. Dette er billigere både med hensyn på utstyr og dyre kjemikalier som mobilfaser. Målet med kvalitative kolonner er å få separert nok stoff til å kunne gjennomføre videre analyser. Preparative kolonner har mye større kapasitet, og vil gi en betydelig mengde prøve som man vil kunne jobbe videre med på laboratoriet som for eksempel del av mer omfattende synteser. For normal-fase adsorpsjon kolonnekromatografi i en silikagelkolonne kan man bruke større mengder stasjonær og mobilfase enn ved TLC. Dette medfører at større prøvemengder kan separeres. I normal-fase kolonnekromatografi brukes polar stasjonærfase og upolar mobilfase. Flash-kromatografi er en type kolonnekromatografi som gir en bedre separasjon og raskere analyser sammenliknet med gravitasjonsstrømskromatografi. I gravitasjonsstrømskromatofrafi brukes relativt store partikler og gravitasjon som framdriftsmiddel for mobilfasen, mens i flash benyttes mindre silikapartikler og moderat overtrykk. Fortynning av prøven gir lang tailing på prøve-toppene og kan dermed gi overlapp mellom toppene. Dette vil forurense toppene og gi dårlig separasjon. Ved forsiktig påfylling av elueringsmiddel etter riktig prøveapplisering vil mengde fortynnet prøve være neglisjerbar. Det er viktig at prøven er adorbert i kolonnematerialet ved påfylling av elueringsmiddel. Pluggeluering oppstår når løsningsmiddelet til en prøve har høyere elueringsstyrke enn mobilfasen og vil gi uregelmessige og brede asymmetriske topper. Dette kommer av at fordelingen mellom stasjonær- og væskefase blir kontrollert av det sterke løsningsmiddelet og ikke av den svakere mobilfasen rett etter applisering. Dette vil gi en høyere vandringshastighet enn elueringsstyrken til den mobile fasen vil tilsi. Vandringshastigheten vil bli redusert til normal hastighet etterhvert som pluggen blir fortynnet av mobilfasen. For å unngå pluggeluering kan et løsningsmiddel som 3
er svakere enn den mobile fasen bli tatt i bruk, eventuelt å fortynne prøven med et svakere elueringsmiddel. En annen fordel av å fortynne prøven er at det vil gi smale topper som følge av sterkere retardering i starten. Dette er samme prinsipp som blir benyttet i oppkonsentreringssoner i TLC. Når det sterkere elueringsmiddlet innhenter prøven, vil de smale toppene bli eluert som smale bånd med bedre separasjon. For enkelt å analysere fraksjonene fra kolonnekromatografi kan TLC benyttes. Det er ønskelig at R F -verdiene av den minst adsoberte komponenten ligger innenfor 0.3-0.65, og at R F 1/R F 2 > 2 for å få en god separasjon av komponentene. Separasjon av båndsprening er en av de karakteristiske egenskapene til kromatografi. Båndspredning vil si at den appliserte prøven vil bli bredere enn det smale påførte båndet etterhvert som det vandrer gjennom søylen. Båndspredning blir ofte uttrykt med platetallet N. Platetallet sier noe om effektiviteten søylen har til å gi smale bånd for stoffene som skal separers. Platetallet N, er definert som N = ( tr σ R ) 2 = 16 ( tr t w ) 2 (1) der t R er retensjonstiden, σ R er standardavviket for båndet, som tilsvarer toppbredden, og t W er bredden ved basislinjen. Elueringsvolumet er gitt ved V = t F (2) der F er volumhastigheten til mobilfasen i kolonnen. Ved å sette inn for t R og t W vil platetallet kunne uttrykkes som ( ) 2 VR N = 16 (3) V W der V R er retensjonsvolumet og V W er volumet avgrenset av t W. 4
3 Eksperimentelt Det ble brukt den optimerte mobilfasen fra oppgave 1.e., 1+2 etylacetat i petroleumseter og ferdiglaget silikagel. Kolonnen ble pakket fra en silikagel-suspensjon av 25 g silikagel i 100 ml elueringsmiddel. Gelen ble løst i løsningsmiddelet og overført til kolonnen. Gelen sedimenterte før løsningsmiddelet ble tappet av. Kolonnen ble kondisjonert med ca 50 ml elueringsmiddel med lett overtrykk fra nitrogen. Kvartssand ble tilsatt slik at det ble dannet et 1 cm tykt sjikt på toppen av silikagelen. Løsningsmiddelet ble senket ned slik at overflaten var akkurat på toppen av sandsjiktet. Prøven var en 5% blanding av benzofenon og vanillin i diklormetan. 4 ml av denne ble fortynnet med 4 ml petroleumseter og applisert til kolonnen med pipette, og prøvevolumet ble senket ned i silikagelen. Deretter rester av prøven som måtte befinne seg på veggen av kolonnen eller i sanden vasket ned med 3 x 2 ml elueringsmiddel. Dette ble gjort i omganger med tilsats, og deretter senking av overflaten til sandsjiktet. Blanding av vanilin-benzofenon ble separert under flashbetingelser med nitrogengass som inert gass med overtrykk. Fra det tidspunktet prøven ble applisert ble det startet oppsamling av fraksjoner i reagensrør. Dødvolumet ble oppsamlet i 2 fraksjoner av 10 ml, og de resterende fraksjonene var på 5 ml. Etter 5 fraksjoner var samlet opp ble disse avsatt på en silikaplate for TLC. Platen ble undersøkt under UV-lys. 28 fraksjoner ble samlet opp. Da UV-lys viste tailing for den siste toppen ble det tatt med 4 ekstra fraksjoner for å få et godt bilde av den siste toppen. Til slutt ble et representativt utvalg av fraksjonene avsatt på en silikaplate og eluert med 1+2 etylacetat i petroleumseter. På platen ble det også avsatt autentiske standarder for vanillin og benzofenon, samt utgangsløsningen. 5
4 Resultater Intensiteten av stoffene i fraksjonene ble karakterisert fra 1-10, og plottet som funksjon av elueringsvolumet. Kromatogrammet som ble laget er vist i Figur 1. Figur 1: Kromatogram for separasjon av benzofenon og vanillin i en preparativ kolonne pakket med silikagel og eluert med 1+2 etylacetat i petroleumseter. De utregnede platetallene for de to toppene i kromatogrammet, Figur 1, er vist i Tabell 1. Utregningene vedlagt i Appendix A. Tabell 1: Utregnede platetall for de to komponentene i blandingen separert med preparativ kolonnekromatografi. Komponent Utregnet platetall Benzofenon 33 Vanillin 87 6
Informasjon om de forskjellige regionene i kromatogrammet, R F -verdier, totale fraksjonsvolumer og innholdet av fraksjonene, er vist i Tabell 2. Tabell 2: Resultat fra separasjonen av benzofenon og vanillin med kolonnekromatografi. Viser informasjon for de forskjellige områdene i kromatogrammet med fraksjonsvolumer, R F -verdier og innhold. Fraksjon nr. Fraksjonsvolum R F Innhold [ml] 1-4 30 - Tomme fraksjoner, dødvolum 5-11 7 x 5 0.48 Benzofenon 12-15 4 x 5 - Tomme fraksjoner 16-29 14 x 5 0.19 Vanillin Vanillin - 0.21 Standard Benzofenon - 0.50 Standard Mix - 0.2, 0.49 Utgangsblandingen 5 Diskusjon Fra kromatogrammet vist i Figur 1 er det tydelig at separasjonen var god mellom benzofenon og vanillin. Toppen for benzofenon var veldig symmetrisk og normalfordelt, mens toppen for vanillin viste tegn til tailing. Siden det kun var to komponenter i blandingen er det ikke så nøye om det er tailing for siste topp. Hadde det vært flere, mer retarderte stoff i blandingen kan det godt være at separasjonen mellom disse hadde blitt dårligerer på grunn av tailingen fra vanillin. En årsak til tailingen kan være prøverester fra tidligere fraksjoner ved kolonneutløpet. Oppløsningen i kromatogrammet er ganske lav, da kun et representativt utvalg av fraksjonene ble eluert med på silikaplater. Platetallet for kolonnen ble funnet til å være 33 for benzofenon og 87 for vanillin. Utregningen for vanillin er ikke nøyaktig, da denne toppen er svært usymmetrisk. Det gjør at å finne V W er utfordrende og verdien må ses på som kun et estimat. 7
6 Konklusjon Å separere benzofenon og vanillin med normalfase adsorpsjonskolonnekromatografi fungerer svært godt med silikagel og 1+2 etylacetat i petroleumseter. Kromatogrammet som ble laget viste god separasjon mellom komponentene i blandingen. TLC-analysen viste også at stoffene var fullstendig separert og at fraksjonene var rene. For preparativ separasjon av benzofenon og vanillin vil kolonnekromatografi være en bedre metode enn preparativ TLC, da større volum kan påføres, og kolonnen kan brukes flere ganger. Referanser [1] Greibrokk, Lundanes, Rasmussen, ed. 1998. Kromatografi-Separasjon og deteksjon, s 13-24. [2] Asmussen, J., Schmid, R. Oppgave 2: Preparativ kolonnekromatografi, versj. 17.02.2013. 8
A Utregning av platetall Benzofenon, topp nr. 1 Vanillin, topp nr. 2 ( ) 2 ( ) 2 VR 50 N = 16 = 16 = 33 V W 65 30 ( ) 2 ( ) 2 VR 105 N = 16 = 16 = 87 V W 140 95 Figur 2: Kromatogram for separasjon av benzofenon og vanillin i en preparativ kolonne pakket med silikagel og eluert med 1+2 etylacetat i petroleumseter. Verdiene for V R og V W brukt i utregningen av platetallene er avmerket i diagrammet. 9
B TLC-plate for utvalgte fraksjoner 10
C Excelark med alle fraksjoner Oppgave 2 Adsorpsjonskromatografi i kolonne. Fraksjon Volum Intensitet Elueringsvolum [nr.] [ml] [1-10] [ml] 1 10 0 10 2 10 0 20 3 5 0 25 4 5 0 30 5 5 35 6 5 8 40 7 5 45 8 5 10 50 9 5 55 10 5 7 60 11 5 2 65 12 5 0 70 13 5 0 75 14 5 0 80 15 5 0 85 16 5 1 90 17 5 2 95 18 5 7 100 19 5 8 105 20 5 110 21 5 6 115 22 5 120 23 5 5 125 24 5 130 25 5 2 135 26 5 140 27 5 1 145 28 5 150 29 5 1 155 30 5 160 31 5 0 165 32 5 0 170 11