Forslag til opplegg for kontroll av resistensbestemmelse med agar-diffusjon Martin Steinbakk Mikrobiologisk avdeling, Ahus og AFA
Resistensbestemmelse med agar-diffusjon Kort gjennomgang av metoden for resistensbestemmelse med agar-diffusjon Forslag til stammer og midler Hyppighet av kontrolloppsett Akseptabel variasjon Registrering av resultater
Gjennomgang av metoden Fick s diffusjonslov Diffusjonskonstanten for et middel bestemmes av molekylstørrelse og mediets viskositet Temperatur Dannelse av hemningssone IC (inhibitory concentration) Kritisk tid (avhengig av inokulat og veksthastighet) Antibiotikakonsentrasjonen i agaren er omvendt proporsjonal med kvadratet av avstand fra diffusjonsentrum. For de fleste mikrober og antibiotika finnes det en IC som akkurat hemmer veksten og her vil hemningssonen dannes.
Faktorer som påvirker hemnigssonens størrelse Kritisk konsentrasjon IC Kritisk tid Tid til hemningssonen dannes Inokulum Jo større inokulum jo kortere kritisk tid Mikrobeegenskaper Særlig vektshastighet påvirker kritisk tid Antibiotikadepot Jo større depot jo mer antibiotikum diffunderer i løpet av kritisk tid Egenskaper ved mediet Tykkelse, ph, viskositet, ev. substanser som påvirker antibiotikas aktivitet Biologisk variasjon
Biologisk variasjongjentatte analyser gir ulike svar Ampicillin 10 ug 15 10 5 ant. 0 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 WT WT -5 H. influenzae BNAR ATCC -10 mm hemningssone
Biologisk variasjon - MIC for WT viser genusspesifikk variasjon Distribution of MIC-values No of isolates 8000 7000 6000 5000 4000 3000 2000 1000 0 E. coli P. aeruginosa 0.064 0.125 0.25 0.5 1 2 4 8 MIC (mg/l) 16 32 64 128
KVALITETSKONTROLL (KK) AV RESISTENSBESTEMMELSER FOR AEROBE, HURTIGVOKSENDE BAKTERIER MED AGARDIFFUSJON Arnfinn Sundsfjord, E. Arne Høiby, Asbjørn Digranes, Stig Harthug, Per Bjark, Per Leiv Svarva og Martin Steinbakk. 2001
Hva skal standardiseres og hvorfor trenger vi kvalitetskontroll? Medium Inokulum Blandingskulturer Antibiotikadepoter Inkubering Avlesning Tolkning
Medium Kontroll av vekst Sterilt medium uten forurensning ph Divalente kationer Agardybde Tilsetninger
Inokulum Semikonfluerende vekst ICS Ericsson and Sherris 1971 AFA Konfluerende vekst Kirby-Bauer NCCLS Blandingskultur Kan gi usikkert resultat pga. interferens mellom bakteriestammer
Antibiotikadepot Innhold Mengde antibiotikum i depot gir ulik størrelse på hemningssonen Mange antibiotika degraderes ved lagring F.eks. Ampicillin, Imipenem Pålegging av depot må avstemmes i forhold til inokulum Prediffusjon? Kontakt med agar overflaten?
Inkubering Temperatur Viktig både for kritisk tid og diffusjonen av middel i mediet Husk at det tar tid før alle skålene i en stabel har samme temperatur Atmosfære CO2 påvirker aktivitet til enkelte antibiotika
Avlesning av hemningssonens størrelse Hvordan skal sonen leses? Full hemming (ingen vekst inn i sonen) vanlig for baktericide midler 80% hemning (eller det meste av veksten hemmet) Vanlig for bakteriostatiske midler Asymmetriske soner Svært store soner Interaksjon med andre midler
Hvordan lese av sonerstørrelse?
Opplegg for kvalitetskontroll Kontroll av medium (før bruk) Kontroll av medium og prosedyrer under bruk Evne til å påvise spesielle resistensfaktorer Reproduserbarhet i utførelse og avlesning av resistensbestemmelse ved bruk av kontrollstammer Kontroll av total metode ved bruk av kliniske isolat Feilsøk Hva gjør vi ved feil?
Kontroll av medium (før bruk) Kontroll av prosedyrer under tillaging Kontroll av ph Kontroll av divalente kationer P. aeruginosa ATCC 27853 overfor gentamicin Kontroll av tymin- og tymidin-innhold E. faecalis ATCC 29212 overfor trimetoprim
Kontroll av medium og prosedyrer under bruk Evne til å påvise spesielle resistensfaktorer Reproduserbarhet i utførelse og avlesning av resistensbestemmelse ved bruk av kontrollstammer Kontroll av total metode ved bruk av kliniske isolat
Påvisning av spesielle resistensfaktorer I Betalaktamase (daglig eller oftere) H. influenzae NCTC 8468, S. aureus MRSA (daglig eller oftere) MSSA ATCC 25923 MRSA ATCC 43300 (oxacillin MIC 16 mg/l) MSSE ATCC 12228 MRSE TUH A2-40 eller TUH A2-41 Staphylococcus epidermidis med lav oxacillin MIC (MIC = 2 mg/l) fra K-res Ref: AFAs metode for påvisning av MRSA og MRSE av 2004
Påvisning av spesielle resistensfaktorer II AFAs anbefalte brytningspunkter, testmetode og kontrollstammer for påvisning av meticillinresistens hos stafylokokker (2004) Påvisning av VRE (GRE) hos enterokokker (AFA KKdokument og vedlegg 3A) E. faecium CCUG 36804 (vana), E. faecium CCUG 33829 (vanb) Påvisning av nedsatt penicillinfølsomhet hos pneumokokker (AFA KK-dokument og AFA-kurs) S. pneumoniae ATCC 49619 Påvisning av ESBL (NORM-protokoll 2004) Påvisning av MLSB-resistens hos stafylokokker og streptokokker (NORM-protokoll 2004)
Nøyaktighet og presisjon Funksjonsundersøkelse Daglig i 20-30 dager og deretter ukentlig om ikke avvik påvises utføres av det personalet som utfører resistens-bestemmelse Aktuelle stammer S. aureus ATCC 25923 E. faecalis ATCC 29212 E. coli ATCC 25922
Andre aktuelle stammer Anaerob resistensbestemmelse Bacteroides spp, Peptostreptococcus spp. P. aeruginosa ATCC 27853 Neisseria gonorrhoeae Andre spesielle isolater
Bruk av kontrollstammer. Hva skal kontrollen brukes til? Kontroll på test Resistensbestemmelse Påvisning av resistensfaktor Kontroll på tolkning Avlesning Brytningspunkt
Kontrollstammer og midler I S. aureus ATCC 25923 Daglig x 20-30 Deretter ukentlig Om feil Kan feil sikkert forklares? Ja, fortsett som før. Om ikke, daglige oppsett inntil < 10% feil på 20-30 oppsett (Penicillin) (Oxacillin) Klindamycin Erytromycin Gentamicin Fucidin
Kontrollstammer og midler II E. faecalis ATCC 29212 Daglig x 20-30 Deretter ukentlig Om feil Kan feil sikkert forklares? Ja, fortsett som før Om ikke, daglige oppsett inntil < 10% feil på 20-30 oppsett Ampicillin Nitrofurantoin Trimetoprim (Trimetoprimsulfamethoxazol) (Ciprofloxacin)
Kontrollstammer og midler III E. coli ATCC 25922 Daglig x 20-30 Deretter ukentlig Om feil Kan feil sikkert forklares? Ja, fortsett som før. Om ikke, daglige oppsett inntil < 10% feil på 20-30 oppsett Ampicillin Cefotaxim Ciprofloxacin Gentamicin Trimetoprim-sulfa (Imipenem og/eller meropenem)
Kontrollstammer oppbevaring Lokal stammebank Gull-eske Bare godt definerte stammer kan inngå Frys -70 o C (plasmider kan tapes ved oppbevaring over minus 45-60 o C) Ikke evigvarende Bruks-eske Spredning fra gull-eske, stamme som brukes i lab hentes her Holdbar 1-3 år Bruks-stamme For resistensbestemmelse er 4-8 spredninger akseptabelt før ny stamme må hentes fra frys
Hva er akseptabel variasjon? Biologisk variabilitet - gjentatte analyser gir ulike svar Ampicillin 10 ug 15 10 5 ant. 0 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 WT WT -5 H. influenzae BNAR ATCC -10 mm hemningssone
E. coli kliniske isolat og E. coli ATCC 25922 Ampicillin 10 ug depot Ampicillin 20 15 10 WT 5 AM 10 AM atcc 0 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45-5 -10 Kontrollstamme
E. coli kliniske isolat og E. coli ATCC 25922 Amoxicillin-klavulanat depot Amox/Clav 10 WT 5 0 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 ant. AMC AMCatcc -5-10 -15 Kontrollstamme mm
E. coli kliniske isolat og E. coli ATCC 25922 Gentamicin 30 ug depot Gentamicin 20 WT 15 10 5 GM GM atcc 0 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45-5 -10 Kontrollstamme
Hva er akseptabel variasjon? Sjekk opplysninger fra produsent av ditt system Generelt 9-13 mm differanse i måling ved diffusjon er akseptabelt for de fleste midler og mikrober Sonene skal normalfordele seg med en perfekt Gauss-kurve og avstanden fra median opp til største registrerte diameter skal ideelt være lik avstanden ned til minste registrerte diameter Hale (skewing) indikerer problemer med avlesning eller tolkning (ofte karakteristisk for enkelte midler og mikrober)
WT kliniske isolat vil vise større variasjon enn kontrollstammen Amox/Clav 10 5 0 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 ant. AMC AMCatcc -5-10 -15 mm
Hvordan harmonisere avlesning? La alle involverte lese av 1-2 stammer mot alle midler samme dag. Registrer de målte verdier (gjerne anonymt) og plott disse på et regneark Vis kurven og diskuter avvikene Harmoniser avlesning ved å gjenta prosedyren over inntil akseptabel variasjon Gjenta prosedyren minst 2 ganger i året
Kontroll av metode (total) Registrer data for 100 kliniske isolat Kontroller at distribusjonen er god Tydelig median Symmetrisk fordeling Passe spredning (9-13 mm) Kontroller at brytningspunkt er gyldige WT populasjonen skal ikke deles BP bør karakterisere populasjonen i SIR
E.coli og Klebsiella vs. Gentamicin Gentamicin ant 18 16 14 12 10 8 6 4 2 0 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 mm GM
S. aureus vs erytromycin Erytromycin 20 15 10 5 E E atcc 0 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46-5 -10
Hvordan registrere resultatet? Registreringen må omfatte nødvendige data for oppfølging (dato, signatur, spesiell omstendigheter (temp, inokulat), ev. forklaringer på avvik) Registreringen må inneholde angivelse av ev. tiltak Visuell presentasjon er viktig Målt verdi (mm hemningssone) Referanseintervall
Eksempel på registreringsskjema S. aureus ATCC 29213 Gentamicin Nov 2004 Dag mm 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 23 24 x X x x 25 x x x X x 26 x x x X x x 27 x x x 28 29
KK av resistensbestemmelse med agar-diffusjon Hvilke tema er behandlet? Kort gjennomgang av metoden for resistensbestemmelse med agar-diffusjon Forslag til stammer og midler Hyppighet av kontrolloppsett Akseptabel variasjon Registrering av resultater Pål Jenums Excel-program anbefales!