Fenotypiske metoder for påvisning av bakteriers følsomhet for antimikrobielle midler Martin Steinbakk, Avdeling for bakteriologi og infeksjonsimmunologi, Fhi Klassiske metoder for resistensbestemmelse Fortynning Agar fortynning Buljong fortynning Disk diffusjon Ficks diffusjonslover Antibiotikaresistens og resistensbestemmelse MIC Minimum inhibitory concentration MBC Minimum bactericidal concentration Agardiffusjon (hemningssone i mm) Resultatet tolkes som S, I eller R Sensitiv Midlet er aktivt ved vanlig dosering Intermediært følsom (el. usikkert resultat) Midlet er aktivt dersom det kan gis høye doser eller midlet konsentreres i infeksjonsfokus Resistent Midlet er ikke aktivt mot mikroben
Buljong fortynning 2-folds fortynning av antibiotikum MIC = 8 mg/l MBC =?? Fortynningsmetoder 2-folds fortynning av antibiotikum Ab kons Vekst/Ikke vekst (mg/l) 32 Ingen vekst 8 Ingen vekst 4 Ingen vekst Mikrobedød (=MBC) 2 Ingen vekst MIC 1 Vekst 0,5 Vekst 0,25 Vekst 0 Vekstkontroll MBC definisjon: > 99,9% av mikrobene er døde Broth microdilution using Mueller Hinton Broth medium is now ISO-standard ISO 20776-1 Ed. 1 Current stage 60.00TC 212 Clinical laboratory testing and in vitro diagnostic test systems Susceptibility testing of infectious agents and evaluation of performance of antimicrobial susceptibility test devices Part 1: Reference method for testing the in vitro activity of antimicrobial agents against rapidly growing aerobic bacteria involved in infectious diseases
MBC minimum bactericidal concentration Definisjon > 99,9% av bakteriene er døde (ved telling av cfu) eller < 0,1% (<1 av 1000 bakterier) overlever For et pålitelig resultat må inokulum være passe stort Vanlig volum ved mikrobuljongfortynning er 100 ul Inokulum MBC ved 1.000 cfu/ml (<0,1 cfu i 100 ul) 10.000 cfu/ml (<1 cfu i 100 ul) 100.000 cfu/ml (<10 cfu i 100 ul) MBC Inokulum (cfu/ml) Ant bakterier Ant bakterier Ved 99,9% drap vokser det antall cfu i 100 ul per ml per 100 ul 10**3 10**4 10**5 10**6 1000 100 <0,1 10000 1000 <1 100000 10000 <10 1000000 100000 <100 Susceptibility testing
From BSAC Methods for Antimicrobial Susceptibility Testing. Jan 2006
Sammenhengen mellom mm og MIC Fick s diffusjonslov (2 viktige elementer) Diffusjonskonstanten for et middel bestemmes av midlets molekylstørrelse og mediets viskositet Temperatur Dannelse av hemningssone IC (inhibitory concentration) Kritisk tid (avhengig av inokulat og veksthastighet) Antibiotikakonsentrasjonen i agaren er omvendt proporsjonal med kvadratet av avstand fra diffusjonssentrum. For de fleste mikrober og antibiotika finnes det en IC som akkurat hemmer veksten og her vil hemningssonen dannes. Fenotypisk påvisning av resistensmekanisme Påvisning av resistensmarkør Betalaktamase-tester Bruk av markørantibiotika for å påvise resistens eller fravær av resistens Penicillinfølsomhet hos pneumokokker Beta-laktamresistens hos H. influenzae Kinolon-resistens hos enterobakterier Påvisning av resistensprotein meca Påvisning av resistensgen rpob
Acidometrisk metode Yngvar Tveten Kløverblad Yngvar Tveten
Nitrocefin test Yngvar Tveten Aktuelle bakterier Stafylokokker H. influenzae M. catarrhalis N. gonorrhoeae Bacteroides spp. Bacillus spp. Enterokokker Stabilt derepressert Enterobacter cloacae
Forekomst betalaktamaseprod. S. aureus (70?) 80-90% (>90%?) H. influenzae 5-10% N. gonorrhoeae 20-30% (>50%?) M. catarrhalis >90% (100%?) Enterokokker Meget sjelden Bacteroides fragilis >95% Bacteroides spp. sjelden Bacillus spp. 100% Kløverblad Yngvar Tveten Kløverbladmetoden Suspensjon av penicillin følsom stamme (indikatorstamme) Tørkes Teststammen sås ut i et kryss og en lapp med benxylpenicillin legges i midten Inkuberes over natt Ved betalaktamase prod. vil teststammen bryte ned penicillin og indikatorstammen vokser langs teststammen inn mot pc-lappen
Acidometrisk metode Yngvar Tveten Acidometrisk metode Vannagar tilsatt benzylpenicillin og fenolrødt (indikator) Stort inokulum Inkuberes i 1 t ved 37 0 C Penicillin omdannes til penicillinoinsyre, ph faller og indikatoren slår om fra rødt til gult Nitrocefin test Yngvar Tveten
Nitrocefin-test Lapp med nitrocefin (cefinase ) (kromogent cefalosporin) legges direkte på kolonier i randen av en hemningssone, f.eks. rundt oxacillin Betalaktamase bryter ned cefalosporinet og fargen endres fra gult til rødt, vanligvis i løpet av 10 min. Kan også utføres i buljongkultur eller i bakterioppslemming i fysiologisk saltvann Falsk positiv reaksjon kan forekomme på medier som inneholder serum eller blod eller andre sure metabolske produkter Konklusjon Nitrocefin (Cefinase) er suboptimal og bør utgå falskt negative resultater (sensitivitet 80-90%) Kløverbladtesten fungerer godt kan brukes til å bekrefte β-laktamaseproduksjon Sonekantens utseende og sonens størrelse kan med stor sikkerhet si om isolatet produserer β-laktamase Fenotypisk påvisning av resistensmekanisme Påvisning av resistensmarkør Betalaktamase-tester Bruk av markørantibiotika for å påvise resistens eller fravær av resistens Penicillinfølsomhet hos pneumokokker Oxacillin 1 ug Beta-laktamresistens hos H. influenzae Penicillin V og Cefaklor Kinolon-resistens hos enterobakterier m. fl Nalidixinsyre
Sensitive screening-metoder for å påvise resistens Spesielle testsubstanser Oxacillin 1ug er en sensitiv pneumokokker Nalidixinsyre påviser flurokinolon-resistens Grupperepresentative antibiotika predikerer følsomhet for andre midler i gruppen Tetracykliner Makrolider Grupperepresentative midler Grupperepresentative antibiotika predikerer følsomhet for andre midler i gruppen Tetracyklinfølsomhet predikerer følsomhet for alle tetracykliner og glycylcyklin Erytromycinfølsomhet predikerer følsomhet for alle makrolider (og linkosamider) Påvisning av protein assosiert med resistens MRSA meca (agglutinasjonstest) Tar 10-15 min (ferske kolonier (< 24 t) på blodagar) Koker suspensjon Agglutinerer (positiv (og negativ) kontroll)
Påvisning av resistensgen - Ikke fenotypi rpob-gen M. tuberculosis og rifampicinresistens PCR Kommersielle kit Andre blot-assays Forskjell på mikrobiologisk og klinisk (farmakologisk) resistens Nye metoder Kombinasjon av flere metoder Tradisjonell fenotypi (sonestørrelse, MIC) Biokjemisk bestemmelse av nedbrytning av aktivt antibiotikum F. eks. kan karbapenem-aktivitet kan måles i løpet av 3 timer ved maldi-tof
Mikrobiell resistens Mikrobe ødelegger antibiotikum enzymer som beta-laktamase Mikrobe endrer målorgan for antibiotkum Penicillin-bindende proteiner Mikrobe tetter igjen cellevegg endrede poriner Mikrobe pumper antibiotikum ut effluks Mikrobiell resistens - 2 Mikrobens «miljø» Biofilm Dvale-tilstand Small colony variants Vertsfaktorer Fremmedlegeme Andre faktorer (CAPD m.m.) Antibiotkaresistens - Seleksjon Opprinnelig bakteriepopulasjon Bakterie med mutasjon overlever Resistente bakterier er selektert Følsomme mikrober Resistent mikrobe Antibiotikabehandling