SAMMENSETNINGER OG FREMGANGSMÅTER FOR BEHANDLING OG DIAGNOSTISERING AV INFLUENSA

Transkript

1 1 SAMMENSETNINGER OG FREMGANGSMÅTER FOR BEHANDLING OG DIAGNOSTISERING AV INFLUENSA Beskrivelse OPPFINNELSENS OMRÅDE Den foreliggende oppfinnelse angår generelt behandling, diagnostisering og overvåkning av influensainfeksjon. Oppfinnelsen angår nærmere bestemt isolerte fullstendig humane influensamatrise 2-proteinspesifikke antistoffer og deres produksjon og anvendelse. Slike antistoffer er nyttige i farmasøytiske sammensetninger for forebygging og behandling av influensa, og for diagnostisering og overvåkning av influensainfeksjon. OPPFINNELSENS BAKGRUNN 1 2 Influensavirus infiserer % av populasjonen og resulterer i dødsfall hvert år i USA. Selv om influensavaksine er den primære fremgangsmåten for infeksjonsforebygging, er også fire antivirale legemidler tilgjengelige i USA: amantadin, rimantadin, oseltamivir og zanamivir. Fra desember 0 er bare oseltamivir (TAMIFLU ) anbefalt for behandling av influensa A på grunn av virusets økende motstandsdyktighet overfor amantadin og rimantidin, som skyldes en aminosyresubstitusjon i virusets M2-protein. Sykdom forårsaket av influensa A-virale infeksjoner er typifisert ved sin sykliske natur. Antigen drift og forskyvning gir mulighet for at forskjellige A-stammer oppstår hvert år. I tillegg til dette, har trusselen av at svært patogene stammer skal komme inn i den generelle populasjonen understreket behovet for nye behandlinger mot influensainfeksjoner. Den predominante fraksjon av nøytraliserende antistoffer er rettet mot hemagglutinin- og nevraminidaseproteinenes polymorfe regioner. Et slikt nøytraliserende MAb ville således formodentlig bare rette seg mot én eller noen få stammer. Fokus i den siste tid har vært på det relativt ikke-varierende matrise-2-proteinet (M2). Et nøytraliserende MAb til M2 ville potensielt være en tilstrekkelig behandling for alle influensa A-stammer. M2-proteinet finnes i en homotetramer som danner en ionekanal og antas å

2 2 bidra til at viruset mister kappen når det kommer inn i cellen. Etter infeksjon kan M2 påvises i overflod på celleoverflaten. Det inkorporeres deretter i virionkappen, hvor det bare omfatter cirka 2 % av totalt kappeprotein. Det ekstracellulære M2-domenet (M2e) er kort, med de aminoterminale 2 24 aminosyrene vist utenfor cellen. Anti-M2 Mab-er per dags dato er blitt rettet mot denne lineære sekvensen. De kan således ikke vise ønskede bindingsegenskaper til cellulært uttrykt M2, herunder konformasjonelle determinanter på nativt M2. For eksempel beskriver WO 06/ det fullstendig humane, monoklonale antistoffet Z3G1 oppnådd fra transgene mus inneholdende humane immunglobulingenregioner immunisert med M2-polypeptid. Z3G1-antistoffet binder en determinant innenfor sekvensen LLTEVETPIR og er terapeutisk virkningsfull mot influensa A-infeksjon hos mus. 1 Det har derfor lenge vært behov i teknikken for nye antistoffer som binder til det cellulært uttrykte M2 og konformasjonelle determinanter på det native M2. KORT BESKRIVELSE AV OPPFINNELSEN 2 Den foreliggende oppfinnelse tilveiebringer isolerte fullstendig humane monoklonale antistoffer spesifikt rettet mot M2e og med CDR-sekvensene angitt i krav 1. Antistoffet isoleres eventuelt fra en B-celle fra en human donor. Eksempler på monoklonale antistoffer inkluderer 8ilO, 21B1 og 23K12 beskrevet heri. Antistoffene omtales i hvert tilfelle heri som hum2e-antistoffer. hum2e-antistoffet har én eller flere av følgende karakteristikker: a) binder til et epitop i det ekstracellulære domenet av matrise 2-ektodomenepolypeptidet (M2e) for et influensavirus, b) binder til influensa A-infiserte celler eller c) binder til influensa A-virus. Epitopet som hum2e-antistoff binder til, er et ikke-lineært epitop i et M2- polypeptid. Epitopet inkluderer fortrinnsvis den aminoterminale regionen i M2epolypeptidet. Mer foretrukket inkluderer epitopet helt eller delvis aminosyresekvensen SLLTEV (SEQ ID NO:42). Mest foretrukket inkluderer epitopet aminosyren ved posisjon 2, og 6 i M2e-polypeptidet når det nummereres i samsvar med SEQ ID NO: 1. Aminosyren ved posisjon 2 er et serin, ved posisjon et treonin og ved posisjon 6 en glutaminsyre.

3 3 Et hum2e-antistoff inneholder en tungkjedevariabel med aminosyresekvensen SEQ ID NOS: 44 eller 0 og en lettkjedevariabel med aminosyresekvensen SEQ ID NOS: 46 eller 2. De tre tungkjede-cdr-ene inkluderer aminosyresekvensene NYYWS (SEQ ID NO: 72), FIYYGGNTKYNPSLKS (SEQ ID NO: 74) og ASCSGGYCILD (SEQ ID NO: 76) eller SNYMS (SEQ ID NO: 3), VIYSGGSTYYADSVK (SEQ ID NO: ) og CLSRMRGYGLDV (SEQ ID NO: 7) (som bestemt ved Kabat-metoden) og en lettkjede med tre CDR-er som inkluderer aminosyresekvensene RASQNIYKYLN (SEQ ID NO: 9), AASGLQS (SEQ ID NO: 61) og QQSYSPPLT (SEQ ID NO: 63) eller RTSQSISSYLN (SEQ ID NO: 92), AASSLQSGVPSRF (SEQ ID NO: 94), QQSYSMPA (SEQ ID NO: 96) (som bestemt ved Kabat-metoden). Antistoffet binder M2e. 1 I et annet aspekt tilveiebringer oppfinnelsen en sammensetning inkluderende et hum2e-antistoff ifølge oppfinnelsen. I forskjellige aspekter inkluderer sammensetningen videre et antiviralt legemiddel, en viral inngangsinhibitor eller en viral bindingsinhibitor. Det antivirale legemiddelet er for eksempel en nevraminidaseinhibitor, en HA-inhibitor, en sialinsyreinhibitor eller en M2- ionekanalinhibitor. M2-ionekanalinhibitoren er for eksempel amantadin eller rimantadin. Nevraminidaseinhibitoren er for eksempel zanamivir- eller oseltamivirfosfat. I et ytterligere aspekt inkluderer sammensetningen videre et andre anti-influensa A-antistoff. 2 I et ytterligere aspekt er hum2e-antistoffene ifølge oppfinnelsen operativt bundet til et terapeutisk stoff eller en påviselig markør. Også inkludert i oppfinnelsen er en fremgangsmåte for bestemmelse av forekomsten av en influensavirusinfeksjon hos en pasient, ved opprettelse av kontakt mellom en biologisk prøve oppnådd fra pasienten og et antistoff ifølge oppfinnelsen, påvisning av en mengde av antistoffet som binder til den biologiske prøven, og sammenligning av mengde antistoff som binder til den biologiske prøven, med en kontrollverdi. 3 Oppfinnelsen tilveiebringer videre et diagnostisk assaysett omfattende et hum2eantistoff.

4 4 Andre trekk og fordeler ved oppfinnelsen vil være åpenbare og beskrives ved følgende detaljerte beskrivelse og krav. KORT BESKRIVELSE AV TEGNINGENE Figur 1 viser bindingen av tre antistoffer ifølge den foreliggende oppfinnelse og kontrollantistoff hu14c2 til 293-HEK-celler transfektert med en M2- ekspresjonskonstruksjon eller kontrollvektor under nærvær eller fravær av fritt M2-peptid. Figur 2A og B er grafer som viser humant monoklonalt antistoff som binder til influensa A/Puerto Rico/8/32. 1 Figur 3A er en graf som viser aminosyresekvenser i ekstracellulære domener av M2-varianter. Figur 3B og C er søylediagrammer som viser binding av humant monoklonalt anti-influensaantistoff som binder til M2-varianter vist på figur 3A. Figur 4A og B er søylediagrammer som viser binding av humant monoklonalt antiinfluensa-antistoff som binder til M2-peptider utsatt for alaninskanningsmutagenese. 2 Figur er en serie søylediagrammer som viser binding av MAb-er 8i og 23K12 til M2-protein som representerer influensastammesekvensen A/HK/483/1997 som ble stabilt uttrykt i CHO-cellelinjen DG44. Figur 6A er et diagram som viser kryssreaktivitetsbinding av anti-m2-antistoffer til M2-peptidvarianter. Figur 6B er et diagram som viser bindingsaktivitet av M2-antistoffer til trunkerte M2-peptider. Figur 7 er en graf som viser overlevelse av influensainfiserte mus behandlet med humane monoklonale antiinfluensa-antistoffer.

5 Figur 8 er en illustrasjon som viser anti-m2-antistoffene binde en svært konsentrert region i N-terminalen av M2e. Figur 9 er en graf som viser anti-m2 rhmab-kloner fra ubehandlet supernatant bundet til influensa på ELISA, mens kontroll-anti-m2e mab 14C2 ikke enkelt binder virus. Figur er en rekke fotografier som viser anti-m2 rhmab-er bundet til celler infisert med influensa. MDCK-celler ble eller ble ikke infisert med influensa A/PR/8/32, og Ab-binding fra ubehandlet supernatant ble testet 24 timer senere. Dataene ble samlet inn fra FMAT-plateskanneren. 1 Figur 11 er en graf som viser anti-m2 rhmab-kloner fra ubehandlet supernatant bundet til celler transfektert med influensaundertypene H3N2, HK483 og VN 13 M2-proteiner. Plasmider som koder for M2 cdna-er av full lengde tilsvarende influensastammene H3N2, HK483 og VN 13 og en falsk plasmidkontroll, ble kortvarig transfektert til 293 celler. 14C2, 8ilO, 23K12 og 2 IB 1 mab-ene ble testet for binding til transfektantene, og ble påvist med et AF647-konjugert antihumant IgG-sekundærantistoff. Vist er gjennomsnittlig fluorescensintensitet for det spesifikke mab bundet etter FACS-analyse. DETALJERT BESKRIVELSE 2 Den foreliggende oppfinnelse tilveiebringer isolerte fullstendig humane monoklonale antistoffer spesifikke mot det ekstracellulære domenet i matrise 2- polypeptidet (M2) og med CDR-sekvensene definert i krav 1. Antistoffene omtales i hvert tilfelle heri som hum2e-antistoffer. 3 M2 er et 96-aminosyretransmembrant protein som finnes som et homotetramer på overflaten av influensavirus og viralt infiserte celler. M2 inneholder et 23- aminosyreektodomene (M2e) som er svært konservert gjennom influensa A- stammer. Få aminosyreendringer har oppstått siden pandemistammen i 1918, og således er M2e et attraktivt mål for influensabehandlinger. I tidligere studier ble monoklonale antistoffer spesifikke for M2-ektodomenet (M2e) avledet ved immuniseringer med et peptid tilsvarende den lineære sekvensen i M2e. Den foreliggende oppfinnelse til sammenligning tilveiebringer en hittil ukjent prosess

6 6 hvorved M2 av full lengde uttrykkes i cellelinjer, hvilket muliggjør identifikasjon av humane antistoffer som bandt dette cellulært uttrykte M2e. hum2eantistoffene er påvist å binde konformasjonelle determinanter på de M2- transfekterte cellene så vel som nativ M2, enten på influensainfiserte celler eller på selve viruset. hum2e-antistoffene bandt ikke det lineære M2e-peptidet, men de binder flere naturlige M2-varianter, også uttrykt ved cdna-transfeksjon til cellelinjer. Denne oppfinnelse har således gitt mulighet for identifikasjon og produksjon av humane monoklonale antistoffer som viser hittil ukjent spesifisitet for et svært stort område av influensa A-virusstammer. Disse antistoffene kan anvendes diagnostisk til å identifisere influensa A-infeksjon og terapeutisk til å behandle influensa A-infeksjon. 1 hum2e-antistoffene ifølge oppfinnelsen har én eller flere av følgende karakteristikker: hum2e-antistoffet binder a) til et epitop i det ekstracellulære domenet av matrise 2-polypeptidet (M2) av et influensavirus, b) binder til influensa A-infiserte celler og/eller c) binder til influensa A-virus (dvs. vironer). hum2e-antistoffene ifølge oppfinnelsen eliminerer influensainfiserte celler gjennom immuneffektormekanismer slik som ADCC og promoterer direkte viral clearance ved binding til influensavironer. hum2c-antistoffene ifølge oppfinnelsen binder til den aminoterminale regionen i M2c-polypeptidet. hum2c-antistoffene ifølge oppfinnelsen binder fortrinnsvis til den aminoterminale regionen i M2cpolypeptidet hvor den N-terminale metioninresten er fraværende. Eksempler på M2e-sekvenser inkluderer sekvensene angitt i tabell I nedenfor Tabell I Type Navn Undertype M2E-sekvens SEQ ID NO A BREVIG H1N1 MSLLTEVETPTRNEWGCRCNDSSD SEQ MISSION ID NO: 1 A FORT H1N1 MSLLTEVETPTKNEWECRCNDSSD SEQ MONMOUTH ID NO: 2

7 7 Type Navn Undertype M2E-sekvens SEQ ID NO A.SINGAPORE.02.0 H3N2 MSLLTEVETPIRNEWECRCNDSSD SEQ ID NO: 3 A WISCONSIN..98 H1N1 MSLLTEVETPIRNGWECKCNDSSD SEQ ID NO: 4 A WISCONSIN H1N1 MSLLTEVETPIRSEWGCRCNDSSD SEQ ID NO: A PANAMA.1.66 H2N2 MSFLPEVETPIRNEWGCRCNDSSD SEQ ID NO: 6 A NEW YORK H3N2 MSLLTEVETPIRNEWGCRCNDSSN SEQ ID NO: 7 A CARACAS.1.71 H3N2 MSLLTEVETPIRKEWGCRCNDSSD SEQ ID NO: 8 A TAIWAN.3.71 H3N2 MSFLTEVETPIRNEWGCRCNDSSD SEQ ID NO: 9

8 8 Type Navn Undertype M2E-sekvens SEQ ID NO A WUHAN.39.9 H3N2 MSLPTEVETPIRSEWGCRCNDSSD SEQ ID NO: A HONG KONG H3N2 MSLLPEVETPIRNEWGCRCNDSSD SEQ ID NO: 11 A HONG KONG H3N2 MSLLPEVETPIRNGWGCRCNDSSD SEQ ID NO: 12 A HONG KONG H3N2 MSLLTEVETPTRNGWECRCSGSSD SEQ ID NO: 13 A NEW YORK H1N2 MSLLTEVETPIRNEWEYRCNDSSD SEQ ID NO: 14 A NEW YORK.0.03 H1N2 MSLLTEVETPIRNEWEYRCSDSSD SEQ ID NO: 1 A SWINE.SPAIN H3N2 MSLLTEVETPTRNGWECRYSDSSD SEQ 04 ID NO: 16

9 9 Type Navn Undertype M2E-sekvens SEQ ID NO A GUANGZHOU H9N2 MSFLTEVETLTRNGWECRCSDSSD SEQ ID NO: 17 A HONG KONG H9N2 MSLLTEVETLTRNGWECKCRDSSD SEQ ID NO: 18 A HONG KONG.1.68 H3N2 MSLLTEVETPIRNEWGCRCNDSSD SEQ ID NO: 19 A SWINE.HONG H3N2 MSLLTEVETPIRSEWGCRCNDSGD SEQ KONG ID NO: A NEW YORK H3N2 MSLLTEVETPIRNEWECRCNGSSD SEQ ID NO: 21 A SWINE.QUEBEC H1N1 MSLPTEVETPIRNEWGCRCNDSSD SEQ ID NO: 22 A PUERTO RICO.8.34 H1N1 MSLLTEVETPIRNEWGCRCNGSSD SEQ ID NO: 23

10 Type Navn Undertype M2E-sekvens SEQ ID NO A HONG KONG HN1 MSLLTEVDTLTRNGWGCRCSDSSD SEQ ID NO: 24 A HONG KONG HN1 MSLLTEVETLTKNGWGCRCSDSSD SEQ ID NO: 2 A SILKY H9N2 MSLLTEVETPTRNGWECKCSDSSD SEQ CHICKEN.SHANTOU.182 ID 6.04 NO: 26 A CHICKEN.TAIWAN.0. H6N1 MSLLTEVETHTRNGWECKCSDSSD SEQ 04 ID NO: 27 A QUAIL.ARKANSAS.16 H7N3NSA MSLLTEVKTPTRNGWECKCSDSSD SEQ ID NO: 28 A HONG KONG HN1 MSLLTEVETLTRNGWGCRCSDSSD SEQ ID NO: 29 A CHICKEN.PENNSYLVANI H7N2NSB MSLLTEVETPTRDGWECKCSDSSD SEQ A ID NO:

11 11 Type Navn Undertype M2E-sekvens SEQ ID NO A CHICKEN.HEILONGJIAN H9N2 MSLLTEVETPTRNGWGCRCSDSSD SEQ G ID NO: 31 A SWINE.KOREA.S.0 H1N2 MSLLTEVETPTRNGWECKCNDSSD SEQ ID NO: 32 A HONG KONG H9N2 MSLLTEVETLTRNGWECKCSDSSD SEQ ID NO: 33 A WISCONSIN H1N1 MSLLTEVETPIRNEWGCKCNDSSD SEQ ID NO: 34 A X-31 VACCINE STRAIN H3N2 MSFLTEVETPIRNEWGCRCNGSSD SEQ ID NO: 3 A CHICKEN.ROSTOCK.8.1 H7N1 MSLLTEVETPTRNGWECRCNDSSD SEQ 9 34 ID NO: 36 A ENVIRONMENT.NEW H7N2 MSLLTEVETPIRKGWECNCSDSSD SEQ YORK ID NO: 37

12 12 Type Navn Undertype M2E-sekvens SEQ ID NO A INDONESIA.60H.06 HN1 MSLLTEVETPTRNEWECRCSDSSD SEQ ID NO: 38 A CHICKEN.HONG H9N2 MSLLTGVETHTRNGWGCKCSDSS SEQ KONG.SF1.03 D ID NO: 39 A CHICKEN.HONGKONG.Y H9N2 MSLLPEVETHTRNGWGCRCSDSS SEQ U D ID NO: 40 1 I en utførelsesform binder hum2e-antistoffene ifølge oppfinnelsen til et M2e som fullstendig eller delvis inkluderer aminosyrerestene fra posisjon 2 til posisjon 7 i M2c, når de er nummerert i samsvar med SEQ ID NO:1. hum2e-antistoffene ifølge oppfinnelsen binder for eksempel helt eller delvis til aminosyresekvensen SLLTEVET (SEQ ID NO: 41). Mest foretrukket binder hum2e-antistoffene ifølge oppfinnelsen helt eller delvis til aminosyresekvensen SLLTEV (SEQ ID NO: 42). hum2c-antistoffene ifølge oppfinnelsen binder fortrinnsvis til M2e-proteinets ikkelineære epitop. hum2c-antistoffene binder for eksempel til et epitop omfattende posisjon 2, og 6 i M2e-polypeptidet når de er nummerert i samsvar med SEQ ID NO: 1 hvor aminosyren ved a) posisjon 2 er et serin, b) posisjon er et treonin og c) posisjon 6 er en glutaminsyre. Eksempler på monoklonale hum2eantistoffer som binder til dette epitopet, er 8I-, 21B1- eller 23K12- antistoffene beskrevet heri. 8I-antistoffet inkluderer en variabel tungkjederegion (SEQ ID NO: 44) kodet av nukleinsyresekvensen vist nedenfor i SEQ ID NO: 43, og en variabel lettkjederegion (SEQ ID NO: 46) kodet av nukleinsyresekvensen vist i SEQ ID NO: 4.

13 13 Aminosyrene omfattende CDR-ene som definert av Chothia, C. et al. (1989, Nature, 342: ) er understreket, og dem definert av Kabat E.A. et al.(1991, Sequences of Proteins of Immunological Interest, th edit., NIH Publication no U.S. Department of Heath and Human Services.) er fremhevet med fet skrift i sekvensene nedenfor. Tungkjede-CDR-ene for 8I-antistoffet har følgende sekvenser i henhold til Kabat-definisjonen: NYYWS (SEQ ID NO: 72), FIYYGGNTKYNPS LKS (SEQ ID NO: 74) og ASCSGGYCILD (SEQ ID NO: 76). Lettkjede-CDR-ene for 8I-antistoffet har følgende sekvenser i henhold til Kabat-definisjonen: RASQNIYKYLN (SEQ ID NO: 9), AA SGLQS (SEQ ID NO: 61) og QQSYSPPLT (SEQ ID NO: 63). 1 Tungkjede-CDR-ene for 8I-antistoffet har følgende sekvenser i henhold til Chothia-definisjonen: GSSISN (SEQ ID NO: 9), FIYYGGNTK (SEQ ID NO: 1) og ASCSGGYCILD (SEQ ID NO: 76). Lettkjede-CDR-ene for 8I-antistoffet har følgende sekvenser i henhold til Chothia-definisjonen: RASQNIYKYLN (SEQ ID NO: 9), AASGLQS (SEQ ID NO: 61) og QQSYSPPLT (SEQ ID NO: 63). > 8I VH-nukleotidsekvens: (SEQ ID NO: 43) > 8I VH-aminosyresekvens: (SEQ ID NO: 43) 44) Kabat (fet skrift), Chothia (understreket) 2 > 8I VL-nukleotidsekvens: (SEQ ID NO: 4)

14 14 > 8I VL-aminosyresekvens: (SEQ ID NO: 43) 46) Kabat (fet skrift), Chothia (understreket) 21B1-antistoffet inkluderer en variabel tungkjederegion (SEQ ID NO: 44) kodet av nukleinsyresekvensen vist nedenfor i SEQ ID NO: 47, og en variabel lettkjederegion (SEQ ID NO: 46) kodet av nukleinsyresekvens vist i SEQ ID NO: 48. Aminosyrene omfattende CDR-ene som definert av Chothia et al er understreket og dem definert av Kabat et al., 1991 er fremhevet med fet skrift i sekvensene nedenfor. 1 Tungkjede-CDR-ene for 21B1-antistoffet har følgende sekvenser i henhold til Kabat-definisjonen: NYYWS (SEQ ID NO: 72), FIYYGGNTKYNPSLKS (SEQ ID NO: 74) og ASCSGGYCILD (SEQ ID NO: 76). Lettkjede-CDR-ene for 21B1-antistoffet har følgende sekvenser i henhold til Kabat-definisjonen: RASQNIYKYLN (SEQ ID NO: 9), AASGLQS (SEQ ID NO: 61) og QQSYSPPLT (SEQ ID NO: 63). Tungkjede-CDR-ene for 21B1-antistoffet har følgende sekvenser i henhold til Chothia-definisjonen: GSSISN (SEQ ID NO: 111), FIYYGGNTK (SEQ ID NO: 1) og ASCSGGYCILD (SEQ ID NO: 76). Lettkjede-CDR-ene for 21B1-antistoffet har følgende sekvenser i henhold til Chothia-definisjonen: RASQNIYKYLN (SEQ ID NO: 9), AASGLQS (SEQ ID NO: 61) og QQSYSPPLT (SEQ ID NO: 63). 2 > 21B1 VH-nukleotidsekvens: (SEQ ID NO: 47) > 21B1 VH-aminosyresekvens: (SEQ ID NO: 44) Kabat (fet skrift), Chothia (understreket)

15 1 > 21B1 VL-nukleotidsekvens: (SEQ ID NO: 48) > 21B1 VL-aminosyresekvens: (SEQ ID NO: 46) Kabat (fet skrift), Chothia (understreket) 23K12-antistoffet inkluderer en variabel tungkjederegion (SEQ ID NO: 0) kodet av nukleinsyresekvensen vist nedenfor i SEQ ID NO: 49, og en variabel lettkjederegion (SEQ ID NO: 2) kodet av nukleinsyresekvensen vist i SEQ ID NO: 1. 1 Aminosyrene omfattende CDR-ene som definert av Chothia et al., 1989 er understreket og dem definert av Kabat et al., 1991 er uthevet med fet skrift i sekvensene nedenfor. Tungkjede-CDR-ene for 23K12-antistoffet har følgende sekvenser i henhold til Kabat-definisjonen: SNYMS (SEQ ID NO: 3), VIYSGGSTYYADSVK (SEQ ID NO: ) og CLSRMRGYGLDV (SEQ ID NO: 7). Lettkjede-CDR-ene for 23K12- antistoffet har følgende sekvenser i henhold til Kabat-definisjonen: RTSQSISSYLN (SEQ ID NO: 92), AASSLQSGVPSRF (SEQ ID NO: 94) og QQSYSMPA (SEQ ID NO: 96). 2 Tungkjede-CDR-ene for 23K12-antistoffet har følgende sekvenser i henhold til Chothia-definisjonen: GFTVSSN (SEQ ID NO: 112), VIYSGGSTY (SEQ ID NO: 113) og CLSRMRGYGLDV (SEQ ID NO: 7). Lettkjede-CDR-ene for 23K12-

16 16 antistoffet har følgende sekvenser i henhold til Chothia-definisjonen: RTSQSISSYLN (SEQ ID NO: 92), AASSLQSGVPSRF (SEQ ID NO: 94) og QQSYSMPA (SEQ ID NO: 96). > 23K12 VH-nukleotidsekvens: (SEQ ID NO: 49) > 23K12 VH-aminosyresekvens: (SEQ ID NO: 0) Kabat (fet skrift), Chothia (understreket) > 23K12 VL-nukleotidsekvens: (SEQ ID NO: 1) 1 > 23K12 VL-aminosyresekvens: (SEQ ID NO: 2) Kabat (fet skrift), Chothia (understreket) Med mindre annet er definert, skal vitenskapelige og tekniske betegnelser anvendt i forbindelse med den foreliggende oppfinnelse ha den betydning som er alminnelig forstått av en fagperson. Betegnelser i entall skal videre inkludere flertall, og betegnelser i flertall skal inkludere entall, med mindre annet er påkrevd ut fra sammenheng. Nomenklaturer benyttet i forbindelse med, og teknikker for, celle- og vevskultur, molekylærbiologi- og protein- og oligo- eller polynukleotidkjemi og -hybridisering beskrevet heri, er generelt dem velkjent og

17 17 1 alminnelig anvendt i teknikken. Alminnelige teknikker anvendes for rekombinant DNA, oligonukleotidsyntese og vevskultur og -transformasjon (f.eks. elektroporasjon, lipofeksjon). Enzymatiske reaksjoner og rensingsteknikker utføres ifølge produsentens spesifikasjoner eller som alminnelig oppnådd i teknikken eller som beskrevet heri. Gjennomføringen av den foreliggende oppfinnelse vil benytte, med mindre annet er angitt, klassiske teknikker for virologi, immunologi, mikrobiologi, molekylærbiologi og rekombinante DNAteknikker innenfor den kjente teknikk, hvorav mange er beskrevet nedenfor av illustrasjonshensyn. Slike teknikker er forklart i sin helhet i litteraturen. Se f.eks. Sambrook, et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2nd Edition, 1989); Maniatis et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual (1982); DNA Cloning: A Practical Approach, vol. I & II (D. Glover, ed.); Oligonucleotide Synthesis (N. Gait, ed., 1984); Nucleic Acid Hybridization (B. Hames & S. Higgins, eds., 198); Transcription and Translation (B. Hames & S. Higgins, eds., 1984); Animal Cell Culture (R. Freshney, ed., 1986); Perbal, A Practical Guide to Molecular Cloning (1984). Nomenklaturene benyttet i forbindelse med, og laboratorieprosedyrene og - teknikkene for, analytisk kjemi, syntetisk organisk kjemi og medisinsk og farmasøytisk kjemi beskrevet heri, er dem velkjent og alminnelig anvendt i teknikken. Alminnelige teknikker anvendes for kjemiske synteser, kjemiske analyser, farmasøytisk fremstilling, formulering og tilførsel og behandling av pasienter. 2 Følgende definisjoner er nyttige for å forstå den foreliggende oppfinnelse: Betegnelsen "antistoff" (Ab) som anvendt heri inkluderer monoklonale antistoffer, polyklonale antistoffer, multispesifikke antistoffer (f.eks. bispesifikke antistoffer) og antistoffragmenter, så lenge de viser ønsket biologisk aktivitet. Betegnelsen "immunglobulin" (Ig) anvendes synonymt med "antistoff" heri. 3 Et "isolert antistoff" er et som er separert og/eller gjenvunnet fra en komponent i sitt naturlige miljø. Kontaminantkomponenter i sitt naturlige miljø er materialer som ville forstyrre diagnostiske eller terapeutiske anvendelser for antistoffet, og kan omfatte enzymer, hormoner og andre proteinholdige eller ikkeproteinholdige soluter. I foretrukne utførelsesformer er antistoffet renset: 1) til

18 mer enn 9 vekt-% av antistoff etter bestemmelse ved Lowry-metoden, og mest foretrukket mer enn 99 vekt-%, 2) til en tilstrekkelig grad til å oppnå minst 1 restenheter av N-terminal eller intern aminosyresekvens ved anvendelse av en sekvenator med roterende kopp, eller 3) til homogenitet ved SDS-PAGE under reduserende eller ikke-reduserende betingelser ved hjelp av coomassieblå eller fortrinnsvis sølvfarge. Isolert antistoff omfatter antistoffet in situ i rekombinante celler siden minst én komponent i antistoffets naturlige miljø ikke vil være til stede. Isolert antistoff vil imidlertid vanligvis fremstilles ved hjelp av minst ett rensetrinn. Den grunnleggende firekjedede antistoffenheten er et heterotetramert glykoprotein sammensatt av to identiske lette (L) kjeder og to identiske tunge (H) kjeder. Et IgM-antistoff består av av de grunnleggende heterotetramerenhetene sammen med et ytterligere polypeptid kalt J-kjede, og inneholder derfor antigenbindingssteder, mens utskilte IgA-antistoffer kan polymeriseres for dannelse av polyvalente enheter omfattende 2 av de grunnleggende 4-kjedede enhetene sammen med J-kjede. For IgG-er er den 4- kjedede enheten vanligvis ca. 000 dalton. Hver L-kjede er bundet til en H- kjede ved én kovalent disulfidbinding, mens de to H-kjedene er bundet til hverandre ved én eller flere disulfidbindinger avhengig av H-kjedens isotype. Hver H- og L-kjede har også regelmessig plasserte intrakjededisulfidbroer. Hver H-kjede har i N-terminalen et variabelt domene (V H ) etterfulgt av tre konstante domener (C H ) for hver av α- og γ-kjedene og fire C H -domener for µ- og ε- isotypene. Hver L-kjede har i N-terminalen et variabelt domene (V L ) etterfulgt av et konstant domene (C L ) i den andre enden. V L sammenstilles med V H, og C L sammenstilles med den tunge kjedens første konstante domene (C H 1). Særlige aminosyrerester antas å danne en fasegrense mellom den lette kjedens og den tunge kjedens variable domener. Paringen av en V H og V L danner til sammen et enkelt antigenbindingssted. Mer informasjon om strukturen og egenskapene til de forskjellige klassene av antistoffer finnes for eksempel i Basic and Clinical Immunology, 8th edition, Daniel P. Stites, Abba 1. Terr and Tristram G. Parslow (eds.), Appleton & Lange, Norwalk, Conn., 1994, s. 71 og kapittel 6. 3 L-kjeden fra hvilke som helst virveldyrarter kan grupperes i ett av to klart atskilte typer, kalt kappa (κ) og lambda (λ), basert på aminosyresekvensene i deres konstante domener (C L ). Avhengig av aminosyresekvensen i deres tunge

19 19 kjeders konstante domener (C H ) kan immunglobuliner grupperes i forskjellige klasser eller isotyper. Det finnes fem klasser av immunglobuliner: IgA, IgD, IgE, IgG og IgM, med tunge kjeder betegnet som henholdsvis alfa (q), delta (δ), epsilon (ε), gamma (γ) og mu (µ). Klassene γ og α deles ytterligere inn i underklasser på grunnlag av relativt mindre forskjeller i C H -sekvens og funksjon, f.eks. uttrykker mennesker følgende underklasser: IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 og IgA Betegnelsen "variabel" betyr at visse segmenter i V-domenene er svært forskjellige i sekvens blant antistoffer. V-domenet medierer antigenbinding og definerer et særlig antistoffs spesifisitet for dets særlige antigen. Men variabiliteten er ikke jevnt fordelt over de variable domenenes 1- aminosyreområde. V-regionene består i stedet av relativt faste områder kalt sekvensregioner (FR-er) på 1 aminosyrer atskilt av kortere regioner med ekstrem variabilitet kalt "hypervariable regioner" som i hvert tilfelle er 9 12 aminosyrer lang. De variable domenene med native tunge og lette kjeder omfatter i hvert tilfelle fire FR-er, i det store og hele i en β-flakkonfigurasjon, koblet sammen av tre hypervariable regioner, som danner sløyfer som kobler sammen, og som i noen tilfeller utgjør en del av β-flakstrukturen. De hypervariable regionene i hver kjede holdes tett sammen av FR-ene og bidrar, sammen med de hypervariable regionene fra den andre kjeden, til dannelsen av antigenbindingsstedet for antistoffer (se Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)). De konstante domenene er ikke direkte involvert i binding av et antistoff til et antigen, men viser forskjellige effektorfunksjoner, slik som antistoffets deltagelse i antistoffavhengig cellecytotoksitet (ADCC). 3 Betegnelsen "hypervariabel region" betyr som anvendt heri aminosyrerestene av et antistoff som er ansvarlige for antigenbinding. Den hypervariable regionen omfatter generelt aminosyrerester fra en "komplementaritetsbestemmende region" eller "CDR" (f.eks. cirka rundt rester (L1), 0 6 (L2) og (L3) i V L, og cirka rundt 31 3 (H1), 0 6 (H2) og 9 2 (H3) i V H når de er nummerert i samsvar med Kabat-nummereringssystemet, Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)), og/eller de som er rester fra en "hypervariabel sløyfe" (f.eks. rest (L1), 0 6 (L2) og (L3) i

20 V L og (H1), 2 6 (H2) og 9 1 (H3) i V H når de er nummerert i samsvar med Chothia-nummereringssystemet, Chothia and Lesk, J. Mol. Biol. 196: (1987)), og/eller de som er rester fra en "hypervariabel sløyfe" / CDR (f.eks. rest (L1), 6 6 (L2) og 1 (L3) i V L og (H1), 6 6 (H2) og 1 (H3) i V H når de er nummerert i samsvar med IMGTnummereringssystemet, Lefranc, M.P. et al. Nucl. Acids Res. 27:9 212 (1999), Ruiz, M. et al. Nucl. Acids Res. 28: (00)). Antistoffet har eventuelt symmetriske insersjoner ved ett eller flere av følgende punkter 28, 36 (L1), 63, 74 7 (L2) og 123 (L3) i V L, og 28, 36 (H1), 63, 74 7 (H2) og 123 (H3) i V H når de er nummerert i samsvar med AHo; Honneger, A. and Plunkthun, A. J. Mol. Biol. 9: (01)). 1 Betegnelsen "kjønnscellenukleinsyrerest" betyr nukleinsyreresten som naturlig forekommer i et kjønnscellegen som koder for en konstant eller variabel region. "Kjønnscellegen" er DNA-et påvist i en kjønnscelle (dvs. en celle beregnet på å bli et egg eller i spermen). En "kjønnscellemutasjon" betyr en arvelig endring i et særlig DNA som oppstår i en kjønnscelle eller zygotet på encellestadiet, og når en slik mutasjon overføres til avkom, inkorporeres den i hver celle i kroppen. En kjønnscellemutasjon står i motsetning til en somatisk mutasjon som erverves i en enkelt kroppscelle. I noen tilfeller muteres nukleotider i en kjønnscelle-dnasekvens som koder for en variabel region (dvs. en somatisk mutasjon) og utbyttes med et annet nukleotid. 2 3 Betegnelsen "monoklonalt antistoff" betyr som anvendt heri, et antistoff oppnådd fra en populasjon av i det vesentlige homogene antistoffer, dvs. at de enkelte antistoffer omfattende populasjonen er identiske med unntak av mulige naturlig forekommende mutasjoner som kan være til stede i mindre mengder. Monoklonale antistoffer er svært spesifikke, idet de rettes mot et enkelt antigensted. I motsetning til polyklonale antistoffremstillinger som omfatter forskjellige antistoffer rettet mot forskjellige determinanter (epitoper), er hvert monoklonalt antistoff videre rettet mot en enkelt determinant på antigenet. I tillegg til deres spesifisitet er de monoklonale antistoffene fordelaktige fordi de kan syntetiseres ukontaminert av andre antistoffer. Betegnelsen "monoklonal" skal ikke tolkes som om det kreves produksjon av antistoffet ved en særlig fremgangsmåte. De monoklonale antistoffene som er nyttige i den foreliggende oppfinnelse, kan for eksempel fremstilles ved hybridommetoden først beskrevet

21 21 av Kohler et al., Nature, 26:49 (197), eller kan fremstilles ved rekombinante DNA-metoder i bakterielle, eukaryotiske dyre- eller planteceller (se for eksempel US-patent nr ). De "monoklonale antistoffene" kan også isoleres fra fagantistoffbiblioteker ved hjelp av teknikkene beskrevet i for eksempel Clackson et al., Nature, 32: (1991) og Marks et al., J. Mol. Biol., 222:81 97 (1991) De monoklonale antistoffene heri omfatter "kimære" antistoffer hvor en del av den tunge og/eller lette kjeden er identisk med eller homolog til tilsvarende sekvenser i antistoffer avledet av en særlig art eller tilhørende en særlig antistoffklasse eller -underklasse, mens resten av kjedene er identisk med eller homolog til tilsvarende sekvenser i antistoffer avledet av andre arter eller tilhørende andre antistoffklasser eller -underklasser, samt fragmenter av slike antistoffer, så lenge de viser ønsket biologisk aktivitet (se US-patent nr og Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81: (1984)). Den foreliggende redegjørelse tilveiebringer det variable domenets antigenbindingssekvenser avledet av humane antistoffer. Kimære antistoffer av primær interesse heri inkluderer således antistoffer med én eller flere humane antigenbindingssekvenser (f.eks. CDR-er) og inneholdende én eller flere sekvenser avledet av et ikke-humant antistoff, f.eks. en FR- eller C- regionsekvens. Kimære antistoffer av primær interesse heri inkluderer i tillegg dem omfattende et humant variabelt domenes antigenbindingssekvens av én antistoffklasse eller -underklasse og en annen sekvens, f.eks. FR- eller C- regionsekvens, avledet av en annen antistoffklasse eller -underklasse. Kimære antistoffer av interesse heri inkluderer også dem inneholdende det variable domenets antigenbindingssekvenser relatert til dem beskrevet heri eller avledet av forskjellige arter, slik som en ikke-human primat (f.eks. dyreape, menneskeape osv.). Kimære antistoffer inkluderer også primatiserte og humaniserte antistoffer. Kimære antistoffer kan videre omfatte rester som ikke finnes i mottakerantistoffet eller i donorantistoffet. Disse modifikasjonene foretas for ytterligere å raffinere antistoffytelsen. Mer informasjon finnes i Jones et al., Nature 321:22 2 (1986); Riechmann et al., Nature 332: (1988) og Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:93 96 (1992).

22 22 Et "humanisert antistoff" anses generelt for å være et humant antistoff som har én eller flere aminosyrerester ført inn i seg fra en kilde som er ikke-human. Disse ikke-humane aminosyrerestene kalles ofte "import"-rester, som typisk tas fra et variabelt "import"-domene. Humanisering utføres tradisjonelt ved hjelp av fremgangsmåten til Winter et al. (Jones et al., Nature, 321:22 2 (1986); Riechmann et al., Nature, 332: (1988); Verhoeyen et al., Science, 239: (1988)), ved å substituere importsekvenser i de hypervariable regionene med de tilsvarende sekvensene av et humant antistoff. Slike "humaniserte" antistoffer er derfor kimære antistoffer (US-patent nr ) hvor vesentlig mindre enn et intakt humant variabelt domene substitueres med den tilsvarende sekvensen fra en ikke-human art. 1 2 Et "humant antistoff" er et antistoff inneholdende bare sekvenser foreliggende i et antistoff naturlig produsert av et menneske. Men som anvendt heri kan imidlertid humane antistoffer omfatte rester eller modifikasjoner ikke påvist i et naturlig forekommende humant antistoff, herunder modifikasjonene og variantsekvensene beskrevet heri. Disse fremstilles typisk for videre å raffinere eller forsterke antistoffytelse. Et "intakt" antistoff er et som omfatter et antigenbindingssted og en C L og minst den tunge kjedens konstante domener C H 1, C H 2 og C H 3. De konstante domenene kan være konstante domener med nativ sekvens (f.eks. humane konstante domener med nativ sekvens) eller aminosyresekvensvariant derav. Det intakte antistoffet har fortrinnsvis én eller flere effektorfunksjoner. Et "antistoffragment" omfatter en del av et intakt antistoff, fortrinnsvis det intakte antistoffets antigenbinding eller variable region. Eksempler på antistoffragmenter inkluderer Fab-, Fab'-, F(ab') 2 - og Fv-fragmenter, diastoffer, lineære antistoffer (se US-patent nr ; Zapata et al., Protein Eng. 8(): 7 62 (199)), enkjedede antistoffmolekyler og multispesifikke antistoffer dannet av antistoffragmenter. 3 Betegnelsen "funksjonelt fragment eller funksjonell analog" av et antistoff er en forbindelse med kvalitativ biologisk aktivitet til felles med et antistoff av full lengde. Et funksjonelt fragment eller en funksjonell analog av et anti-ige-

23 23 antistoff er ett som kan binde til et IgE-immunglobulin på en slik måte at det forebygger eller vesentlig reduserer et slikt molekyls evne til å ha evnen til å binde til reseptoren med høy affinitet, Fc ε RI. 1 Papain-nedbryting av antistoffer produserer to identiske antigenbindingsfragmenter, kalt "Fab"-fragmenter, og et overskytende "Fc"- fragment, en betegnelse som gjenspeiler evnen til enkelt å krystallisere. Fabfragmentet består av en hel L-kjede sammen med H-kjedens variable domene (V H ), og det første konstante domenet i én tung kjede (C H 1). Hvert Fabfragment er monovalent med hensyn til antigenbinding, dvs. det har et enkelt antigenbindingssted. Pepsinbehandling av et antistoff gir et enkelt stort F(ab') 2 - fragment som i grove trekk tilsvarer to disulfidbundne Fab-fragmenter som har divalent antigenbindingsaktivitet og fortsatt kan kryssbinde antigen. Fab'- fragmenter skiller seg fra Fab-fragmenter ved at de har ytterligere få rester ved C H 1-domenets karboksyterminal, omfattende ett eller flere cysteiner fra antistoffets hengselsregion. Fab'-SH er betegnelsen heri for Fab' hvor cysteinresten(e) fra de konstante domenene bærer en fri tiolgruppe. F(ab') 2 - antistoffragmenter ble opprinnelig produsert som par av Fab'-fragmenter som har hengselscysteiner mellom seg. Andre kjemiske koblinger av antistoffragmenter er også kjent. 2 "Fc"-fragmentet omfatter karboksyterminalens deler av begge H-kjedene holdt sammen av disulfider. Antistoffers effektorfunksjoner er bestemt av sekvenser i Fc-regionen, hvilken region også er den delen som gjenkjennes av Fc-reseptorer (FcR) som finnes på visse celletyper. 3 "Fv" er det minste antistoffragmentet som inneholder et fullstendig gjenkjennings- og bindingssted for antigen. Dette fragmentet består av en dimer av én tung kjedes og én lett kjedes variable domene i tett, ikke-kovalent binding. Fra foldingen av disse to domenene kommer seks hypervariable sløyfer (tre sløyfer hver fra H- og L-kjeden) som bidrar til aminosyrerestene for antigenbinding og gir antistoffet antigenbindingsspesifisitet. Også et enkelt variabelt domene (eller halvparten av et Fv omfattende bare tre CDR-er spesifikke for et antigen) har imidlertid evnen til å gjenkjenne og binde antigen, selv om dette er ved en lavere affinitet enn hele bindingsstedet.

24 24 "Enkjedet Fv", også forkortet "sfv" eller "scfv", er antistoffragmenter som omfatter V H - og V L -antistoffdomenene som er koblet sammen til en enkelt polypeptidkjede. sfv-polypeptidet omfatter videre fortrinnsvis en polypeptidbinding mellom V H - og V L -domenene som aktiverer sfv-et for dannelse av ønsket struktur for antigenbinding. En oversikt over sfv finnes i Pluckthun i The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, bd. 113, Rosenburg and Moore eds., Springer-Verlag, New York, s (1994); Borrebaeck 199, infra. 1 Betegnelsen "diastoffer" betyr små antistoffragmenter fremstilt ved konstruksjon av sfv-fragmenter (se foregående avsnitt) med korte bindinger (ca. rester) mellom V H - og V L -domenene slik at interkjedeparing, men ikke intrakjedeparing av V-domenene oppnås, hvilket resulterer i et bivalent fragment, dvs. et fragment med to antigenbindingssteder. Bispesifikke diastoffer er heterodimere av to "crossover"-sfv-fragmenter hvor de to antistoffenes V H - og V L -domener finnes på forskjellige polypeptidkjeder. Diastoffer er beskrevet mer inngående i for eksempel EP , WO 93/11161 og Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: (1993). 2 Som anvendt heri er et antistoff som "internaliseres", ett som tas opp i (dvs. kommer inn i) cellen ved binding til et antigen på en pattedyrcelle (f.eks. et celleoverflatepolypeptid eller en reseptor). Det internaliserende antistoffet vil selvfølgelig inkludere antistoffragmenter, humant eller kimært antistoff og antistoffkonjugater. For visse terapeutiske bruksområder er internalisering in vivo tiltenkt. Antallet internaliserte antistoffmolekyler vil være tilstrekkelig eller adekvat til å drepe en celle eller inhibere cellens vekst, spesielt en infisert celle. Avhengig av antistoffets eller antistoffkonjugatets potens er i noen tilfeller opptaket av et enkelt antistoffmolekyl til cellen tilstrekkelig til å drepe målcellen som antistoffet binder til. Visse toksiner er for eksempel svært potente til å drepe, slik at internalisering av et molekyl av toksinet konjugert til antistoffet er tilstrekkelig til å drepe den infiserte cellen. 3 Som anvendt heri anses et antistoff for å være "immunspesifikt for", "spesifikt for" eller "spesifikt å binde til" et antigen hvis det reagerer ved et påviselig nivå med antigenet, fortrinnsvis med en affinitetskonstant, K a, på mer enn eller lik cirka 4 M 1, eller mer enn eller lik cirka M 1, mer enn eller lik cirka 6 M 1,

25 2 mer enn eller lik cirka 7 M 1, eller mer enn eller lik 8 M 1. Et antistoffs affinitet for dets beslektede antigen uttrykkes også vanligvis som en dissosiasjonskonstant K D, og i visse utførelsesformer binder HuM2e-antistoff spesifikt til M2e hvis det binder med en K D på mindre enn eller lik 4 M, mindre enn eller lik cirka M, mindre enn eller lik cirka 6 M, mindre enn eller lik 7 M, eller mindre enn eller lik 8 M. Antistoffers affiniteter bestemmes enkelt ved hjelp av klassiske teknikker, for eksempel dem beskrevet av Scatchard et al. (Ann. N. Y. Acad. Sci. USA 1:660 (1949)). Et antistoffs bindingsegenskaper til antigener, celler eller vev derav kan generelt bestemmes og vurderes ved hjelp av immunpåvisningsmetoder, herunder for eksempel immunfluorescensbaserte assayer, slik som immunhistokjemi (IHC) og/eller fluorescensaktivert cellesortering (FACS). 1 Et antistoff med en "biologisk karakteristikk" til et angitt antistoff er ett som innehar én eller flere av de biologiske karakteristikkene til det antistoffet som skiller det fra andre antistoffer. I visse utførelsesformer vil for eksempel et antistoff med en biologisk karakteristikk til et angitt antistoff binde det samme epitopet som det bundet ved det angitte antistoffet og/eller ha en felles effektorfunksjon som det angitte antistoffet. 2 3 Betegnelsen "antagonistantistoff" anvendes i videste forstand og inkluderer et antistoff som delvis eller fullstendig blokkerer, inhiberer eller nøytraliserer en biologisk aktivitet av et epitop, polypeptid eller en celle som det spesifikt binder. Fremgangsmåter for identifisering av antagonistantistoffer kan omfatte opprettelse av kontakt mellom et polypeptid eller en celle spesifikt bundet ved et kandidatantagonistantistoff og kandidatantagonistantistoffet, og måling av en påviselig endring i én eller flere biologiske aktiviteter normalt assosiert med polypeptidet eller cellen. Et "antistoff som inhiberer veksten av infiserte celler" eller et "vekstinhiberende" antistoff er et som binder til og resulterer i målbar vekstinhibering av infiserte celler som uttrykker, eller som er i stand til å uttrykke et M2e-epitop bundet av et antistoff. Foretrukne veksthemmende antistoffer hemmer vekst av infiserte celler med mer enn %, fortrinnsvis fra ca. % til ca. 0 %, og enda mer foretrukket med mer enn 0 % (f.eks. fra ca. 0 % til ca. 0 %) sammenlignet

26 26 med den egnede kontrollen, idet kontrollen vanligvis er tumorceller som ikke er behandlet med antistoffet som testes. Veksthemming kan måles ved en antistoffkonsentrasjon på ca. 0,1 til µg/ml eller ca. 0, nm til 0 nm i cellekultur, hvor veksthemmingen bestemmes 1 dager etter eksponering av de infiserte cellene for antistoffet. Vekstinhibering av infiserte celler in vivo kan bestemmes på forskjellige måter kjent i teknikken. Antistoffet er vekstinhiberende in vivo hvis administrering av antistoffet ved cirka 1 µg/kg til cirka 0 mg/kg kroppsvekt resulterer i reduksjon av prosentandelen av infiserte celler eller totalt antall av infiserte celler innenfor cirka dager til 3 måneder fra første administrering av antistoffet, fortrinnsvis innenfor cirka til dager. 1 Et antistoff som "induserer apoptose", er et som induserer programmert celledød som bestemt ved binding av aneksin-v, fragmentering av DNA, cellekrymping, utvidelse av endoplasmisk retikulum, cellefragmentering og/eller dannelse av membranvesikler (kalt apoptotiske stoffer). Cellen er fortrinnsvis en infisert celle. En rekke fremgangsmåter er tilgjengelige for evaluering av cellehendelser assosiert med apoptose. Translokasjon av fosfatidylserin (PS) kan for eksempel måles ved aneksinbinding, DNA-fragmentering kan evalueres ved DNA-laddering, og nukleær-/kromatinkondensering sammen med DNA-fragmentering kan evalueres ved enhver økning i hypodiploidceller. Antistoffet som induserer apoptose, er fortrinnsvis et som resulterer i ca. 2 til 0 ganger, fortrinnsvis ca. til 0 ganger, og mest foretrukket ca. til 0 ganger, induksjon av aneksinbinding i forhold til ubehandlet celle i et aneksinbindingsassay. 2 Betegnelsen "effektorfunksjoner" i forbindelse med antistoffer betyr deres biologiske aktiviteter som kan tilskrives Fc-regionen (en Fc-region med nativ sekvens eller en Fc-region med aminosyresekvensvariant) i et antistoff, og disse varierer med antistoffets isotype. Eksempler på antistoffeffektorfunksjoner omfatter: CIq-binding og komplementavhengig cytotoksitet, Fc-reseptorbinding, antistoffavhengig cellemediert cytotoksitet (ADCC), fagocytose, nedregulering av celleoverflatereseptorer (f.eks. B-cellereseptor) og B-celleaktivering. 3 Betegnelsen "antistoffavhengig cellemediert cytotoksitet" eller "ADCC" betyr en form for cytotoksitet hvor utskilt Ig bundet til Fc-reseptorer (FcR-er) på visse cytotoksiske celler (f.eks. naturlige drapsceller (NK), neutrofiler og makrofager) gjør disse cytotoksiske effektorcellene i stand til å binde spesifikt til en

27 27 antigenbærende målcelle og deretter drepe målcellen med cytotoksiner. Antistoffene "bevæpner" de cytotoksiske cellene og er nødvendige for slik dreping. Primærcellene for mediering av ADCC, NK-celler, uttrykker bare FcγRIII, mens monocytter uttrykker FcγRI, FcγRII og FcγRIII. FcR-ekspresjon på hematopoietiske celler er oppsummert i tabell 3 på side 464 i Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol 9:47 92 (1991). For å vurdere ADCC-aktivitet i et molekyl av interesse kan det utføres et ADCC-assay in vitro, slik som beskrevet i USpatent nr eller US-patent nr Nyttige effektorceller for slike assayer omfatter mononukleære celler i perifert blod (PBMC) og naturlige drapsceller (NK). Alternativt eller i tillegg kan ADCC-aktivitet for molekylet av interesse vurderes in vivo, f.eks. i en dyremodell slik som den beskrevet i Clynes et al., PNAS (USA) 9:62 66 (1998). 1 2 Betegnelsen "Fc-reseptor" eller "FcR" betyr en reseptor som binder til Fcregionen i et antistoff. I visse utførelsesformer er FcR en human FcR med nativ sekvens. En foretrukket FcR er videre en som binder et IgG-antistoff (en gammareseptor) og omfatter reseptorer av FcγRI-, FcγRII- og FcγRIIIunderklassene, herunder alleliske varianter og eventuelt spleisede former av disse reseptorene. FCγRII-reseptorer inkluderer FcγRIIA (en "aktiverende reseptor") og FcγRIIB (en "inhiberende reseptor"), som har lignende aminosyresekvenser som er forskjellige primært i de cytoplasmiske domenene derav. Aktiverende reseptor FcγRIIA inneholder et ITAM (immunreseptortyrosinbasert aktiveringsmotiv) i sitt cytoplasmiske domene. Inhiberende reseptor FcγRIIB inneholder et ITIM (immunreseptortyrosinbasert inhiberingsmotiv) i sitt cytoplasmiske domene. (Se oversikt M. i Daeron, Annu. Rev. Immunol. 1:3 234 (1997)). FcR-er behandles i Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol 9:47 92 (1991); Capel et al., Immunomethods 4:2 34 (1994) og de Haas et al., J. Lab. Clin. Med. 126:3 41 (199). Andre FcR-er, herunder dem som vil bli identifisert i fremtiden, omfattes av betegnelsen "FcR" heri. Betegnelsen omfatter også den neonatale reseptoren, FcRn, som er ansvarlig for overføring av morens IgG-er til fosteret (Guyer et al., J. Immunol. 117:87 (1976) og Kim et al., J. Immunol. 24:249 (1994)). 3 "Humane effektorceller" er leukocytter som uttrykker én eller flere FcR-er og utfører effektorfunksjoner. Cellene uttrykker fortrinnsvis minst FcγRIII og utfører ADCC-effektorfunksjoner. Eksempler på humane leukocytter som medierer

28 28 ADCC, inkluderer PBMC, NK-celler, monocytter, cytotoksiske T-celler og neutrofiler, hvor PBMC-er og NK-celler er foretrukket. Effektorcellene kan isoleres fra en nativ kilde, f.eks. fra blod. Betegnelsen "komplementavhengig cytotoksitet" eller "CDC" betyr lysering av en målcelle under nærvær av komplementet. Aktivering av den klassiske komplementveien initieres av den første komponentens binding i komplementsystemet (Clq) til antistoffer (av den relevante underklassen) som er bundet til deres beslektede antigen. For å vurdere komplementaktivering kan et CDC-assay, f.eks. som beskrevet i Gazzano-Santoro et al., J. Immunol. Methods 2:163 (1996), utføres. 1 Betegnelsene "influensa A" og "influensavirus A" viser til medlemmer av Orthomyxoviridae-familien av viruser. Influensavirus A inkluderer bare én art: Influensa A-virus som forårsaker influensa hos fugler, mennesker, griser og hester. Stammer av alle undertyper av influensa A-virus er isolert fra villfugler, selv om sykdommen er uvanlig. Noen isolater av influensa A-virus forårsaker alvorlig sykdom både hos tamfjærkre og, sjeldent, hos mennesker. Et "pattedyr" i sammenheng med behandling av en infeksjon betyr et hvilket som helst pattedyr, herunder mennesker, hus- og gårdsdyr og dyr i dyreparker, dyr som brukes til sport, og kjæledyr, slik som hunder, katter, kveg, hester, sauer, griser, geiter, kaniner osv. Pattedyret er fortrinnsvis et menneske. 2 3 Betegnelsen "behandle" eller "behandling" eller "lindring" betyr både terapeutisk behandling og profylaktisk eller forebyggende tiltak, hvor formålet er å forhindre eller bremse den utpekte patologiske tilstanden eller forstyrrelsen. De som trenger behandling, omfatter de som allerede har forstyrrelsen, og de som er utsatt for å få forstyrrelsen, eller de som kan unngå forstyrrelsen. En pasient eller et pattedyr er med hell "behandlet" for en infeksjon hvis pasienten etter å ha mottatt en terapeutisk mengde av et antistoff ifølge fremgangsmåter ifølge den foreliggende oppfinnelse, viser synlig og/eller målbar reduksjon eller fravær av ett eller flere av følgende: reduksjon av antall infiserte celler eller fravær av de infiserte celler, reduksjon av prosentandelen av alle celler som er infisert, og/eller til en viss grad lindring av ett eller flere av symptomene assosiert med den spesifikke infeksjon, redusert morbiditet og dødelighet og forbedring i

29 29 livskvalitet. Parameterne ovenfor for vurdering av vellykket behandling og forbedring av sykdommen er lett målbare ved hjelp av rutineprosedyrer som er kjent for en lege. Betegnelsen "terapeutisk virkningsfull mengde" betyr en mengde av et antistoff eller et legemiddel som er virkningsfull for å "behandle" en sykdom eller forstyrrelse hos en pasient eller et pattedyr. Se foregående definisjon av "behandling". 1 Betegnelsen "kronisk" tilførsel betyr tilførsel av stoffene på en kontinuerlig måte som, i motsetning til en akutt måte, opprettholder den opprinnelige terapeutiske virkningen (aktiviteten) over en lengre tidsperiode. "Intermitterende" tilførsel er behandling som ikke gis kontinuerlig uten avbrudd, men som heller er syklisk av natur. Tilførsel "i kombinasjon med" ett eller flere ytterligere terapeutiske stoffer omfatter samtidig og kontinuerlig tilførsel i en hvilken som helst rekkefølge. 2 Betegnelsen "bærestoffer" betyr som anvendt heri farmasøytisk akseptable bærestoffer, hjelpestoffer eller stabiliseringsmidler som er ikke-toksiske for cellen eller pattedyret som eksponeres derfor ved de anvendte dosene og konsentrasjonene. Det fysiologisk akseptable bærestoffet er ofte en vandig phbufret løsning. Eksempler på fysiologisk akseptable bærestoffer omfatter buffere slik som fosfat, citrat og andre organiske syrer, antioksidanter omfattende askorbinsyre, polypeptid med lav molekylvekt (mindre enn ca. rester), proteiner, slik som serumalbumin, gelatin eller immunglobuliner, hydrofile polymerer slik som polyvinylpyrrolidon, aminosyrer slik som glycin, glutamin, asparagin, arginin eller lysin, monosakkarider, disakkarider og andre karbohydrater omfattende glukose, mannose eller dekstriner, chelaterende stoffer slik som EDTA, sukkeralkoholer slik som mannitol eller sorbitol, saltdannende motioner slik som natrium, og/eller ikke-ioniske surfaktanter slik som TWEEN, polyetylenglykol (PEG) og PLURONICS. 3 Betegnelsen "cytotoksisk stoff" betyr som anvendt heri et stoff som inhiberer eller forhindrer funksjonen til celler og/eller forårsaker destruksjon av celler. Betegnelsen er ment å omfatte radioaktive isotoper (f.eks. At 211, I 111, I 2, Y 90,