Tittel : KOSMETISK BRUK AV INHIBITORER AV TYROSINASE

Transkript

1 1 Tittel : KOSMETISK BRUK AV INHIBITORER AV TYROSINASE Beskrivelse OPPFINNELSENS OMRÅDE Den foreliggende oppfinnelsen vedrører en kosmetisk fremgangsmåte for lysning av hud, omfattende anvendelsen av sammensetninger basert på estere av substituerte metanoler som reduserer melanindannelse. OPPFINNELSENS BAKGRUNN Hyperpigmentering av huden er direkte knyttet til dannelse av melanin, et mørkt pigment dannet av tyrosin. De første trinnene i omdannelsen av tyrosin til melanin medieres av enzymet tyrosinase. Effektive inhibitorer av tyrosinase kan inhibere dannelsen av melanin og er nyttige for å redusere uønsket pigmentering av huden (f.eks. hudlysning, utjevning av hudtone eller reduksjon av synligheten av pigmentflekker). Det finnes for tiden flere tyrosinaseinhibitorer på markedet, herunder hydrokinon, kojic-syre og arbutin. Det er imidlertid ulemper ved hvert av disse produktene. For eksempel oppviser kojic-syre lav biotilgjengelighet og derfor marginal effekt. Et annet eksempel, hydrokinon, oksiderer i luft, lys og i selve tyrosinasen. Disse oksiderte produktene av hydrokinon har vært implisert i hudirritasjon og kanskje cytotoksisitet. 2 Kojic-syre brukes ofte som en hudlysnende ingrediens. Det er et soppbasert metabolsk produkt som har vist seg å være både trygt og effektivt til topisk anvendelse (gjennomgått av Burdock et al., 01, Regulatory Toxicology and Pharmacology 33: 80-1). Monoestere og diestere av kojic-syre er også beskrevet (Nagai, S.; Izumi, T., U.S. Pat. nr ) og viser seg å ha utmerket tyrosinaseinhiberende aktivitet for å inhibere dannelsen av melanin i huden. Denne inhiberingen kan tilveiebringe gode effekter med hensyn til lysning av huden. Det finnes to distinkte monoestere som kan fremstilles fra kojic-syre eller 4- hydroksybenzylalkohol, ettersom foreldremolekylene har både en enolalkohol (eller en fenol) og en primær alkohol. Monoesterne av kojic-syre rapportert i

2 2 U.S. Pat. nr ble fremstilt ved kjemiske metoder ved høy temperatur og ga esteren av den primære alkoholen. De drastiske betingelsene som ble anvendt, ville ikke være mulig for termisk ustabile reaksjonspartnere. Kojic-syre har blitt rapportert å være acylert enzymatisk, spesielt på enoloksygen (Liu, K.- J; Shaw, J.-F. J. Am. Oil Chem. Soc. 1998, 7, 07 11). I en motstridende rapport indikerte en japansk patentsøknad (søknadsnummer ) at kojic-syre ble enzymatisk acylert på hydrokymetyloksygen ved anvendelse av en syre eller vinylester som acyleringsmiddel. Hemmere som er mer biotilgjengelige og effektive presenterer et forbedret potensial for en merkbar lysningsfordel uten hudirritasjon. Andre sannsynlige fordeler vil innbefatte brukervennlighet, bedre holdbarhet og mindre hyppig påføring. Det er formålet for denne oppfinnelsen å tilveiebringe en kosmetisk fremgangsmåte for hudlysning ved bruk av slike forbindelser og slik sammensetning. KORT BESKRIVELSE AV OPPFINNELSEN Oppfinnelsen tilveiebringer en kosmetisk fremgangsmåte for hudlysning, omfattende påføringen på et hudområde av en sammensetning omfattende en esterforbindelse representert ved formel 1: og et kosmetisk akseptabelt bærestoff 2 hvori R er valgt fra gruppen bestående av substituert eller usubstituert C 6 -C 22 karbosyklisk hydroksyaryl og R 1 er valgt fra gruppen bestående av C 1 -C 22 -alkyl, C 2 -C 22 -alkenyl, C 4 -C 22 -dienyl, C 6 -C 22 -trienyl, C 8 -C 22 -tetraenyl og blandinger derav. DETALJERT BESKRIVELSE Videre beskrives en mild, enkel, biokatalytisk fremgangsmåte for fremstillingen av monomerer og relaterte materialer hvori esteren danner et primært oksygen i

3 3 stedet for et enoloksygen. Disse forbindelsene fungerer som svært effektive tyrosinaseinhibitorer. Det beskrives en fremgangsmåte for fremstillingen av estersammensetninger representert ved den generelle formelen (x): hvori R er valgt fra substituert eller usubstituert C 6 -C 22 karbosyklisk hydroksyaryl, substituert hydroksy-4h-pyran-4-on-2-yl og substituert eller usubstituert C 1 -C ) hydroksyheteroaryl hvori heteroatomene er valgt fra svovel, nitrogen og oksygen; og R 1 er valgt fra substituert og usubstituert, forgrenet og rettkjedet mettet C 1 -C 22 alkyl, substituert og usubstituert, forgrenet og rettkjedet C 2 -C 22 alkenyl, substituert og usubstituert, forgrenet og rettkjedet C 4 -C 22 -dienyl, substituert og usubstituert, forgrenet og rettkjedet C 6 -C 22 -trienyl og substituert og usubstituert, forgrenet og rettkjedet C 8 -C 22 -tetraenyl eller blandinger derav. 2 Arylgruppene som R kan representere, kan innbefatte fenyl, naftyl eller antracenyl og fenyl, naftyl eller antracenyl substituert med en hydroksylgruppe og en til tre ytterligere substituenter valgt fra C 1 -C 6 -alkyl, substituert C 1 -C 6 -alkyl, C 6 -C - aryl, substituert C 6 -C -aryl, C 1 -C 6 -alkoksy, hydroksy, halogen, karboksy, cyano, C 1 -C 6 -alkanoyloksy, C 1 -C 6 -alkyltio, C 1 -C 6 -alkylsulfonyl, trifluormetyl, hydroksy, C 2 -C 6 -alkoksykarbonyl, C 2 -C 6 -alkanoylamino og -O-R 2, S-R 2, -SO 2 -R 2, - NHSO 2 R 2 og -NHCO 2 R 2, hvori R 2 er fenyl, naftyl eller fenyl eller naftyl substituert med en til tre grupper valgt fra C 1 -C 6 -alkyl, C 6 -C aryl, C 1 -C 6 alkoksy og halogen. Heteroarylgruppene som R kan representere, innbefatter en - eller 6-leddet hydroksy-substituert aromatisk ring inneholdende en til tre heteroatomer valgt fra oksygen, svovel og nitrogen. Eksempler på slike heteroarylgrupper er hydroksytienyl, hydroksyfuryl, hydroksypyrrolyl, hydroksyimidazolyl, hydroksypyrazolyl, hydroksytiazolyl, hydroksyisotiazolyl, hydroksyoksazolyl, hydroksyisoksazolyl, hydroksytriazolyl, hydroksytiadiazolyl, hydroksyoksadiazolyl, hydroksy-

4 4 tetrazolyl, hydroksypyridyl, hydroksypyrimidyl, hydroksybenzoksazolyl, hydroksybenzotiazolyl, hydroksy benzimidazolyl, hydroksyindolyl og lignende. Heteroarylradikalene kan være substituert, for eksempel, med opptil tre ytterligere grupper slik som C 1 -C 6 -alkyl, C 1 -C 6 -alkoksy, substituert C 1 -C 6 -alkyl, hydroksy, halogen, C 1 -C 6 -alkyltio, aryl, aryltio, aryloksy, C 2 -C 6 -alkoksykarbonyl og C 2 -C 6 - alkanoylamino. Heteroarylradikalene kan også være substituert med et fusjonert ringsystem, f.eks. en benzo- eller naftorest, som kan være usubstituert eller substituert, for eksempel med opptil tre av gruppene angitt i foregående setning. Benevnelsen "halogen" brukes til å omfatte fluor, klor, brom og jod. Alkylet, alkenylet, dienylet, trienylet og tetraenylgruppene som kan være representert av R 1 kan være rette eller forgrenete alifatiske hydrokarbonradikaler inneholdende opptil ca. karbonatomer og kan være substituert med for eksempel én til tre grupper valgt fra C 1 -C 6 -alkoksy, cyano, C 2 -C 6 -alkoksykarbonyl, C 2 - C 6 -alkanoyloksy, hydroksy, aryl, heteroaryl, tiol, tioeter, ditiolan og halogen. Benevnelsene "C 1 -C 6 -alkoksy", "C 2 -C 6 -alkoksykarbonyl" og "C 2 -C 6 -alkanoyloksy" anvendes for å betegne radikaler som tilsvarer hhv. strukturene -OR 3, -CO 2 R 3 og -OCOR 3, hvori R 3 er C 1 -C 6 -alkyl eller substituert C 1 -C 6 -alkyl. Forbindelsene til bruk i den kosmetiske fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen er definert i formel 1, og de foretrukne er de i hvilke R er fenol. 2 Særlig foretrukne forbindelser er betegnet med strukturene 1 hvori R er 4- hydroksyfenyl og R 1 er valgt fra lineære C 1 -C 16 -alkylgrupper. Fremstillingsprosessen omfatter reaksjonen av alkohol 2: med et syrederivat med formel 3:

5 i nærværet av en lipase og molekylsiler og i nærværet eller fraværet av et organisk løsemiddel for å danne den ønskede esteren 1 hvori substituenten R av alkoholen 2 og R 1 av syrederivat 3 er som definert over og substituent R 4 av syrederivatet er valgt blant hydrogen og substituerte eller usubstituerte C 1 -C 4 - alkylgrupper. Eksempler på C 1 -C 4 -alkylgruppene innbefatter metyl, etyl, n- propyl, i-propyl, n-butyl, i-butyl, s-butyl og lignende. Foretrukkede substituenter R 1 innbefatter hydrogen, metyl og etyl, med hydrogen som den mest foretrukne. 2 Prosessen kan utføres uten ytterligere løsemiddel eller alternativt i et inert løsemiddel valgt fra sykliske eller sykliske eterløsemidler slik som dietyleter, diisopropyleter, tert-butylmetyleter eller tetrahydrofuran, aromatiske hydrokarboner slik som benzen, toluen eller xylen, alifatiske eller alisykliske mettede eller umettede hydrokarboner slik som heksan, heptan, sykloheksan eller limonen, halogenerte hydrokarboner slik som diklormetan, dikloretan, dibrometan, tetrakloretylen eller klorbenzen, polære aprotiske løsemidler slik som acetonitril, dimetylformamid eller dimetylsulfoksid eller blandinger derav. De foretrukne løsemidlene er toluen og acetonitril. Prosessen kan utføres ved en temperatur mellom ca. 0 C og løsemidlets kokepunkt, foretrukket er ca C, mest foretrukket 60 C. Mengden av syrederivat 3 kan være mellom 0,8 og ekvivalenter basert på 2 og er fortrinnsvis mellom 1 og ekvivalenter. Enzymet som brukes i prosessen er en lipase. Lipasen kan være i form av hele celler, isolerte naturlige enzymer eller være immobilisert på støttematerialer. Eksempler på lipase omfatter, men er ikke begrenset til Lipase PS (fra Pseudomonas sp) Lipase PS-C (fra Psuedomonas sp immobilisert på keramikk), Lipase PS-D (fra Pseudomonas sp immobilisert på kiselgur), Lipoprime 0T, Lipozyme TL IM eller Novozym 43 (fra Candida antarctica immobilisert på akrylharpiks). Prosessen kan alternativt utføres i nærværet av ulike tilsetninger valgt fra molekylsiler eller ionebytteharpikser. Særlig foretrukket er molekylsiler, ettersom nærværet av disse materialene kan fjerne biprodukter slik som vann eller kortkjedede alkoholer generert under reaksjonen. Eksempler på disse innbefatter 3A-, 4A- og A-molekylsiler. 3 Produktet av prosessen kan isoleres ved anvendelse av fremgangsmåter kjent for fagmannen, f.eks. ekstrahering, filtrering eller krystallisering. Produktet 1

6 6 kan om nødvendig renses ved anvendelse av fremgangsmåter kjent for fagmannen, f.eks. ekstrahering, kromatografi, destillasjon eller krystallisering. En annet beskrevet prosess involverer transesterifiseringen av en ester 4: med et syrederivat med formel 3: i nærværet av en lipase og i nærværet eller fraværet av et organisk løsemiddel for å danne den ønskede esteren 1 hvori substituenten R av esteren 4 og R 1 og R 4 av syrederivat 3 er som definert over og substituent R av ester 4 er valgt blant hydrogen og substituerte eller usubstituerte C 1 -C 4 -alkylgrupper. Eksempler på C 1 -C 4 -alkylgruppene innbefatter metyl, etyl, n-propyl, i-propyl, n-butyl, 1- butyl, s-butyl og lignende. Foretrukkede substituenter R innbefatter hydrogen, metyl og etyl. 2 Prosessen kan utføres uten ytterligere løsemiddel eller alternativt i et inert løsemiddel valgt fra sykliske eller asykliske eterløsemidler slik som dietyleter, diisopropyleter, tert-butylmetyleter eller tetrahydrofuran, aromatiske hydrokarboner slik som benzen, toluen eller xylen, alifatisk eller alisyklisk mettede eller umettede hydrokarboner slik som heksan, heptan, sykloheksan eller limonen, halogenerte hydrokarboner slik som diklormetan, dikloretan, dibrometan, tetrakloretylen eller klorbenzen, polære aprotiske løsemidler slik som acetonitril, dimetylformamid eller dimetylsulfoksid eller blandinger derav. De foretrukne løsemidlene er toluen og acetonitril. Prosessen kan utføres ved en temperatur mellom ca. 0 C og løsemidlets kokepunkt, foretrukket er ca C, mest foretrukket 60 C. Mengden av syrederivatet 3 kan være mellom 0,8 og ekvivalenter basert på 4 og er fortrinnsvis mellom 1 og ekvivalenter. Enzymet

7 7 som anvendes i prosessen er en lipase. Lipasen kan være i form av hele celler, isolerte naturlige enzymer eller være immobilisert på støttematerialer. Eksempler på lipase omfatter, men er ikke begrenset til Lipase PS (fra Pseudomonas sp Lipase PS-C (fra Psuedomonas sp immobilisert på keramikk), Lipase PS-D (fra Pseudomonas sp immobilisert på kiselgur), Lipoprime 0T, Lipozyme TL IM eller Novozym 43 (fra Candida antarctica immobilisert på akrylharpiks). Prosessen kan eventuelt utføres i nærvær av ulike tilsetninger valgt fra molekylsiler eller ionebytteharpikser. Særlig foretrukket er ionebytteharpikser. Eksempler på disse harpiksene er Amberlite R eller Amberlyst R svakt basiske harpikser, slik som Amberlite IRA-9, Amberlite IRA-94 og Amberlyst A-21, selv om det ser ut til at enhver svakt basisk harpiks vil være akseptabel. Produktet fra prosessen kan isoleres ved anvendelse av fremgangsmåter kjent for fagmannen, f.eks. ekstrahering, filtrering eller krystallisering. Produkt 1 kan om nødvendig renses ved anvendelse av fremgangsmåter kjent for fagmannen, f.eks. ekstrahering, kromatografi, destillasjon eller krystallisering. En annet beskrevet prosess involverer reaksjonen til alkohol 2: med et syreanhydrid med formel : 2 i nærværet av en lipase og i nærværet eller fraværet av et organisk løsemiddel for å danne den ønskede esteren 1 hvori substituenten R av alkoholen 2 og R 1 av syreanhydrid er som definert over og substituent R 6 av syreanhydridet er valgt fra substituert og usubstituert, forgrenet og rettkjedet mettet C 1 -C 22 -alkyl, substituert og usubstituert, forgrenet og rettkjedet C 2 -C 22 -alkenyl, substituert og usubstituert, forgrenet og rettkjedet C 4 -C 22 -dienyl, substituert og usubstituert, forgrenet og rettkjedet C 6 -C 22 -trienyl og substituert og usubstituert, forgrenet og

8 8 rettkjedet C 8 -C 22 -tetraenyl eller blandinger derav. Foretrukkede syreanhydrider innbefatter de hvori R 1 og R 6 er identiske. Prosessen kan utføres uten ytterligere løsemiddel eller alternativt i et inert løsemiddel valgt fra sykliske eller asykliske eterløsemidler slik som dietyleter, diisopropyleter, tert-butylmetyleter eller tetrahydrofuran, aromatiske hydrokarboner slik som benzen, toluen eller xylen, alifatiske eller alisykliske mettede eller umettede hydrokarboner slik som heksan, heptan, sykloheksan eller limonen, halogenerte hydrokarboner slik som diklormetan, dikloretan, dibrometan, tetrakloretylen eller klorbenzen, polære aprotiske løsemidler slik som acetonitril eller dimetylformamid eller blandinger derav. De foretrukne løsemidlene er toluen og acetonitril. Prosessen kan utføres ved en temperatur mellom ca. 0 C og løsemidlets kokepunkt, fortrinnsvis ca C, mest foretrukket 60 C. Mengden av syreanhydrid kan være mellom 0,8 og ekvivalenter, basert på 2 og er fortrinnsvis mellom 1 og ekvivalenter. Enzymet anvendt i prosessen er en lipase. Lipasen kan være i form av hele celler, isolerte naturlige enzymer eller være immobilisert på støttemateriale. Eksempler på lipase omfatter, men er ikke begrenset til Lipase PS (fra Pseudomonas sp) Lipase PS-C (fra Psuedomonas sp immobilisert på keramikk), Lipase PS-D (fra Pseudomonas sp immobilisert på kiselgur), Lipoprime 0T, Lipozyme TL IM eller Novozym 43 (fra Candida antarctica immobilisert på akrylharpiks). 2 Produktet fra prosessen kan isoleres ved anvendelse av fremgangsmåter kjent for fagmannen, f.eks. ekstrahering, filtrering eller krystallisering. Produkt 1 kan om nødvendig renses ved anvendelse av fremgangsmåter kjent for fagmannen, f.eks. ekstrahering, kromatografi, destillasjon eller krystallisering. 3 De tidlige trinnene av melaninbiosyntese fra tyrosin i pattedyrhud katalyseres av enzymet tyrosinase. Forbindelser som inhiberer tyrosinase er effektive for å redusere hudpigmentering. En forbindelses evne til å redusere pigmentering kan forutsies svært effektivt ved måle tyrosinaseinhiberende aktivitet i et in vitroassay. En renset tyrosinase (vanligvis fra sopp) inkuberes i nærvær av et tyrosinasesubstrat (L-DOPA) og varierende konsentrasjoner av forbindelsen som skal testes. Testforbindelsens konsentrasjonsavhengige aktivitet måles som graden av inhibering av tyrosinase-katalysert oksidasjon av L-DOPA, en kolorimetrisk reaksjon. Andre fremgangsmåter for testing av aktiviteten til en hudlysnende

9 9 forbindelse innbefatter: Eksponering av dyrket primær eller udødeliggjort melanocytt-cellekultur (ofte murin- eller human-avledet) for forbindelsene og måling av melaninproduksjon, eksponering av en rekonstruert hudmodell inneholdende samdyrkede melanocytter, keratinocytter og/eller fibroblaster eller anvendelse av forbindelsen på huden til et pattedyr under overvåkning av endring av overflatefarge eller reflektans over tid (f.eks. Virador et al. Analytical Biochemistry 1999, 270, 7; Boissy et al. Experimental Dematology 0, 14, 601). Tyrosinaseinhiberings-assayet er en allment akseptert metode for å måle en testforbindelses potensielt hudlysnende aktivitet (f.eks. Um et all. Bioorganic & Medicinial Chemistry 03, 11, 34). Esterne ifølge denne oppfinnelsen viser potent evne til å inhibere enzymet tyrosinase. 2 Typiske hudlysnende sammensetninger for anvendelse i den kosmetiske fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen inneholder minst 0,0001 vektprosent av de beskrevne esterne. For eksempel kan forbindelsene inneholde fra ca 0,0001 vektprosent til rundt,0 vektprosent eller fra ca 0,0001 vektprosent til rundt 2,0 vektprosent av de beskrevne esterne. Lavere konsentrasjoner kan benyttes for mindre uttalt hyperpigmenteringsbetingelser og i solkremer og solblokkere som anvendes etter behandling for lysning av huden, og høyere konsentrasjoner kan anvendes med mer akutte pigmenteringsbetingelser. Foreslåtte verdiområder avhenger også eventuelle supplerende ingredienser anvendt i forbindelsene og brukerens hudfarge og hudtype samt hyperpigmenteringsproblemets omfang eller alvorlighetsgrad. Hudlysningsforbindelsene kan også inneholde andre hudlysningsingredienser i tillegg til estere. Slike andre ingredienser er kjent for fagmannen. 3 Vanligvis utføres lokal påføring på hudområder i tilknytning til et bærestoff. Hvis det anvendes bærestoff, er det inert i den forstand at det ikke forårsaker noen deaktivering eller oksidasjon av aktiv(e) eller supplerende ingrediens(er), og i den forstand at det ikke forårsaker noen negativ effekt på hudområder som det påføres. For eksempel blir forbindelser ifølge foreliggende oppfinnelse påført i blanding med et dermatologisk akseptabelt bærestoff eller vehikkel (f.eks. som en lotion, krem, salve, såpe, stick eller lignende), for å lette lokal påføring, og i noen tilfeller tilveiebringe ytterligere gunstige virkninger som kan avstedkom-

10 mes, for eksempel ved befukting av de berørte hudområdene. Mange preparater er kjent for fagmannen, og inkluderer kremer som inneholder oljer og/eller alkoholer og bløtgjørende stoffer som olivenolje, hydrokarbonoljer og vokser, silikonoljer, andre vegetabilske, animalske eller marine fettstoffer eller oljer, glyseridderivater, fettsyrer eller fettsyreestere eller alkoholer eller alkoholetere, lecitin, lanolin og derivater, flerverdige alkoholer eller estere, voksestere, steroler, fosfolipider og lignende, og generelt også emulgatorer (ikke-ioniske, kationiske eller anioniske), selv om noen av de bløtgjørende stoffene i seg selv har emulgerende egenskaper. De samme generelle ingrediensene kan formuleres i en krem snarere enn en lotion eller i geler eller til solide sticks ved anvendelse av forskjellige andeler av ingrediensene og/eller ved inkludering av fortykningsmidler som gummier eller hydrofile kolloider. REFERANSEEKSEMPLER De beskrevne prosessene er nærmere illustrert ved følgende referanseek- sempler. Referanseeksempel 1 Fremstilling av -hydroksy-4h-pyran-4-on-2-metylacetat (1a) 2 2-Hydroksymetyl--hydroksy-4H-pyran-4-on (2a; 00 mg; 3,2 mmol) ble blandet til slurry i ml acetonitril. Vinylacetat (324 ul; 3,2 mmol; 1,0 ekv.) ble satt til, etterfulgt av 1 mg Novozym 43. Blandingen ble oppvarmet til 0 C i 6 h, på hvilket tidspunkt TLC-analyse indikerer betydelig omdannelse til 1a. Ytterligere 0,2 ekv. vinylacetat ble satt til, og blandingen ble oppvarmet natten over for å gi en liten restmengde 2a. Ytterligere 0,2 ekv. vinylacetat ble satt til, og blandingen ble oppvarmet ved 0 C i 12 h til 2a er fullstendig forbrukt i henhold til TLC-analyse. Blandingen ble filtrert mens den var varm for å fjerne enzymet, og filtratet ble avdrevet for å gi 0,64 g (99 %) av 1a. Denne forbindelsen var en potent inhibitor av tyrosinase (EC 0 0,0049 mm), betydelig bedre enn 2a (EC 0 0,0 mm)(scc Tabell 1).

11 11 1 H NMR (DMSO-d 6 ) δ 9,24 (br s, I H); 8,08 (s, 1H); 6,47 (s, 1H); 4,93 (s, 2H); 2. (s, 3H). Referanseeksempel 1' Fremstilling av 2-hydroksymetyl-4H-pyran-4-on--ylacetat (6a) 2-Hydroksymetyl--hydroksy-4H-pyran-4-on (2a; 1,00 g, 7,04 mmol) ble blandet til slurry i ml diklormetan. Trietylamin (1,47 ml;,6 mmol; 1, ekv.) ble satt til og eddikanhydrid (0,69 ml; 7,04 mmol; 1,0 ekv.) ble deretter tilsatt dråpevis. Den heterogene blandingen ble homogen i løpet av min og ble omrørt natten over for å gi et større punkt med mellomliggende polaritet ved analysen (etylacetat som eluent) i tillegg til et ikke-polært punkt. Reaksjonsblandingen ble konsentrert og filtrert gjennom en pute av flash-silikagel og eluert med en løsemiddelsgradient på 4:1 etylacetat:heptan til 0 % etylacetat. Et sentersnitt av det mellomliggende punktet ble innsamlet og ga 4 mg (32 %) av 6a. Denne forbindelsen var en betydelig mindre potent inhibitor av tyrosinase (EC 0 0,084 mm) enn 2a (EC 0 0,0 mm) (se tabell 1). 1 H NMR (DMSO-d 6 ) δ 8,46 (s, 1H); 6,42 (s, 1H);,77 (br s, 1H); 4,34 (br s, 2H); 2,2 (s, 3H). Referanseeksempel 2 Fremstilling av -hydroksy-4h-pyran-4-on-2-metylpropionat (1b) 2 Novozym 43 (1 mg) og tørkede 4A-molekylsiler (1g) ble satt til en 0-ml kolbe, 2-Hydroksymetyl--hydroksy-4H-pyran-4-on (2a; 00 mg; 3,2 mmol) ble satt til og vasket med ml acetonitril. Propionsyre (2 ul; 7,04 mmol; 2 ekv.) ble satt til, og blandingen ble oppvarmet til 0 C natten over, og på dette tidspunktet indikerte analysen (etylacetat som eluent) omdannelse til 1b. Reaksjonsblandingen ble filtrert, og filtratet ble konsentrert ved redusert trykk.

12 12 Råproduktet ble filtrert gjennom en pute av flash-silikagel og eluert med 4:1 etylacetat:heptan for å gi 28 mg (41 %) av 1h. Denne forbindelsen var en potent inhibitor av tyrosinase (EC 0 0,0046 mm), betydelig bedre enn 2a (EC 0 0,0 mm)(se tabell 1). 1 H NMR (DMSO-d 6 ) δ 9,2 (br s, 1H); 8,09 (s, 1H); 6,46 (s, 1H); 4,9 (s, 2H); 2,42 (q, 2H, J = 7,42 Hz); 1,04 (t, 3H, J = 7,42 Hz). Referanseeksempel 3 Fremstilling av -hydroksy-4h-pyran-4-on-2-metylpropionat (1b) ved enzymatisk esterifisering ved anvendelse av propionanhydrid 2-Hydroksymetyl--hydroksy-4H-pyran-4-on (2a; 00 mg; 3,2 mmol) ble blandet til slurry i ml acetonitril og propionanhydrid (0,4 ml; 4,2 mmol; 1,2 ekv.) ble satt til. Novozym 43 (1 mg) ble satt til, og blandingen ble omrørt ved omgivelsestemperatur i, h til 2a var nesten fullstendig omdannet til 1b i henhold til HPLC og TLC-analyse (etylacetat som eluent). Reaksjonsblandingen ble filtrert, og filtratet ble konsentrert ved redusert trykk. Råproduktet ble løst i etylacetat og fortynnet med heptan for å gi et presipitat som ble innsamlet, vasket med heptan og tørket. Dette filtratet ble konsentrert til tørrhet, og det resulterende faste stoffet ble trituert med heptan, filtrert, vasket med heptan og tørket. De kombinerte faste stoffene (76 mg; 83 %) ble analysert som rent 1b ved 1 H NMR. Referanseeksempel 2' 2 Fremstilling av 2-hydroksymetyl-4H-pyran-4-on--yl-propionat (6b) 2-Hydroksymetyl--hydroksy-4H-pyran-4-on (2a; 82 mg; 6,00 mmol) ble blandet til slurry i ml diklormetan. Trietylamin (1,2 ml; 9,0 mmol; 1, ekv.) ble satt til og deretter ble propionanhydrid (0,77 ml; 6,0 mmol; 1,0 ekv.) satt til dråpevis ved omgivelsestemperatur. Reaksjonsblandingene ble homogene i løpet

13 13 av ett minutt og ble omrørt natten over for å gi et større punkt ved TLC (etylacetat som eluent). De flyktige stoffene ble avdrevet og residuet ble fortynnet med etylacetat og vasket med 1 M HCl ( ml) og mettet natriumbikarbonat ( ml). Den organiske løsningen ble tørket med magnesiumsulfat og konsentrert for å gi 0,92 g råprodukt. Analyse av råproduktet ved 1 H NMR indikerte en liten mengde av 2a, en liten mengde av dipropionatet av 2a (7b) og et 90:-forhold av 6b til 1b. Blandingen ble filtrert gjennom en pute av flash-silikagel og eluert med 1:1 etylacetat:heptan til 4:1 etylacetat:heptan for å gi 476 mg (40 %) av 6b. Denne forbindelsen ble en betydelig mindre potent inhibitor av tyrosinase (EC 0 0, mm) enn 2a (EC 0 0,0 mm)(se tabell 1). 1 H NMR (DMSO-d 6 ) δ 8,46 (s, 1H); 6,42 (t, 1H, J = 0,82 Hz);,76 (t, 1H, J = 6,0 Hz); 4,34 (dd, 2H; J = 0,82, 6,0 Hz); 2,8 (q, 2H, J = 7,42 Hz); 1,11 (t, 3H, J = 7,42 Hz). Referanseeksempel 3' Fremstilling av 2-propionyloksymetyl-4H-pyran-4-on--yl-propionat (7b) 2 2-Hydroksymetyl--hydroksy-4H-pyran-4-on (2a; 82 mg; 6,00 mmol) ble blandet til slurry i ml diklormetan. Trietylamin (2,1 ml; 18,0 mmol; 3 ekv.) ble satt til og deretter ble propionanhydrid (1,69 ml; 13,2 mmol; 2,2 ekv.) satt til dråpevis ved omgivelsestemperatur. Reaksjonsblandingen ble homogen i løpet av ett minutt og ble omrørt natten over for å gi et større punkt ved TLC (etylacetat som eluent). De flyktige stoffene ble avdrevet og residuet ble fortynnet med etylacetat og vasket med I M HCl ( ml) og mettet natriumbikarbonat ( ml). Den organiske løsningen ble tørket med magnesiumsulfat og konsentrert for å gi 2, g råprodukt, som ble filtrert gjennom en pute av flash-silikagel og eluert med 1:1 metylacetat:heptan for å gi 1,39 g (97 %) av 7b. Denne forbindelsen ble en betydelig mindre potent inhibitor av tyrosinase (EC 0 0,097 mm) enn 2a (EC 0 0,0 mm)(se tabell 1). 1 H NMR (DMSO-d 6 ) δ 8,2 (s, 1H); 6,9 (s, 1H);,01 (s, 1H); 2,9 (q, 2H; J = 7,42 Hz); 2,44 (q, 2H, J = 7,42 Hz); 1,11 (t, 3H, J = 7,42 Hz); 1,0 (t, 3H, J = 7,42 Hz).

14 14 Referanseeksempel 4 Fremstilling av -hydroksy-4h-pyran-4-on-2-metylheksanoat (1c) ved enzymatisk esterifisering ved anvendelse av heksanoisk anhydrid 2-Hydroksymetyl--hydroksy-4H-pyran-4-on (2a; 00 mg; 3,2 mmol) ble blandet til slurry i ml acetonitril og heksanoisk anhydrid (0,81 ml; 3,2 mmol; 1,0 ekv.) ble satt til. Novozym 43 (1 mg) ble satt til, og blandingen ble omrørt ved omgivelsestemperatur natten over for å gi 8 % omdannelse av 2a til 1c i henhold til HPLC-analyse. Ytterligere heksanoisk anhydrid (0,12 ml; 0,3 mmol; 0, ekv.) ble satt til, og blandingen ble omrørt natten over for å gi 98 % omdannelse av 2a til 1c. Reaksjonsblandingen ble filtrert, og filtratet ble konsentrert ved redusert trykk ved omgivelsestemperatur. Residuet ble løst i etylacetat og vasket med vann ( ml) og mettet vandig natriumbikarbonatløsning (3 x ml). Den organiske løsningen ble tørket med magnesiumsulfat og konsentrert for å gi 1c (761 mg; 90 %) som et offwhite fast stoff. Denne forbindelsen ble en svært potent inhibitor av tyrosinase (EC 0 0,00098 mm), betydelig bedre enn 2a (EC 0 0,0 mm)(se tabell 1). 1 H NMR (DMSO-d 6 ) δ 9,2 (br s, 1H); 8,08 (s, 1H); 6,4 (s, 1H); 4,9 (s, 2H); 2,39 (t, 2H, J = 7,42 Hz); 1,9-1,49 (m, 2H); 1,31-1, (m, 4H); 0,8 (m, 3H). Referanseeksempel Fremstilling av -hydroksy-4h-pyran-4-on-2-metyloktanoat (Id) 2 Novozym 43 (00 mg; 0 vektprosent) og tørkede 4A-molekylsiler (2 g; 2 vekt-ekv.) ble tilsatt i en kolbe. 2-Hydroksymetyl--hydroksy-4H-pyran-4-on (2a; 1,00 g; 7,04 mmol) ble satt til og vasket med ml acetonitril. Oktanoisk syre (2,23 ml; 14,07 mmol; 2 ekv.) ble satt til, og blandingen ble oppvarmet til 0 C natten over, på hvilket tidspunkt analysen (etylacetat som eluent) indikerte omdannelse til 1d. Reaksjonsblandingen ble filtrert, og filtratet ble konsentrert ved redusert trykk. Råproduktet ble løst i etylacetat og vasket med vann

15 ( ml), mettet natriumbikarbonat (2 x ml), tørket med magnesiumsulfat og konsentrert for å gi 1,81 g av en fargeløs olje. Denne oljen ble løst i heptan og konsentrert for å gi et voksaktig fast stoff. Det faste stoffet ble trituert med heptan, filtrert, vasket med heptan og tørket for å gi 0,79 g (42 %) av 1d. Denne forbindelsen ble en svært potent inhibitor av tyrosinase (EC 0 0,00039 mm), betydelig bedre enn 2a (EC 0 0,0 mm)(se tabell 1). 1 H NMR (DMSO-d 6 ) δ 9,24 (br s, 1H); 8,07 (s, 1H); 6,4 (s, 1H); 4,9 (s, 2H); 2,390 (t, 2H, J = 7, Hz); 1,3 (m, 2H); 1,24 (m, 8H); 0,8 (m, 3H). Referanseeksempel 6 Fremstilling av -hydroksy-4h-pyran-4-on-2-metyloktanoat (1d) ved enzymatisk esterifisering ved anvendelse av oktanoisk anhydrid 2 2-Hydroksymetyl--hydroksy-4H-pyran-4-on (2a; 1,04 g; 7,32 mmol) ble blandet til slurry i ml acetonitril og oktanoisk anhydrid (2,90 g; 8,0 mmol; 1,1 ekv.) ble satt til. Novozym 43 (0,33g) ble satt til, og blandingen ble omrørt ved omgivelsestemperatur i 12 h til 2a var fullstendig forbrukt i henhold til IIPLCanalyse. Reaksjonsblandingen ble filtrert, og filtratet ble konsentrert ved redusert trykk ved omgivelsestemperatur. Residuet ble løst i heptan og vasket med en 1:1:1-blanding av vann:mettet vandig natriumbikarbonat:metanol (3 x ml). Den organiske løsningen ble tørket med magnesiumsulfat og konsentrert og filtrert gjennom en pute av flash-silikagel og eluert med 2:1 etylacetat:heptan for å gi 1,91 g av en blanding av 1d og oktanoisk syre. Materialet ble rekrystallisert fra et minimumsvolum av varm heptan ved avkjøling til omgivelsestemperatur for å gi 1,38 g (70 %) av 1d. Referanseeksempel 4' Fremstilling av 2-hydroksymetyl-4H-pyran-4-on--yl oktanoat (6d)

16 16 2-Klor-1-metylpyridiniumjodid (1,84 g; 7,19 mmol; 1,2 ekv.) og oktanoisk syre (0,9 ml; 6,00 mmol; 1,0 ekv.) ble laget til slurry i ml diklormetan. Trietylamin (2,01 ml; 14,39 mmol; 2,4 ekv.) ble satt til, og blandingen ble omrørt ved omgivelsestemperatur i min. 2-Hydroksymetyl--hydroksy-4H-pyran-4-on (2a; 82 mg; 6,00 mmol) ble satt til og vasket med ml diklormetan. Blandingen ble avfarget fra en gul til en brun slurry i løpet av ca. min. Reaksjonsblandingen ble omrørt natten over ved omgivelsestemperatur for å gi et større og et mindre punkt ved TLC (3:2 etylacetat:heptan). Denne blandingen ble filtrert og presipitatet ble vasket med diklormetan. Det kombinerte filtratet ble konsentrert, og residuet ble filtrert gjennom en pute av flash-silikagel og eluert med en løsemiddelsgradient of 3:2 til 4:1 etylacetat:heptan for å gi 864 mg (4 %) av 6d. Denne forbindelsen ble en betydelig mindre potent inhibitor av tyrosinase (EC 0 0,18 mm) enn 2a (EC 0 0,0 mm)(se tabell 1). 1 H NMR (DMSO-d 6 ) δ 8,4 (s, 1H); 6,42 (s, 1H);,76 (t, 1H, J - 6,0 Hz); 4,34 (d, 2H, J -,0 Hz); 2,4 (t, 2H, J = 7, Hz); 1,6-1, (m, 2H); 1,38-1,2 (m, 8H); 0,86 (t, 3H, J = 6,60 Hz). Referanseeksempel ' Fremstilling av 2-oktanoyloksymetyl-4H-pyran-4-on--yl-oktanoat (7d) 2 2-Klor-1-metylpyridiniumjodid (2,16 g; 8,44 mmol; 2,4 ekv.) og oktanoisk syre (1,28 ml; 8,44 mmol; 2,4 ekv.) ble laget til slurry i ml diklormetan. Trietylamin (2,3 ml; 16,9 mmol; 4,8 ekv.) ble satt til, og blandingen ble omrørt ved omgivelsestemperatur i min. 2-Hydroksymetyl--hydroksy-4H-pyran-4-on (2a; 00 mg; 3,2 mmol) ble satt til og vasket med ml diklormetan. Blandingen ble først en nesten homogen gul løsning og gikk deretter over til en brun slurry i løpet av ca. min. Reaksjonsblandingen ble omrørt natten over ved omgivelsestemperatur for å gi et enkelt punkt ved TLC (3:2 etylacetat:heptan). Denne blandingen ble filtrert og presipitatet ble vasket med diklormetan. Det kombinerte filtratet ble konsentrert, og residuet ble filtrert gjennom en pute av flash-silikagel og eluert med 2:1 etylacetat:heptan for å gi 1,07 g (83 %) av 7d. Denne forbindelsen ble en dårlig inhibitor av tyrosinase (EC 0 >1,0 mm) (se tabell 1).

17 17 1 H NMR (DMSO-d 6 ) δ 8,1 (s, 1H); 6,7 (s, 1H);,00 (s, 2H); 2, (t, 2H, J = 7,42 Hz); 2,41 (t, 2H, J = 7,42 Hz); 1,62-1,49 (m, 4H); 1,-1,2 (m, 16H); 0,88-0,83 (m, 6H). Referanseeksempel 7 Fremstilling av -hydroksy-4h-pyran-4-on-2-mety/lipoat (1e) Novozym 43 (400 mg; 80 vektprosent) og tørkede 4A-molekylsiler (1 g; 2 vekt-ekv.) ble tilsatt i en kolbe. 2-Hydroksymetyl--hydroksy-4H-pyran-4-on (2a; 00 mg; 3,2 mmol) ble satt til og vasket med ml acetonitril. Lipoinsyre (1,0 g; 4,8 mmol; 1,38 ekv.) ble satt til, og blandingen ble oppvarmet til 0 C natten over, på hvilket tidspunkt TLC-analyse (etylacetat som eluent) indikerte omdannelse til 1c. Reaksjonsblandingen ble filtrert, og filtratet ble konsentrert ved redusert trykk. Råproduktet ble løst i etylacetat og vasket med mettet natriumbikarbonat (2 x ml), tørket med magnesiumsulfat og konsentrert. Råproduktet ble filtrert gjennom en pute av flash-silikagel og eluert med 4:1 etylacetat:heptan for å gi mg ( %) av 1e. Denne forbindelsen ble en svært potent inhibitor av tyrosinase (EC 0 0,00093 mm), betydelig bedre enn 2a (EC 0 0,0 mm)(se tabell 1). 1 H NMR (DMSO-d 6 ) δ 9, (br s, 1H); 8,08 (s, 1H); 6,46 (s, 1H); 4,9 (s, 2H); 3,6-3,6 (m,1ii); 3,23-3,06(m, 2H); 2,46-2,3(m, 1H); 2,21 (t, 2H, J = 7, Hz); 1,92,1,80 (m, 1H); 1,68-1,46 (m, 4H); 1,42-1,32 (m, 2H). Referanseeksempel 8 2 Fremstilling av 4-hydroksybenzylacetat (lf) 4-Hydroksybenzylalkohol (2b) (3, g; 28,2 mmol) ble blandet til slurry i ml acetonitril. Vinylacetat (3,64 ml; 39, mmol; 1,4 ekv.) ble satt til fulgt av Novozym 43 (00 mg; 14 vektprosent). Reaksjonsblandingene ble omrørt ved

18 18 omgivelsestemperatur i 6 h, på hvilket tidspunkt TLC-analyse (1:1 etylacetat:heptan som eluent) indikerte fravær av 2b og et stort enkeltstående ikkepolært punkt. Reaksjonsblandingen ble filtrert, og filtratet ble konsentrert ved redusert trykk for å gi 4,67 g (99 %) av 1f. Denne forbindelsen ble en inhibitor av tyrosinase (EC 0 0,038 mm) og ble mer potent enn 2b (EC 0 0,19 mm)(se tabell 1). 1 H NMR (DMSO-d 6 ) δ 9,6 (br s, 1H); 7,17 (m, 2H); 6,74 (m, 2H); 4,93 (s, 2H); 2,01 (s, 3H). Referanseeksempel 6' Fremstilling av 4-acetoksybenzylalkohol (6f) 4-Hydroksybenzylalkohol (2b) (00 mg; 4,03 mmol) ble blandet til slurry i ml diklormetan. Trietylamin (0,84 ml; 6,04 mmol; 1, ekv.) ble satt til og deretter ble eddikanhydrid (0,39 ml.; 4,03 mmol; 1,0 ekv.) satt til dråpevis. Den heterogene blandingen ble homogen i løpet av min og ble omrørt natten over ved omgivelsestemperatur for å gi delvis omdannelse til 6f ved TLC-analyse (1:1 etylacetat:heptan). Reaksjonsblandingen ble konsentrert, og residuet ble filtrert gjennom en pute av flash-silikagel og eluert med 3:2 heptan:etylacetat for å gi 390 mg (8 %) av 6f. Denne forbindelsen ble en mindre potent inhibitor av tyrosinase (EC 0 0,92 mm) enn 2b (EC 0 ) 0,19 mm)(se Tabell 1). 1 H NMR (DMSO-d 6 ) δ 7,34 (d, 2H, J = 7,97 Hz); 7,06 (m, 2H);,2 (t, 1H, J =,77 Hz); 4,49 (d, 2H, J =,77.Hz); 2,26 (s. 3H). Referanseeksempel 9 2 Fremstilling av 4-hydroksyhenzylpropionat (1g) 4-Hydroksybenzylalkohol (2b) ( mg; 4,27 mmol) ble løst i 14 ml acetonitril. Propionsyre (2,0 ml; 26,8 mmol; 6,3 ekv.) ble satt til og Novozym 43 (62 mg; 1,17 vekt-ekv.) og tørkede 4A-molekylsiler (900 mg; 1,7 vekt-ekv.) ble satt til.

19 19 Reaksjonsblandingen ble omrørt og oppvarmet til 0 C natten over, og på dette tidspunktet indikerte HPLC-analyse ca. % omdannelse til 1g. Reaksjonsblandingen ble filtrert og presipitatet vasket med acetonitril og toluen. Det kombinerte filtratet/vaskeløsningen ble konsentrert, og residuet ble løst i etylacetat og vasket med mettet natriumbikarbonat ( ml). Den organiske løsningen ble tørket med magnesiumsulfat, konsentrert og residuet ble filtrert gjennom en pute av flash-silikagel og eluert med 1:4 etylacetat:heptan for å gi 18 mg (24 %) av 1 g som en fargeløs olje. Denne forbindelsen var en potent inhibitor av tyrosinase (EC 0 0,017 mm), betydelig bedre enn 2b (EC 0 0,19 mm)(se tabell 1). 1 H NMR (DMSO-d 6 ) δ 9,0 (s, 1H); 7,17 (d, 2H, J = 8,2 Hz); 6,74 (d, 2H, J = 7,97 Hz); 4,94 (s, 2H); 2,31 (2H, q, J = 7,42 Hz); 1,02 (t, 3H, J = 7,42 Hz). Referanseeksempel Fremstilling av 4-hydroksybenzylpropionat (1g) ved enzymatisk esterifisering med propionanhydrid 2 4-Hydroksybenzylalkohol (2b) (,00 g; 40,3 mmol) ble løst i 0 ml acetonitril. Propionanhydrid (6, ml; 48,3 mmol; 1,2 ekv.) ble satt til fulgt av Novozym 43 (0,2g). Blandingen ble omrørt ved omgivelsestemperatur for 18 h til 2b var nesten fullstendig omdannet til 1g i henhold til IIPLC-analyse. Blandingen ble filtrert, og filtratet ble konsentrert ved redusert trykk ved omgivelsestemperatur. Residuet ble løst i etylacetat og vasket med mettet vandig natriumbikarbonat løsning (2 x 2 ml). Den organiske løsningen ble tørket med magnesiumsulfat og konsentrert, og råproduktet ble filtrert gjennom en pute av flash-silikagel for å gi 1h (,84 g; 80 %) som en fargeløs olje. Referanseeksempel 7' Fremstilling av 4-propiony/oksyhenzylalkohol (6g)

20 4-Hydroksybenzylalkohol (2h) (00 mg; 4,03 mmol) ble blandet til slurry i ml diklormetan. Trietylamin (0,84 ml; 6,04 mmol; 1, ekv.) ble satt til og deretter ble propionanhydrid (0,2 ml; 4,03 mmol; 1,0 ekv.) satt til dråpevis, og den heterogene blandingen ble homogen i løpet av ett minutt. Reaksjonsblandingen ble omrørt natten over ved rt for å gi et større og et mindre punkt i henhold til TLC-analyse (1:1 etylacetat:heptan). Blandingen ble konsentrert, og residuet ble filtrert gjennom en pute av flash-silikagel og eluert med 3:2 heptan:etylacetat for å gi 442 mg (61 %) av 6 g. Denne forbindelsen ble en mindre potent inhibitor av tyrosinase (EC 0 1,01 mm) enn 2b (EC 0 0,19 mm)(se tabell 1). 1 H NMR (DMSO-d 6 ) δ 7,34 (m, 2H); 7,06 (m, 2H);,22 (br t, 1H); 4,49 (d, 2H, J = 4,94 Hz); 2,9 (2H, q, J = 7,42 Hz); 1,13 (t, 3H, J = 7,42 Hz). Referanseeksempel 8' Fremstilling av 4-propionyloksybenzylpropionat (7g) 2 4-Hydroksybenzylalkohol (2b) (00 mg; 4,03 mmol) ble blandet til slurry i ml diklormetan. Trietylamin (1,40 ml;,1 mmol; 2, ekv.) ble satt til og deretter ble propionanhydrid (1,14 ml; 8,9 mmol; 2,2 ekv.) satt til dråpevis. Den heterogene blandingen ble homogen i løpet av min og ble omrørt natten over ved omgivelsestemperatur for å gi et enkelt ikke-polært punkt i henhold til TLCanalyse (1:1 etylacetat:heptan). Reaksjonsblandingen ble konsentrert, og residuet ble løst i etylacetat. Den organiske løsningen ble vasket med 1, M HCl ( ml) og mettet natriumbikarbonat ( ml) og tørket med magnesiumsulfat. Konsentrasjon av denne organiske løsningen ga 923 mg (97 %) av 7 g. Denne forbindelsen ble en dårlig inhibitor av tyrosinase (EC 0 > mm) (se tabell 1). 1 H NMR (DMSO-d 6 ) δ 7,40 (m, 2H); 7,12 (m, 2H);,08 (s, 2H); 2,60 (q, 2H, J = 7,42 Hz); 2,37 (q, 2H, J = 7,42 Hz); 1,13 (t, 3H, J = 7,42 Hz); 1,04 (t, 3H, J = 7,42 Hz). Referanseeksempel 11

21 21 Fremstilling av 4-hydroksybenzylheksanoat (1h) ved enzymatisk esterifisering med heksanoisk anhydrid 4-Hydroksybenzylalkohol (2b) (00 mg; 4,03 mmol) ble løst i ml acetonitril. Heksanoisk anhydrid (1,12 ml; 4,83 mmol; 1,2 ekv.) ble satt til fulgt av Novozym 43 (1 mg). Blandingen ble omrørt ved omgivelsestemperatur i 7, h til 2b var nesten fullstendig omdannet til 1h i henhold til HPLC-analyse. Blandingen ble filtrert, og filtratet ble konsentrert ved redusert trykk ved omgivelsestemperatur. Residuet ble løst i etylacetat og vasket med mettet vandig natriumbikarbonat løsning (3 x ml). Den organiske løsningen ble tørket med magnesiumsulfat og konsentrert for å gi 1h (832 mg; 93 %) som en fargeløs olje. Denne forbindelsen var en potent inhibitor av tyrosinase (EC 0 0,049 mm) og ble en bedre inhibitor enn 2b (EC 0 0,19 mm)(se tabell 1). 1 H NMR (DMSO-d 6 ) δ 9,49 (s, 1H); 7,17-7,14 (m, 2H); 6,76-6,71 (m, 2H); 4,94 (s, 2H); 2,28 (t, 2H, J = 7,42 Hz); 1,6-1,46 (m, 2H); 1,31-1,21 (m, 4H); 0,83 (m, 3H). Referanseeksempel 12 Fremstilling av 4-hydroksybenzyloktanoat (li) 2 4-Hydroksybenzylalkohol (2b) ( mg; 2,02 mmol) ble løst i ml acetonitril. Oktanoisk syre (00 ul; 3,3 mmol; 1.,63 ekv.) ble satt til, etterfulgt av Novozym 43 (0 mg; 80 vektprosent) og 4A-molekylsiler (00 mg; 2 vekt-ekv.). Blandingen ble omrørt og oppvarmet til 0 C natten over. Blandingen ble avkjølt til omgivelsestemperatur, filtrert, og presipitatet ble vasket med acetonitril. Det kombinerte filtratet ble konsentrert, og residuet ble løst i etylacetat og vasket med mettet natriumbikarbonat (2 x ml). Den organiske løsningen ble tørket (magnesiumsulfat) og konsentrert, og råproduktet ble filtrert gjennom en pute av flash-silikagel og eluert med 1:4 etylacetat:heptan for å gi 960 mg 1i som inneholdt noen rester av oktanoisk syre. 1 H NMR (DMSO-d 6 ) δ 9,48 (br s, 1H); 7,18-7,13 (m, 2H); 6,7-6,71 (m, 2H);

22 22 4,94 (s, 2H); 2,28 (t, 2H, J = 7,42 Hz); 1,1 (m, 2H); 1,22 (m, 8H); 0,84 (m, 3H). Referanseeksempel 13 Fremstilling av 4-hydroksybenzyloktanoat (li) ved transesterifisering 4-Hydroksybenzylacetat (1f) (83 mg; 0,0 mmol) ble løst i 1, ml toluen. Oktanoisk syre (8 ul; 1,0 mmol; 2,0 ekv.) ble satt til, fulgt av Novozym 43 (60 mg). Blandingen ble omrørt ved omgivelsestemperatur natten over, og på dette tidspunktet indikerte HPLC-analyse 8,1 % omdannelse til 1i (40,4 % 1f og 1,4 % 4-hydroksybenzylalkohol ble også observert). Referanseeksempel 14 Fremstilling av 4-hydroksybenzyloktanoat (li) ved transesterifisering i nærværet av Amberlyst A-21 4-Hydroksybenzylacetat (1f) (83 mg; 0,0 mmol) og tørket Amberlyst A-21 (83 mg; 1 vekt-ekv.) ble kombinert i 1, ml toluen. Oktanoisk syre (8 ul; 1,0 mmol; 2,0 ekv.) ble satt til fulgt av Novozym 43 (60 mg). Blandingen ble omrørt ved omgivelsestemperatur natten over, og på dette tidspunktet indikerte HPLC-analyse 88,2 % omdannelse til 1i (11,1 % 1f og 0,8 % 4-hydroksybenzyl alkohol ble også observert). Referanseeksempel 2 Fremstilling av 4-hydroksybenzyllipoat (lj)

23 23 4-Hydroksybenzylalkohol (2b) ( mg; 4,19 mmol; 1,24 ekv.) ble løst i ml acetonitril. Lipoinsyre (0,70 g; 3,39 mmol) ble satt til, fulgt av Novozym 43 (0 mg) og 4A molekylsiler (1g). Blandingen ble omrørt ved omgivelsestemperatur natten over. Blandingen ble avkjølt til omgivelsestemperatur, filtrert, og presipitatet ble vasket med acetonitril. Det kombinerte filtratet ble konsentrert, og residuet ble løst i etylacetat og vasket med mettet natriumbikarbonat (2 x ml). Den organiske løsningen ble tørket (MgSO 4 ) og konsentrert, og råproduktet ble filtrert gjennom en pute av flash-silikagel og eluert med 1:4 etylacetat:heptan for å gi 184 mg (16 %) av 1j. 1 H NMR (DMSO-d 6 ) δ 9,0 (s, 1H); 7,18,7,14 (m, 2H); 6,7-6,70 (m, 2H); 4,94 (s, 2H); 3,62-3,2 (m, 1H); 3,27-3,06 (m, 2H); 2,43-2,3 (m, 1H); 2,31 (t, 2H, J = 7, Hz); 1,89-1,78 (m, 1H); 1,68-1,46 (m, 4H); 1,39-1,23 (m, 2H). Referanseeksempel 16 Fremstilling av 2-acyloksymetyl--hydroksy-4H-pyran-4-on fra blandet fettsyreester uten løsemiddel (Ik) Novozym 43 (0 mg) og 2-hydroksymetyl--hydroksy-4H-pyran-4-on (2a; 0 mg; 0,7770 mmol) ble tilsatt i et hetteglass, og 2 ml blandede etylestere fra pasjonsfruktolje ble satt til. Blandingen ble oppvarmet til 60 C natten over, på hvilket tidspunkt TLC-analyse (etylacetat som eluent) indikerte betydelig omdannelse til 1k. 2 Tyrosinase er ansvarlig for katalyseringen av de to første trinnene i den biosyntetiske veien som fører fra tyrosin til melanin. Det hydroksylerer tyrosin til dihydroksyfenylalanin (L-DOPA) og oksiderer deretter L-DOPA til dopakinon. Vår fremgangsmåte for å bestemme tyrosinaseinhiberingsaktiviteten av ulike forbindelser fokuserer på L-DOPAs oksidasjonstrinn til dopakinon ved det spektrofotometrisk utseendet av dopakinon ved 47 nm. Enzymassayet var i store trekk grad basert på metoden beskrevet i Zhang, JT., Chen, QX., Song, KK., & Xic, JJ. Food Chemistry 06, 9, Forbindelsene av interesse vurderes med hensyn til løselighet i vandig miljø og

24 24 til passende fortynninger fremstilt i enten vann eller dimetylsulfoksid. Et bredt spekter av fortynninger fremstilles fra stamløsninger, vanligvis for å måle endelige inhiberingskonsentrasjoner fra nm til mm. Assayblandingen består av 0mM Na 2 HPO 4 /NaH 2 PO 4 ph 7,0 og 0,mM L-DOPA. Den enzymatiske reaksjonen settes i gang ved å tilsette 18 enheter sopptyrosinase (Sigma T3824). En første baseline-rate av tyrosinaseaktivitet måles ved 47nm ved bruk av et Deckman Coulter DU 800 UV/Vis spektrofotometer i 1 ml reaksjonsformat ved C, deretter tilsettes/innblandes en 2ul alikvot av inhiberingsløsningen, og endringen i rate noteres. Endringen i rate er knyttet til en prosentvis inhibering av tyrosinase som skyldes tilstedeværelsen av inhibitoren. Inhiberende effekter av eventuell tilstedeværende DMSO minimeres ved å begrense den endelige konsentrasjonen til 2, % ved hensyntaken til eventuell bakgrunnsinhibering med DMSO-blindprøver for hvert assay. Graden av tyrosinaseinhibering ble målt ut fra konsentrasjonen av inhibitor som er nødvendig for å inhibere tyrosinase med 0 %, EC 0 -verdien. Dette ble bestemt med sigmoidale dose-responskurver generert igraphpad Prizm versjon 4 ved å plotte loggen av inhibitorkonsentrasjon mot rateresponsen (% inhibering). Dataene for de ulike eksemplene er presentert i tabell 1 nedenfor. Tabell 1: Tyrosinaseinhiberingsverdier Forbindelse EC 0 (millimolar) Forbindelse EC 0 (millimolar) 2a 0,0 2b 0,19 1a 0,0049 1f 0,038 6a 0,084 6f 0,92 1b 0,0046 1g 0,017 6b 0, 6g 1,01 7b 0,097 7g > 1c 0, h 0,049 1d 0, d 0,18

25 2 Forbindelse EC 0 (millimolar) Forbindelse EC 0 (millimolar) 7d >1,0 1e 0,00093

26 26 P a t e n t k r a v 1. Kosmetisk fremgangsmåte for lysning av hud, omfattende påføringen på et hudområde en sammensetning omfattende en esterforbindelse representert ved formel 1: og et kosmetisk akseptabelt bærestoff hvori R er valgt fra gruppen bestående av substituert eller usubstituert C 6 -C 22 karbosyklisk hydroksyaryl og R 1 er valgt fra gruppen bestående av C 1 -C 22 -alkyl, C 2 -C 22 -alkenyl, C 4 -C 22 - dienyl, C 6 -C 22 -trienyl, C 8 -C 22 -tetraenyl og blandinger derav.