(12) Oversettelse av europeisk patentskrift

Transkript

1 (12) Oversettelse av europeisk patentskrift (11) NO/EP B1 (19) NO NORGE (1) Int Cl. C07K 16/28 (06.01) A61K 39/39 (06.01) A61K 47/48 (06.01) A61P 3/00 (06.01) C07K 16/ (06.01) Patentstyret (21) Oversettelse publisert (80) Dato for Den Europeiske Patentmyndighets publisering av det meddelte patentet (86) Europeisk søknadsnr (86) Europeisk innleveringsdag (87) Den europeiske søknadens Publiseringsdato..27 () Prioritet , US, 166 P , US, P , US, 8790 P (84) Utpekte stater AT BE BG CH CY CZ DE DK EE ES FI FR GB GR HR HU IE IS IT LI LT LU LV MC MT NL NO PL PT RO SE SI SK TR (73) Innehaver Biotest AG, Landsteinerstr., 633 Dreieich, DE-Tyskland Immunogen, Inc., 8 Winter Street, Waltham, MA , US-USA (72) Oppfinner KRAUS, Elmar, Bahnhofstrasse 1 A, Bad Vilbel, DE-Tyskland BRUECHER, Christoph, Unter den Tannen 3a, 6760 Eschborn, DE-Tyskland DAELKEN, Benjamin, Eleonore-Sterling-Strasse 40, Frankfurt am Main, DE- Tyskland ZENG, Steffen, Albert-Einstein-Strasse 13, Münster, DE-Tyskland OSTERROTH, Frank, Konrad-Adenauer-Allee 22, Dietzenbach, DE-Tyskland UHEREK, Christoph, Lachenwoerthsweg 6, 60 Seligenstadt, DE-Tyskland AIGNER, Silke, An der kurzen Gewanne 24, Frankenthal, DE-Tyskland GERMER, Matthias, Theodor-Heuss-Strasse 1, 6322 Langen, DE-Tyskland SCHULZ, Gregor, Rosenstrasse 13, Umkirch, DE-Tyskland HAEDER, Thomas, Staffordstrasse 39a, 633 Dreieich, DE-Tyskland (74) Fullmektig Zacco Norway AS, Postboks 03 Vika, 012 OSLO, Norge (4) Benevnelse IMMUNKONJUGATER SOM MÅLRETTER CD138 OG ANVENDELSER DERAV (6) Anførte publikasjoner WO-A-04/ WO-A-06/09987 WO-A-07/0669 WO-A-07/ US-A US-A TASSONE PIERFRANCESCO ET AL: "Cytotoxic activity of the maytansinoid immunoconjugate B-B4-DM1 against CD138+ multiple myeloma cells." BLOOD 1 DEC 04, vol. 4, no. 12, 1 December 04 ( ), pages , XP ISSN: SHARKEY ROBERT M ET AL: "Targeted therapy of cancer: new prospects for antibodies and immunoconjugates." CA: A CANCER JOURNAL FOR CLINICIANS 06 JUL-AUG, vol. 6, no. 4, July 06 (06-07), pages , XP ISSN: TURNER J HARVEY ET AL: "131I-Anti CD radioimmunotherapy of relapsed or refractory non-

2 Hodgkins lymphoma: a phase II clinical trial of a nonmyeloablative dose regimen of chimeric rituximab radiolabeled in a hospital." CANCER BIOTHERAPY & RADIOPHARMACEUTICALS AUG 03, vol. 18, no. 4, August 03 (03-08), pages 13-24, XP ISSN: ISRAEL L ET AL: "Plasmapheresis and immunological control of cancer." LANCET 18 SEP 1976, vol. 2, no. 7986, 18 September 1976 ( ), pages , XP ISSN: CORTESINI RAFFAELLO: "Pancreas cancer and the role of soluble immunoglobulin-like transcript 3 (ILT3)." JOP : JOURNAL OF THE PANCREAS 07, vol. 8, no. 6, 1 November 07 ( ), pages , XP ISSN: ROGUSKA M A ET AL: "HUMANIZATION OF MURINE MONOCLONAL ANTIBODIES THROUGH VARIABLE DOMAIN RESURFACING", FASEB JOURNAL, FED. OF AMERICAN SOC. FOR EXPERIMENTAL BIOLOGY, US, vol. 91, 1 February 1994 ( ), pages , XP , ISSN:

3 1 IMMUNKONJUGATER SOM MÅLRETTER CD138 OG ANVENDELSER DERAV OPPFINNELSENS OMRÅDE Den foreliggende oppfinnelsen vedrører immunkonjugater som kan målrette CD138-uttrykkende celler, sammensetninger omfattende immunkonjugatene og fremgangsmåter som benytter dem. BAKGRUNN 1 CD138, som virker som en reseptor for den ekstracellulære matriksen, blir overuttrykt på multippelt myelom-celler (MM-celler) og er vist å påvirke utviklingen og/eller proliferasjonen av MM-celler. CD138 blir også uttrykt på celler i eggstokkarsinom, nyrekarsinom, galleblærekarsinom, brystkarsinom, prostatakreft, lungekreft, kolonkarsinomceller og celler i Hodgkins og ikke- Hodgkins lymfom, kronisk lymfatisk leukemi (CLL) for å nevne bare noen få. Tassone et al. (04) har rapportert utmerket binding av det murine IgG1- antistoffet B-B4 til CD138-antigen som blir uttrykt på overflaten av MM-celler. Tassone rapporterte også høy cytotoksisk aktivitet av immunkonjugatet B-B4- DM1, som omfatter mytansinoidet DM1 som et effektormolekyl, mot flere myelomceller (se også US-patentsøknad ). 2 Mens Tassone et al. har bidratt til å tilveiebringe en virkningsfull behandling av MM og en sammensetning av materie som kan benyttes i en slik behandling, finnes det fortsatt en rekke behov i teknikken. 3 Det er fremdeles behov for immunkonjugater basert på B-B4 som er fri for visse egenskaper og/eller funksjoner som er assosiert med B-B4. Det er spesielt behov for et kimerisert antistoff basert på B-B4 som binder CD138 like virkningsfullt som B-B4, men som kan administreres til mennesker uten vesentlige bivirkninger. Det er også behov for et slikt B-B4-basert immunkonjugat som viser én eller flere fordelaktige egenskaper i forhold til dets murine motstykke. De egenskapene inkluderer forbedret antigenbinding, forbedret dreping av tumorceller særlig omfattende CD138-uttrykkende tumorceller, og celler som medvirker til dette, eller mer homogen binding av målet.

4 KORT BESKRIVELSE AV OPPFINNELSEN 2 Den foreliggende oppfinnelsen vedrører et immunkonjugat som kan målrette CD138-uttrykkende celler omfattende: (a) et konstruert målrettende antistoff mot CD138 omfattende: (i) en immunglobulin-tungkjede omfattende en variabel region omfattende aminosyrerestene 31 til 3 (CDR1), 1 til 68 (CDR2) og 99 til 111 (CDR3) av SEQ ID NO: 1, og (ii) en lettkjede omfattende en variabel region omfattende aminosyrerestene 24 til 34 (CDR1), 0 til 6 (CDR2) og 89 til 97 (CDR3) av SEQ ID NO: 2; og (b) et effektormolekyl for å indusere celledød, hvori en konstant region av immunglobulin-tungkjeden er en konstant region av IgG4-isotype. 1 Den foreliggende oppfinnelsen tilveiebringer også et immunkonjugat ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 7 for anvendelse i behandlingen av multippelt myelom hos et individ. I tillegg tilveiebringer den foreliggende oppfinnelsen et immunkonjugat ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 7 for anvendelse i behandlingen av overgangscelle-blærekarsinomer hos et individ. 2 Den foreliggende oppfinnelsen tilveiebringer videre et immunkonjugat ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 7 for anvendelse som et medikament. Enda videre tilveiebringer den foreliggende oppfinnelsen et immunkonjugat ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 7 for anvendelse i inhiberingen, forsinkelsen og/eller forebyggingen av veksten av en tumor omfattende CD138-tumorceller og/eller spredning av tumorceller av en slik tumor hos en pasient. Den foreliggende oppfinnelsen tilveiebringer videre et immunkonjugat ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 7, for å inhibere, forsinke og/eller forebygge veksten av en tumor og/eller spredning av maligne tumorceller omfattende CD138-uttrykkende celler hos en pasient, hvori pasienten er behandlet med ett

5 3 eller flere cytotoksiske middel og/eller stråling i en mengde for å redusere tumormengde. Den foreliggende oppfinnelsen tilveiebringer også et immunkonjugat ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 7 for anvendelse i behandlingen av et individ med en tilstand som ville dra fordel av suppresjonen av myelomcelleoverlevelse, hvori immunkonjugatet selektivt kan redusere overlevelse eller vekst av myelomcellene hos individet Den foreliggende oppfinnelsen tilveiebringer i tillegg en farmasøytisk sammensetning omfattende immunkonjugatet ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 7 og én eller flere farmasøytisk akseptable eksipienter, hvori sammensetningen er egnet til inhibering, forsinkelse og/eller forebygging av veksten av tumorer og/eller spredning av tumorceller. Den foreliggende oppfinnelsen tilveiebringer ytterligere et kit omfattende, i separate beholdere, farmasøytiske sammensetninger for anvendelse i kombinasjon for å inhibere, forsinke og/eller forebygge veksten av tumorer og/eller spredning av tumorceller, hvori én beholder omfatter en virkningsfull mengde av den farmasøytiske sammensetningen ifølge krav 16, og hvori en separat beholder omfatter en andre farmasøytisk sammensetning omfattende en virkningsfull mengde av et ytterligere middel, foretrukket et cytotoksisk middel, for inhibering, forsinkelse og/eller forebygging av veksten av tumorer og/eller spredning av tumorceller, og én eller flere farmasøytisk akseptabel eksipienter, foretrukket hvori middelet i den andre farmasøytiske sammensetningen er valgt fra gruppen bestående av mefalan, vinkristin, doksorubicin, deksametason, syklofosfamid, etoposid, cytarabin, cisplatin, talidomid, prednison, bortezomib, lenalidomidsorafenib, romidepsin og kombinasjoner derav, eller er antistoffbasert. Den foreliggende oppfinnelsen tilveiebringer enda videre anvendelse av et immunkonjugat ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 7 for produksjon av et medikament for å inhibere, forsinke og/eller forebygge veksten av en tumor omfattende CD138-tumorceller og/eller spredning av tumorceller av en slik tumor hos en pasient. Det konstruerte målrettende antistoffet ifølge den foreliggende beskrivelsen kan

6 4 (i) består i det vesentlige av en antigenbindingsregion (ABR) mot CD138 av et ikke-humant antistoff, eller (ii) omfatter en antigenbindingsregion (ABR) mot CD138, hvori antigenbindingsregionen er av et ikke-humant antistoff, og en ytterligere antistoffregion, hvori minst en del av den ytterligere antistoffregionen er av et humant antistoff. Beskrivelsens ABR kan omfatte: (a) CD3 i tungkjedens variable region omfattende henholdsvis aminosyrerestene 99 til 111 av SEQ ID NO: 1, og (b) CDR3 i lettkjedens variable region omfattende aminosyrerestene 89 til 97 av SEQ ID NO: 2. Beskrivelsens ABR kan ytterligere omfatte: 1 (a) CDR1 og CDR2 i tungkjedens variable region omfattende aminosyrerestene 31 til 3 og 1 til 68 av SEQ ID NO: 1, og/eller (b) CDR1 og CDR 2 i lettkjedens variable region omfattende aminosyrerestene 24 til 34 og 0 til 6 av SEQ ID NO: 2. Den ytterligere antistoffregionen kan omfatte: (a) aminosyrerestene 123 til 448 av SEQ ID NO: 1, og/eller (b) aminosyrerestene 8 til 214 av SEQ ID NO: 2 og mutasjoner derav som 2 (i) bevarer eller reduserer den antistoffavhengige cytotoksisiteten og/eller komplementavhengige cytotoksisiteten til det konstruerte målrettende antistoffet og/eller (ii) stabiliserer det konstruerte målrettende antistoffet. Effektormolekylet kan være bundet til det konstruerte målrettende antistoffet via en linker. Bindingen kan omfatte en disulfidbinding. Effektormolekylet (f.eks. DM4) kan tilveiebringe sterisk hindring mellom det målrettende antistoffet og effektormolekylet. Effektormolekylet kan være minst ett maytansinoid (f.eks. DM1, DM3 eller DM4), taksan eller en CC6, eller en analog derav.

7 Immunkonjugatet kan binde CD138 med en målvariasjon på mindre enn %, 140 %, 1 %, 1 %, 1 %, 0 %, 90 %, 80 %, 70 %, 60 % eller 0 %. Den foreliggende beskrivelsen vedrører også et immunkonjugat omfattende: et målrettende middel som målretter CD138 omfattende et isolert polypeptid omfattende en aminosyresekvens av en immunglobulintungkjede eller en del derav, hvori immunglobulin-tungkjeden eller delen derav har minst 70 % sekvensidentitet med SEQ ID NO:1. En konstant region av immunglobulin-tungkjeden eller delen derav kan være en konstant region av IgG4-isotype. Den foreliggende beskrivelsen vedrører også en fremgangsmåte for å behandle MM hos et individ, omfattende å: tilveiebringe ett av flere av immunkonjugatene spesifisert heri, og 1 administrere til individet immunkonjugatet i en mengde som er virkningsfull for å behandle multippelt myelom. Det målrettende middelet av immunkonjugatet ifølge beskrivelsen kan omfatte en lettkjedesekvens med minst ca. 70 % sekvensidentitet med SEQ ID NO:2. Det målrettende middelet av immunkonjugatet ifølge beskrivelsen kan også omfatte en tungkjedesekvens med minst ca. 70 % sekvensidentitet med SEQ ID NO:1. 2 Den foreliggende beskrivelsen vedrører også en fremgangsmåte for immunkonjugatmediert legemiddeladministrering omfattende å: tilveiebringe ett eller flere av immunkonjugatene spesifisert heri, og administrere immunkonjugatet i en terapeutisk virkningsfull mengde, hvori IgG4-isotypen lindrer ADCC, komplementavhengig cytotoksisitet og/eller Fcmediert målretting av hepatisk FcR. Den foreliggende beskrivelsen vedrører også en fremgangsmåte for å inhibere, forsinke og/eller forebygge veksten av tumorceller i en cellekultur omfattende å administrere til cellekulturen en vekst av tumorceller som inhiberer, forsinker og/eller forebygger virkningsfull mengde av ett eller flere av immunkonjugatene

8 6 spesifisert heri. Den virkningsfulle mengden kan indusere celledød eller kontinuerlig cellesyklusstans i CD138-uttrykkende tumorceller og eventuelt hjelpeceller som ikke uttrykker CD138, særlig tumorstromaceller. Cellene i cellekulturen kan oppnås fra en cancerpasient, og etter administrering av den virkningsfulle mengden av immunkonjugatet kan cellene i cellekulturen reimplanteres i cancerpasienten. 1 Den foreliggende beskrivelsen vedrører også en fremgangsmåte for å inhibere, forsinke og/eller forebygge veksten av en tumor omfattende CD138-tumorceller og/eller spredning av tumorceller av en slik tumor hos en pasient med behov for det, omfattende administrere til pasienten minst ett eller flere av immunkonjugatene spesifisert ovenfor i en vekst av tumoren og/eller spredning av tumorcellene som inhiberer eller reduserer mengde, hvori immunkonjugatet inhiberer, forsinker eller forhindrer veksten og/eller spredningen av tumorcellene. Immunkonjugatenes effektormolekyl kan være et toksin, et cytotoksisk enzym, et cytotoksisk legemiddel med lav molekylvekt, et poredannende middel, en biologisk responsmodifikator, et prolegemiddelaktiverende enzym, et antistoff, et cytokin eller et radionuklid; 2 immunkonjugater ifølge den foreliggende oppfinnelsen kan administreres i en enkeltdose på mg/m 2 til ca. 0 mg/m 2, eventuelt hver time, dag, uke eller kombinasjoner derav. Multidoseregimer inkluderer regimer hver time, daglig og ukentlig og er del av den foreliggende oppfinnelsen og inkluderer særlig administrering ved intervaller på, 6, 7, 8, 9,, 11, 12, 13, 14, 1, 16, 17, 18, 19,, 21, 22, 23 timer, 1, 2, 3, 4,, 6, 7 dager, 1, 2, 3, 4,, 6, 7 eller 8 uker. Den foreliggende beskrivelsen vedrører også en fremgangsmåte for å inhibere, forsinke og/eller forebygge veksten av en tumor og/eller spredning av maligne tumorceller hos en pasient med behov for det, omfattende å 3 (a) administrere til pasienten ett eller flere cytotoksiske middel og/eller stråling i en mengde som er virkningsfull for å redusere tumormengde; og

9 7 (b) administrere til pasienten minst ett av immunkonjugatene spesifisert heri i en vekst av en tumor og/eller spredning av tumorceller som inhiberer, forsinker eller forebygger mengde, hvori immunkonjugatet inhiberer, forsinker eller forhindrer veksten og/eller spredningen av tumorceller omfattende CD138-uttrykkende celler. Det cytotoksiske middelet kan særlig være mefalan, vinkristin, doksorubicin, deksametason, syklofosfamid, etoposid, cytarabin, cisplatin, talidomid, prednison, talidomid, bortezomib, lenalidomid, sorafenib, romidepsin eller kombinasjoner derav, eller kan være antistoffbasert. Den foreliggende beskrivelsen vedrører også en fremgangsmåte for å behandle et individ med en tilstand som ville dra fordel av suppresjon av myelomcelleoverlevelse, idet fremgangsmåten omfatter å: 1 (a) tilveiebringe minst ett av hvilke som helst av immunkonjugatene spesifisert heri, og (b) administrere immunkonjugatet til individet for selektivt å redusere overlevelse eller vekst av myelomcellene hos individet. Den foreliggende oppfinnelsen vedrører også en farmasøytisk sammensetning omfattende hvilke som helst av immunkonjugatene ifølge oppfinnelsen for å inhibere, forsinke og/eller forebygge veksten av tumorer og/eller spredning av tumorceller, og én eller flere farmasøytisk akseptable eksipienter. 2 Den farmasøytiske sammensetningen kan inkludere cytotoksiske middel som spesifisert heri. 3 Den foreliggende oppfinnelsen vedrører også et kit omfattende, i separate beholdere, farmasøytiske sammensetninger for anvendelse i kombinasjon for å inhibere, forsinke og/eller forebygge vekst av tumorer og/eller spredning av tumorceller, hvori én beholder omfatter en virkningsfull mengde av ovenstående farmasøytiske sammensetning, og hvori en separat beholder omfatter en andre farmasøytisk sammensetning omfattende en virkningsfull mengde av et middel, foretrukket et cytotoksisk middel, for inhibering, forsinkelse og/eller forebygging av veksten av tumorer og/eller spredning av tumorceller, og én eller flere farmasøytisk akseptable eksipienter.

10 8 Den foreliggende beskrivelsen vedrører også en fremgangsmåte for å inhibere, forsinke og/eller forebygge vekst av en tumor omfattende CD138-tumorceller og/eller spredning av tumorceller av en slik tumor hos et individ med behov for det, omfattende å (a) tilveiebringe et immunkonjugat omfattende: et konstruert målrettende antistoff mot CD138 bundet til et effektormolekyl via en spaltbar binding, hvori effektormolekylet hindres sterisk, og (b) administrere til individet immunkonjugatet av (a) i en vekst av tumoren og/eller spredning av tumorcellene, hvilket inhiberer, forsinker og/eller forebygger mengden, hvori immunkonjugatet av (a) tilveiebringer en vekst av en tumorinhiberende aktivitet som overgår den for dens uhindrede motstykke med ca. %, ca. %, ca. %, ca. 40 % eller mer. 1 En vekst av en tumorinhiberende aktivitet av et uhindret motstykke omfattende en ikke-spaltbar binding kan overstige det for veksten av en tumorinhiberende aktivitet av dens uhindrede motstykke omfattende en spaltbar binding, slik som med minst ca. %, minst ca. %, opp til ca. 1 %. 2 Det konstruerte målrettende antistoffet mot CD138 kan bestå i det vesentlige av antigenbindingsregion mot CD138 av et ikke-humant antistoff eller kan omfatte en antigenbindingsregion mot CD138 av et ikke-humant antistoff og en ytterligere antistoffregion, hvori minst en del av den ytterligere antistoffregionen er av et humant antistoff. Den spaltbare bindingen kan omfatte en disulfidbinding. Effektormolekylet kan være DM4. Immunkonjugatet kan være en del av en farmasøytisk sammensetning og kan administreres til individet i minst én dose i en mengde fra ca. mg/m 2 til ca. 0 mg/m 2. Den foreliggende beskrivelsen tilveiebringer et immunkonjugat for anvendelse som medikament, hvori immunkonjugatet omfatter: (a) et konstruert målrettende antistoff 3 (i) bestående i det vesentlige av en antigenbindingsregion mot CD138 av et ikke-humant antistoff, eller

11 9 (ii) omfattende en antigenbindingsregion mot CD138, hvori antigenbindingsregionen er av et ikke-humant antistoff, en ytterligere antistoffregion, hvori minst en del av den ytterligere antistoffregionen er av et humant antistoff, og (b) et effektormolekyl, hvori immunkonjugatet binder homogent til CD138. Den foreliggende beskrivelsen tilveiebringer et ytterligere immunkonjugat for anvendelse som medikament omfattende: et målrettende middel som målretter CD138 omfattende et isolert polypeptid som omfatter en aminosyresekvens av en immunglobulintungkjede eller en del derav, hvori immunglobulin-tungkjeden eller delen derav har minst 70 % sekvensidentitet med SEQ ID NO:1. 1 I ett aspekt ved beskrivelsen er immunkonjugatet ifølge ovenstående avsnitt særlig for anvendelse i behandlingen av multippelt myelom. Immunkonjugatet kan særlig anvendes for produksjon av et medikament for behandling av multippelt myelom. 2 Den foreliggende beskrivelsen tilveiebringer videre et immunkonjugat for anvendelse i immunkonjugatmediert legemiddeladministrering til en pasient, særlig for lindring av ADCC, komplementavhengig cytotoksisitet og/eller Fcmediert målretting av hepatisk FcR, hvori immunkonjugatet omfatter et målrettende middel som målretter CD138 omfattende et isolert polypeptid omfattende en aminosyresekvens av en immunglobulin-tungkjede eller en del derav, hvori immunglobulin-tungkjeden eller delen derav har minst 70 % sekvensidentitet med SEQ ID NO:1, og hvori en konstant region av immunglobulin-tungkjeden eller delen derav er en konstant region av IgG4- isotype. Den foreliggende beskrivelsen tilveiebringer også tumorceller for anvendelse i behandlingen av cancer hos en pasient hvori tumorcellene er behandlet i cellekultur med et immunkonjugat omfattende: (a) et konstruert målrettende antistoff

12 (i) bestående i det vesentlige av en antigenbindingsregion mot CD138 av et ikke-humant antistoff, eller (ii) omfattende en antigenbindingsregion mot CD138, hvori antigenbindingsregionen er av et ikke-humant antistoff, en ytterligere antistoffregion, hvori minst en del av den ytterligere antistoffregionen er av et humant antistoff, og (b) et effektormolekyl, hvori immunkonjugatet binder homogent til CD138. Den foreliggende beskrivelsen tilveiebringer også tumorceller for anvendelse i behandlingen av cancer hos en pasient hvori tumorcellene er behandlet i cellekultur med et immunkonjugat omfattende: et målrettende middel som målretter CD138 omfattende 1 et isolert polypeptid som omfatter en aminosyresekvens av en immunglobulintungkjede eller en del derav, hvori immunglobulin-tungkjeden eller delen derav har minst 70 % sekvensidentitet med SEQ ID NO:1. Den foreliggende beskrivelsen tilveiebringer et immunkonjugat for anvendelse i inhiberingen, forsinkelsen og/eller forebyggingen av veksten av en tumor omfattende CD138-tumorceller og/eller spredning av tumorceller av en slik tumor hos en pasient, hvori immunkonjugatet omfatter: (a) et konstruert målrettende antistoff (i) bestående i det vesentlige av en antigenbindingsregion mot CD138 av et ikke-humant antistoff, eller 2 (ii) omfattende en antigenbindingsregion mot CD138, hvori antigenbindingsregionen er av et ikke-humant antistoff, en ytterligere antistoffregion, hvori minst en del av den ytterligere antistoffregionen er av et humant antistoff, og (b) et effektormolekyl, hvori immunkonjugatet binder homogent til CD138. Alternativt kan den foreliggende beskrivelsen tilveiebringe et immunkonjugat for anvendelse i inhiberingen, forsinkelsen og/eller forebyggingen av veksten av en

13 11 tumor omfattende CD138-tumorceller og/eller spredning av tumorceller av en slik tumor hos en pasient, hvori immunkonjugatet omfatter: et målrettende middel som målretter CD138 omfattende et isolert polypeptid som omfatter en aminosyresekvens av en immunglobulintungkjede eller en del derav, hvori immunglobulin-tungkjeden eller delen derav har minst 70 % sekvensidentitet med SEQ ID NO:1. Den foreliggende beskrivelsen tilveiebringer enda videre et medikament omfattende et immunkonjugat og ett eller flere cancerlegemiddel som en kombinert fremstilling for samtidig, separat eller suksessiv anvendelse i behandlingen av tumorceller omfattende CD138-uttrykkende celler, hvori immunkonjugatet omfatter: (a) et konstruert målrettende antistoff 1 (i) bestående i det vesentlige av en antigenbindingsregion mot CD138 av et ikke-humant antistoff, eller (ii) omfattende en antigenbindingsregion mot CD138, hvori antigenbindingsregionen er av et ikke-humant antistoff, en ytterligere antistoffregion, hvori minst en del av den ytterligere antistoffregionen er av et humant antistoff, og (b) et effektormolekyl, hvori immunkonjugatet binder homogent til CD138, og hvori det ene eller flere cancermidlene kan redusere tumormengden. 2 Den foreliggende beskrivelsen tilveiebringer alternativt et medikament omfattende et immunkonjugat og ett eller flere cancermiddel som en kombinert fremstilling for samtidig, separat eller suksessiv anvendelse i behandlingen av tumorceller omfattende CD138-uttrykkende celler, hvori immunkonjugatet omfatter: et målrettende middel som målretter CD138 omfattende et isolert polypeptid omfattende en aminosyresekvens av en immunglobulin- tungkjede eller en del derav, hvori immunglobulin-tungkjeden eller delen derav har minst 70 % sekvensidentitet med SEQ ID NO:1, og hvori det ene eller flere cancermidlene kan redusere tumormengden.

14 12 I et ytterligere aspekt ved anvendelsen av ovenstående to avsnitt skal den kombinerte fremstillingen administreres til en pasient som er behandlet med stråling. I et alternativ aspekt tilveiebringer den foreliggende beskrivelsen anvendelsen av et immunkonjugat for produksjon av et medikament for å behandle tumorceller hos en pasient omfattende CD138-uttrykkende celler, hvori immunkonjugatet omfatter: (a) et konstruert målrettende antistoff (i) bestående i det vesentlige av en antigenbindingsregion mot CD138 av et ikke-humant antistoff, eller (ii) omfattende en antigenbindingsregion mot CD138, hvori antigenbindingsregionen er av et ikke-humant antistoff, 1 en ytterligere antistoffregion, hvori minst en del av den ytterligere antistoffregionen er av et humant antistoff, og (b) et effektormolekyl, 2 hvori immunkonjugatet binder homogent til CD138, og hvori medikamentet skal administreres til en pasient behandlet med stråling for å redusere tumormengden. Enda videre tilveiebringer den foreliggende beskrivelsen anvendelsen av et immunkonjugat for produksjon av et medikament for å behandle tumorceller hos en pasient omfattende CD138-uttrykkende celler, hvori immunkonjugatet omfatter: et målrettende middel som målretter CD138 omfattende et isolert polypeptid omfattende en aminosyresekvens av en immunglobulintungkjede eller en del derav, hvori immunglobulin-tungkjeden eller delen derav har minst 70 % sekvensidentitet med SEQ ID NO:1, og hvori medikamentet skal administreres til en pasient behandlet med stråling for å redusere tumormengden. I ovenstående avsnitt kan medikamentet inhibere, forsinke og/eller forebygge veksten av en tumor og/eller spredning av maligne tumorceller hos en pasient.

15 13 Den foreliggende beskrivelsen tilveiebringer videre et immunkonjugat for suppresjon av myelomcelleoverlevelse hos et individ hvori immunkonjugatet omfatter: (a) et konstruert målrettende antistoff (i) bestående i det vesentlige av en antigenbindingsregion mot CD138 av et ikke-humant antistoff, eller (ii) omfattende en antigenbindingsregion mot CD138, hvori antigenbindingsregionen er av et ikke-humant antistoff, en ytterligere antistoffregion, hvori minst en del av den ytterligere antistoffregionen er av et humant antistoff, og (b) et effektormolekyl, hvori immunkonjugatet binder homogent til CD Den foreliggende beskrivelsen tilveiebringer enda videre et immunkonjugat for suppresjon av myelomcelleoverlevelse hos et individ hvori immunkonjugatet omfatter: et målrettende middel som målretter CD138 omfattende et isolert polypeptid som omfatter en aminosyresekvens av en immunglobulintungkjede eller en del derav, hvori immunglobulin-tungkjeden eller delen derav har minst 70 % sekvensidentitet med SEQ ID NO:1. I ovenstående to avsnitt kan immunkonjugatet særlig selektivt redusere overlevelsen eller veksten av myelomcellene hos individet. 2 Den foreliggende beskrivelsen tilveiebringer videre et immunkonjugat for anvendelse i inhiberingen, forsinkelsen og/eller forebyggingen av vekst av en tumor omfattende CD138-tumorceller og/eller spredning av tumorceller av en slik tumor hos et individ hvori immunkonjugatet omfatter et konstruert målrettende antistoff mot CD138 bundet til et effektormolekyl via en spaltbar binding, hvori effektormolekylet hindres sterisk. I ovenstående avsnitt kan immunkonjugatet særlig tilveiebringe en tumorvekstinhiberende aktivitet som overgår den for dens uhindrede motstykke med ca. %, ca. %, ca. %, ca. 40 % eller mer.

16 14 KORT BESKRIVELSE AV FIGURENE FIG. 1 tilveiebringer en skjematisk representasjon av nbt062 med effektormolekyler tilknyttet. FIG. 2 er en kjemisk fremstilling av BT062. FIG. 3 viser konverteringen av ansamitocin P-3 til maytansinol (stereokjemi er utelatt for enkelthets skyld). FIG. 4 viser et representativt synteseskjema for DM4. 1 FIG. er en skjematisk representasjon av en antistoffkonjugering (nbt062 til DM4). FIG. 6 viser en analyse av bindingen av nbt062-spdb-dm4, nbt062-spp-dm1, nbt062-smcc-dm1 og nbt062-antistoff til OPM-2-celler. Forskjellige konsentrasjoner av nbt062 og konjugater ble gitt til cellene, og gjennomsnittlig fluorescens ble målt ved FACS-analyse. FIG. 7(A)-(D) viser in vitro-cytotoksisitet av nbt062-dmx-konjugater mot MOLP-8 (CD138 + ) og BJAB (CD138)-celler. Cellene ble dyrket i flatbunnede plater og ble inkubert med de angitte konsentrasjonene av immunkonjugater i døgn. WST-reagens ble tilsatt i ytterligere 3 timer for å vurdere cellenes levedyktighet. I (D) ble cytotoksisk aktivitet av nbt062-spdb-dm4 analysert i nærvær eller fravær av blokkerende antistoff (1 µm nbt062). FIG. 8 viser tumorvolum for individuelle mus behandlet med (A) PBS, (B) nbt062-antistoff, (C) fritt DM4 eller (D) ikke-målrettende konjugat huc242-dm4 over tid (døgn) etter inokulering med MOLP-8-tumorceller. 2 FIG. 9 viser tumorvolum for individuelle mus behandlet med (A) PBS, (B) nbt062-spdb-dm4, (C) B-B4-SPP-DM1 eller (D) nbt062-spp-dm1 over tid (døgn) etter inokulering med MOLP-8-tumorceller. FIG. viser gjennomsnittlig tumorvolum (+/- SD) av MOLP-8 multippelt myelom-xenografter hos CB.17 SCID-mus over tid (døgn) etter inokulering. FIG. 11AogB viser anti-tumor-aktiviteten av nbt062-dmx mot CD138 + MOLP-8- tumorceller i en omfattende MOLP-8 tumormodell med SCID-mus. Tumorvolum er angitt som gjennomsnitt (+/- SD) for hver gruppe.

17 1 FIG. 12 er en graf som reflekterer anti-tumoreffekten av nbt062 inneholdende DMx-konjugater i SCIDhu/INA-6-modellen mot multippelt myelom-celler i den humane benmargen. Løselig human IL-6-reseptor produsert av multippelt myelom-celler (shull-6r) ble anvendt som en indikator for tumormengde. Trekant: nbt062-spp-dm1, firkant: nbt062-spdb-dm4; diamant: vehikkelkontroll. FIG. 13 viser nbt062-spdb-dm4-mediert bystander-dreping in vitro. CD138- positive OPM2-celler og CD138-negative Namawla-celler ble dyrket med nbt062- SPDB-DM4 ved forskjellige konsentrasjoner, og cellenes levedyktighet ble målt. OD 40 -verdier representerer et mål for cellenes levedyktighet. DETALJERT BESKRIVELSE AV FORSKJELLIGE OG FORETRUKNE UTFØRELSESFORMER AV OPPFINNELSEN 1 Den foreliggende oppfinnelsen vedrører immunkonjugater omfattende CD138- uttrykkende antistoffer og administreringen av effektormolekyl(er) av immunkonjugatene til målsteder, og den stedspesifikke frisettingen av effektormolekyl(er) i, ved eller nær målceller, vev og organer. Den foreliggende oppfinnelsen vedrører nærmere bestemt immunkonjugater omfattende CD138 som målretter antistoffer og sterke effektormolekyler som er bundet til det målrettende middelet. Effektormolekylene kan bli aktivert ved spalting/dissosiasjon fra den målrettende middel-delen av immunkonjugatet ved målstedet. 2 Immunkonjugatene ifølge den foreliggende oppfinnelsen kan administreres til et individ med behov for terapeutisk behandling. Effektormolekylet eller - molekylene kan frisettes fra immunkonjugatet ved spalting/dissosiasjon i, på eller nær målcellen, -vevet eller -organet. 3 I ett eksempel omfatter immunkonjugatet antistoffet nbt062, hvilket målretter CD138-uttrykkende celler, og minst ett svært cytotoksisk legemiddel eller toksin som effektormolekyl administreres til en pasient med cancer. I dette eksempelet administreres den terapeutisk virkningsfulle mengden av immunkonjugatet intravenøst til en pasient slik at det konsentreres i cancercellene. Effektormolekylet eller -molekylene frisettes deretter fra antistoffet ved naturlige middel. Etter eller under spalting kan effekormolekylet stabiliseres ved alkylering

18 16 og kan diffundere til omgivende hjelpeceller slik som stromaceller som ikke uttrykker CD I et andre eksempel omfatter immunkonjugatet antistoffet nbt062, hvilket målretter CD138-uttrykkende celler, og minst ett svært cytotoksisk legemiddel eller toksin som effektormolekyl, og et ytterligere cytotoksisk middel administreres til en pasient med cancer. I dette eksempelet koadministreres den terapeutisk virkningsfulle mengden av immunkonjugatet og det cytotoksiske middelet koadministrert intravenøst til en pasient slik at det konsentreres i cancercellene. Det cytotoksiske middelet ødelegger mer enn 0 % av de CD138- uttrykkende cancercellene, men immunconjugatet fester effektivt til ytterligere CD138-uttrykkende cancerceller. Effektormolekylet eller -molekylene frisettes fra antistoffet ved naturlige middel. Etter eller under spalting kan effekormolekylet stabiliseres ved alkylering og kan diffundere til omgivende hjelpeceller slik som stromaceller som ikke uttrykker CD I et tredje eksempel omfatter immunkonjugatet antistoffet nbt062 og minst ett svært cytotoksisk legemiddel eller toksin, og administreres til en cellepopulasjon isolert fra en pasient med cancer. I dette eksempelet administreres det celledød eller kontinuerlig cellesyklusstans som induserer mengde av immunkonjugatet til cellepopulasjonen slik at det konsentreres i de cancerøse cellene. Effektormolekylet eller -molekylene frisettes fra det målrettende antistoffet ved naturlige middel eller eksterne middel for å indusere celledød eller kontinuerlig cellesyklusstans i cancercellene. I et fjerde eksempel omfatter immunkonjugatet antistoffet nbt062 og minst ett svært cytotoksisk legemiddel eller toksin som effektormolekyl, og administreres til en pasient med cancer. I dette eksempelet administreres den terapeutisk virkningsfulle mengden av immunkonjugatet intravenøst til en pasient slik at det konsentreres i de cancerøse cellene. Effektormolekylet eller -molekylene frisettes fra antistoffmålet ved anvendelse av eksterne middel for å indusere celledød eller kontinuerlig cellesyklusstans i cancercellene. 3 CD138 eller syndekan-1 (også beskrevet som SYND1; SYNDECAN; SDC; SCD1; CD138 ANTIGEN, SwissProt aksesjonsnummer: P18827 human) er et membranglykoprotein som opprinnelig ble beskrevet å være til stede på celler av epitelial opprinnelse, og som senere ble funnet på hematopoietiske celler

19 17 (Sanderson, 1989). CD138 har et langt ekstracellulært domene som binder til løselige molekyler (f.eks. vekstfaktorene EGF, FGF, HGF) og til uløselige molekyler (f.eks. til ekstracellulær matriks-komponentene kollagen og fibronektin) gjennom heparansulfatkjeder (Langford, 1998; Yang, 07) og virker som en reseptor for den ekstracellulære matriksen. CD138 medierer også celle til celle-adhesjon gjennom heparinbindende molekyler som blir uttrykt av adherente celler. Det er vist at CD138 har en rolle som koreseptor for vekstfaktorer for myelomceller (Bisping, 06). Studier av plasmacelledifferensiering viste at CD138 også må betraktes som et differensieringsantigen (Bataille, 06). 1 Ved malign hematopoiese blir CD138 kraftig uttrykt på de fleste MM-celler, eggstokkarsinom-, nyrekarsinom-, galleblærekarsinom-, brystkarsinom-, prostatakreft-, lungekreft-, kolonkarsinomceller og celler fra Hodgkins og ikke- Hodgkins lymfomer, kronisk lymfatisk leukemi (CLL) (Horvathova, 199), akutt lymfoblastisk leukemi (ALL), akutt myeloblastisk leukemi (AML) (Seftalioglu, 03 (a); Seftalioglu, 03 (b)), fastvevssarkomer, kolonkarsinomer samt andre hematologiske maligniteter og faste tumorer som uttrykker CD 138 (Carbone et al., 1999; Sebestyen et al., 1999; Han et al., 04; Charnaux et al., 04; O'Connell et al.,04; Orosz og Kopper, 01). 2 Andre cancere som er vist å være positive for CD138-ekspresjon, er mange eggstokk-adenokarsinomer, overgangscelle-blærekarsinomer, clear cellnyrekarsinomer, plateepitelcelle-lungekarsinomer; brystkarsinomer og livmorcancere (se for eksempel Davies et al., 04; Barbareschi et al., 03; Mennerich et al., 04; Anttonen et al., 01; Wijdenes, 02). 3 I det normale humane hematopoietiske kompartmentet er CD138-ekspresjon begrenset til plasmaceller (Wijdenes, 1996; Chilosi, 1999), og CD138 blir ikke uttrykt på perifere blodlymfocytter, monocytter, granulocytter og røde blodceller. Spesielt CD34 + stam- og progenitorceller utrykker ikke CD138, og anti-cd138 mabs påvirker ikke antallet kolonidannende enheter i hematopoietiske stamcellekulturer (Wijdenes, 1996). I ikke-hematopoietiske kammer blir CD138 hovedsakelig uttrykt på enkelt og stratifisert epitel i lunge, lever, hud, nyre og tarm. Bare en svak farging ble sett på endotelceller (Bernfield, 1992; Vooijs, 1996). Det er rapportert at CD138 foreligger i polymorfe former i humane lymfomceller (Gattei, 1999).

20 18 De monoklonale antistoffene B-B4, BC/B-B4, B-B2, DL-1, 1 D4, MI1, 1.BB.2, 2Q1484, F7, 4-9, 281-2, og spesielt B-B4, er rapportert å være spesifikke for CD138. Av disse gjenkjente B-B4, 1 D4 og MI1 både det intakte molekylet og kjerneproteinet til CD138 og ble vist å gjenkjenne enten de samme eller nært beslektede epitopene (Gattei, 1999). Fra tidligere studier er det rapportert at B-B4 ikke gjenkjente løselig CD138, men kun CD138 i membranbundet form (Wijdenes, 02). 1 B-B4, et murint IgG1 mab, binder til en lineær epitop mellom restene 90 9 på kjerneproteinet på humant syndecan-1 (CD138) (Wijdenes, 1996; Dore, 1998). I samsvar med ekspresjonsmønsteret til CD138 ble B-B4 vist å reagere kraftig med plasmacellelinje RPMI8226, men ikke med endotelceller. Det er også i samsvar med ekspresjonsmønsteret til CD138 at B-B4 også reagerte med epitelcellelinjene A431 (keratinocyttderivert) og HepG2 (hepatocyttderivert). Immuntoksinet B-B4-saporin var også svært toksisk mot plasmacellelinjen RPMI8226, faktisk betraktelig mer toksisk enn fritt saporin. På bakgrunn av de to testede epitelcellelinjene viste imidlertid B-B4-saporin toksisitet kun mot cellelinje A431, selv om B-B4-saporin i en klonogen analyse ikke viste noen hemmende effekt på utvekst av A431-celler (Vooijs, 1996). Andre forskere har rapportert manglende spesifisitet av MM-assosierte antigener mot tumorer (Couturier, 1999). 2 Et antistoff/immunkonjugat "som i det vesentlige består av" visse komponenter, betyr i sammenheng med foreliggende beskrivelse at antistoffet/immunkonjugatet består av de spesifiserte komponentene og eventuelt ytterligere materialer eller komponenter som ikke vesentlig påvirker antistoffets grunnleggende karakteristika. Den foreliggende oppfinnelsen benytter betegnelsen "tumorcelle" slik at den inkluderer cancerceller så vel som precancerøse celler som eventuelt kan utgjøre en del av en fast tumor. 3 Et "målrettende middel" ifølge den foreliggende beskrivelsen kan assosiere med et molekyl uttrykt av en målcelle og inkluderer peptider og ikke-peptider. Målrettende middel ifølge den foreliggende beskrivelsen omfatter spesielt målrettende antistoffer og ikke-immunglobulin-målrettende molekyler, som kan

21 19 være basert på ikke-immunglobulin-proteiner, inkludert, men ikke begrenset til, AFFILIN -molekyler, ANTICALINS og AFFIBODIES. Ikke-immunglobulinmålrettende molekyler omfatter også ikke-peptidiske, målrettende molekyler slik som målrettende DNA- og RNA-oligonukleotider (aptamerer), men også fysiologiske ligander, spesielt ligander av det aktuelle antigenet, slik som CD Et "målrettende antistoff" ifølge den foreliggende beskrivelsen er eller er basert på et naturlig antistoff eller er produsert syntetisk eller ved genetisk konstruksjon og binder til et antigen på en celle eller celler (målcelle(r)) av interesse. Et målrettende antistoff ifølge den foreliggende beskrivelsen inkluderer et monoklonalt antistoff, et polyklonalt antistoff, et multispesifikt antistoff (f.eks. et bispesifikt antistoff) eller et antistoffragment. Det målrettende antistoffet kan være konstruert for eksempel for å forbedre dets affinitet for målcellene (Ross, 03) eller minske dets immunogenisitet. Det målrettende antistoffet kan være festet til en liposomal formulering inkluderende effektormolekyler (Carter, 03). Et antistoffragment omfatter en del av et intakt antistoff, foretrukket den antigenbindende eller variable regionen av det intakte antistoffet. Eksempel på antistoff-fragmenter ifølge den foreliggende oppfinnelsen inkluderer Fab-, Fab'-, F(ab') 2 - og Fv-fragmenter, men også diastoffer; domene-antistoffer (dab) (Ward, 1989; US-patent 6,00,079); rettkjedede antistoffer; enkeltkjedede antistoffmolekyler; og multispesifikke antistoffer dannet fra antistoff-fragmenter. I et enkeltkjedet variabelt fragmentantistoff (scfv) kan tung- og lettkjedene (VH og VL) være koblet av en kort aminosyrelinker som har for eksempel sekvensen (glysin 4 serin) n, og som har tilstrekkelig fleksibilitet til at de to domenene samles til en funksjonell antigenbindingslomme. Tilsetning av forskjellige signalsekvenser kan muliggjøre mer presis målretting av det målrettende antistoff. Tilsetning i lettkjedens konstante region (CL) kan muliggjøre dimerisering via disulfidbindinger, hvilket gir økt stabilitet og aviditet. Variable regioner for konstruksjon av scfv kan, hvis en mab mot et interessant mål er tilgjengelig, oppnås med RT-PCR som kloner ut de variable regionene fra mrna ekstrahert fra det opprinnelige hybridomet. Alternativt kan scfv genereres de novo ved fagvisningsteknologi (Smith, 01). Betegnelsen "funksjonelt fragment" skal som anvendt heri under henvisning til et målrettende antistoff bety en del av det målrettende antistoffet som er i stand til spesifikk binding av et antigen som er spesifikt bundet av antistoffet henvisningen gjelder. Et bispesifikt antistoff ifølge den foreliggende oppfinnelsen kan for eksempel ha minst én gruppe som er reaktiv mot et målvev, og én

22 gruppe som er reaktiv mot en linkergruppe (US-patentsøknad ). Et bispesifikt antistoff ifølge den foreliggende beskivelsen kan også binde til flere enn ett antigen på en målcelle (Carter, 03). Et antistoff ifølge den foreliggende oppfinnelsen kan modifiseres ved for eksempel innføring av cysteinrester for å innføre tiolgrupper (Olafsen, 04). Ifølge den foreliggende beskrivelsen kan det målrettende antistoffet være avledet fra en hvilken som helst kilde og kan være, men er ikke begrenset til, et kamel-antistoff, et murint antistoff, et kimært humant/murint antistoff eller et kimært antistoff fra menneske/ape, spesielt et kimært humant/murint antistoff som nbt Humaniserte antistoffer er antistoffer som inneholder sekvenser avledet fra et humant antistoff og fra et ikke-humant antistoff, og omfattes også av den foreliggende oppfinnelsen. Egnede fremgangsmåter for å humanisere antistoffer omfatter CDR-grafting ("complementarity determining region grafting") (EP ; WO 91/09967; US-patentene,,1; og,8,089), "veneering" eller overflatemodifisering (EP ; EP ; Padlan, 199; Studnicka et al., 1994; Roguska et al., 1994), kjedeombytting (US-patent,6,332) og Delmmunosation (Biovation, LTD). Ved CDR-grafting blir murine CDR-er (CDRs, complementarity-determining regions) fra for eksempel mab B-B4 graftet til humane variable strukturer, som deretter blir koblet til humane konstante regioner, for å skape et humant B-B4-antistoff (hb-b4). Flere antistoffer som er humanisert ved CDR-grafting, er nå i klinisk bruk, inkludert MYLOTARG (Sievers et al., 01) og HECEPTIN (Pegram et al, 1998). 3 Ved overflatemodifiseringsteknologi anvendes en kombinasjon av molekylmodellering, statistisk analyse og mutagenese for å endre ikke-cdroverflatene av antistoffets variable regioner slik at de ligner overflatene til kjente antistoffer hos målverten. Strategier og fremgangsmåter for overflatemodifisering av antistoffer, og andre fremgangsmåter for å redusere immunogeniteten av antistoffer hos en annen vert, er beskrevet i for eksempel US-patent,639,641. Humane antistoffer kan fremstilles ved en rekke fremgangsmåter som er kjente i teknikken, inkludert fagvisningsfremgangsmåter. Se også US-patentene 4,444,887, 4,716,111,,4,806, og,814,318; og de internasjonale patentsøknadspublikasjonene

23 21 WO 98/4664, WO 98/0433, WO 98/24893, WO 98/1664, WO 96/34096, WO 96/3373 og WO 91/741. Målrettende antistoffer som har gjennomgått en hvilken som helst ikke-naturlig modifisering, slik som kimære humane/murine antistoffer eller kimære antistoffer fra mennesker/aper, humaniserte antistoffer eller antistoffer som ble konstruert for eksempel for å forbedre deres affinitet for målcellene eller for å minske deres immunogenitet, men også antistoffragmenter, spesielt funksjonelle fragmenter av slike målrettende antistoffer som har gjennomgått en hvilken som helst ikke-naturlig modifisering, diastoffer; domene-antistoffer; rettkjedede antistoffer; enkeltkjedede antistoffmolekyler; og multispesifikke antistoffer er heri kalt konstruerte, målrettende antistoffer Kimeriserte antistoffer fastholder antistoffbindingsregionen (ABR- eller Fabregionen) av det ikke-humane antistoffet, f.eks. det murine antistoffet de er basert på, mens eventuelle konstante regioner tilveiebringes av for eksempel et humant antistoff. Generelt vil kimerisering og/eller endringen av konstante regioner i et antistoff ikke påvirke affiniteten til antistoffet fordi regionene i antistoffet som bidrar til antigenbinding, ikke blir påvirket av denne endringen. I en foretrukket utførelsesform ifølge den foreliggende oppfinnelsen kan det konstruerte, spesielt kimeriserte, antistoffet ifølge den foreliggende oppfinnelsen ha en høyere bindingsaffinitet (uttrykt som K D -verdier) enn det respektive ikkehumane antistoffet det er basert på. Spesielt kan nbt062-antistoffet og antistoffer basert på dette ha høyere antistoffaffinitet enn det murine B-B4. I en annen foretrukket utførelsesform ifølge den foreliggende oppfinnelsen viser immunkonjugater omfattende disse konstruerte/kimeriserte antistoffene også denne høyere antistoffaffiniteten. Disse immunkonjugatene kan i visse utførelsesformer også vise andre fordelaktige egenskaper, slik som en høyere reduksjon av tumorbelastning enn deres B-B4-holdige motstykker. I en foretrukket utførelsesform viser de konstruerte, spesielt kimeriserte, målrettende antistoffene bindingsaffiniteter som er karakterisert ved dissosiasjonskonstanter K D (nm) som er mindre enn 1,6, mindre enn 1,, eller som er omtrent eller mindre enn 1,4, mens deres murine motstykker er karakterisert ved dissosiasjonskonstanter K D (nm) som er omtrent eller høyere enn 1,6. Immunkonjugater omfattende målrettende middel, slik som målrettende antistoffer, kan være karakterisert ved dissosiasjonskonstanter K D (nm) som er mindre enn 2,6, mindre enn 2,, mindre enn 2,4, mindre enn 2,3, mindre enn

24 22 2,2, mindre enn 2,1, mindre enn 2,0, mindre enn eller ca. 1,9 er foretrukket, mens immunkonjugater omfattende antistoffer som er murine motstykker, kan være karakterisert ved dissosiasjonskonstanter K D (nm) som er omtrent eller høyere enn 2,6 (sammenlign tabell 3, Materialer og metoder). Fullstendig humane antistoffer kan også anvendes. Disse antistoffene kan være utvalgt ved fagvisningsfremgangsmåten, hvor CD138 eller en antigendeterminant derav blir brukt for selektivt å binde fagekspresjon, f.eks. variable regioner i B-B4 (se Krebs, 01). Denne fremgangsmåten kan med fordel kombineres med en affinitetsmatureringsteknikk for å forbedre antistoffets affinitet. Alle antistoffer det henvises til heri, er isolerte antistoffer I én utførelsesform er det målrettende antistoffet, i dets ukonjugerte form, moderat eller dårlig internalisert. Moderat internalisering innebærer ca. % til ca. 7 % internalisering av antistoff, dårlig internalisering innebærer ca. 0,01 % til opptil ca. % internalisering etter 3 timers inkubering ved 37 C. I en annen foretrukket utførelsesform bindes det målrettende antistoffet til CD138, f.eks. antistoffene B-B4, BC/B-B4, B-B2, DL-1, 1 D4, MI1, 1.BB.2, 2Q1484, F7, 4-9, 281-2, spesielt B-B4. Hybridomceller, som ble generert ved hybridisering av SP02/0-myelomceller med miltceller fra Balb/c-mus, ble 11. desember 07 deponert hos DSMZ-Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Mascheroder Weg 1, D Braunschweig. Identifikasjonsnummeret til disse B-B4-uttrykkende hybridomcellene er DSM ACC2874. I en annen utførelsesform gir det målrettende antistoffet ikke vesentlig binding av ikkecelleoverflateuttrykt CD138. Når navnet til et spesifikt antistoff i sammenheng med den foreliggende oppfinnelsen er kombinert med betegnelsen "målrettende antistoff" slik som "nbt062-målrettende antistoff", betyr dette at dette målrettende antistoffet har bindingspesifisitet for antistoffet nbt062. Hvis et målrettende antistoff er sagt å være "basert på" et spesifisert antistoff, betyr dette at dette målrettende antistoffet har bindingsspesifisiteten til dette antistoffet, men kan anta en hvilken som helst form som er i samsvar med den ovennevnte beskrivelsen av et målrettende antistoff. Når navnet til et spesifikt antigen i sammenheng med den foreliggende oppfinnelsen blir kombinert med betegnelsen "målrettende antistoff", slik som "CD138-målrettende antistoff," betyr dette at dette målrettende antistoffet har bindingsspesifisitet for CD138. Hvis for eksempel et målrettende antistoff i sammenheng med den foreliggende oppfinnelsen er sagt å gjøre noe "selektivt", slik som "selektivt målrettende

25 23 celleoverflate-uttrykt CD138" eller å være "selektivt" for noe, betyr dette at det er en vesentlig selektivitet (dvs. en høyere affinitet for CD138-positive celler enn for CD138-negative celler) for, i dette gitte eksemplet, celleoverflate-uttrykt CD138, sammenlignet med hvilke som helst andre antigener. Negative bivirkninger i et gitt miljø blir vesentlig redusert eller til og med unngått på grunn av denne selektiviteten "Ikke-immunglobulinmålrettende molekyler" ifølge den foreliggende beskrivelsen omfatter målrettende molekyler avledet fra ikke-immunglobulin-proteiner så vel som ikke-peptidiske målrettende molekyler. Små ikke-immunglobulin-proteiner som er inkludert i denne definisjonen, er utformet for å ha spesifikke affiniteter overfor spesielt overflateuttrykt CD138. Disse små ikke-immunglobulinproteinene omfatter skaffoldbaserte, konstruerte molekyler slik som Affilin - molekyler som har en relativt lav molekylvekt, f.eks. mellom kda og kda. Passende skaffolder omfatter for eksempel gammakrystallin. De molekylene har, i sin naturlige tilstand, ingen spesifikk binding overfor målmolekylene. Ved å konstruere proteinoverflatene gjennom lokalt definert randomisering av løsningsmiddeleksponerte aminosyrer blir fullstendig nye bindingssteder skapt. Tidligere ikke-bindende proteiner blir derved forvandlet til spesifikke bindingsproteiner. Slike molekyler kan være spesifikt utformet for å binde et mål, slik som CD138, og muliggjør spesifikk avlevering av ett eller flere effektormolekyler (se scil Proteins GmbH på 04). En annen type av ikke-immunglobulin-målrettende molekyler er avledet fra lipokaliner og inkluderer for eksempel ANTICALINS, som i struktur ligner noe på immunglobuliner. Lipokaliner er imidlertid sammensatt av en enkelt polypeptidkjede med 160 til 180 aminosyrerester. Bindingslommen til lipokaliner kan omformes for å gjenkjenne et molekyl av interesse med høy affinitet og spesifisitet (se for eksempel Beste et al., 1999). Syntetiske bakterielle reseptorer, slik som de som er markedsført under varemerket Affibody (Affibody AB), omfattes også av den foreliggende beskrivelsen. Disse syntetiske bakterielle reseptormolekylene er små, enkle proteiner og kan være sammensatt av en tre-heliks-bunt som er basert på skaffoldet i én av IgG-bindingsdomenene i protein A (Staphylococcus aureus). Disse molekylene har tilsvarende bindingsegenskaper som mange immunglobuliner, men er vesentlig mindre og har en molekylvekt som ofte ikke overskrider kda og har også sammenlignbar stabilitet. Egnede syntetiske bakterielle reseptormolekyler er for eksempel beskrevet i US-patentene,831,0126,34,628 og 6,740,734.