Bakteriefarging. Reidar Hjetland Mikrobiologisk avdeling Helse Førde Nettundervisning NFMM

Transkript

1 Bakteriefarging Reidar Hjetland Mikrobiologisk avdeling Helse Førde Nettundervisning NFMM

2 Disposisjon Generelt Historikk Fargestoff Tillaging av preparat Beising Avfargings middel Fiksering Dei enkelte fargemetodar Metylenblått farging Gram farging Syrefast farging Flagelle farging Spore farging Acridin orange HMS problemstillingar 2

3 Kjelder Lautrop H, Høiby N, Bremmelgaard A, Korsager B. Bakteriologiske undersøgelsemetoder. FADL s forlag, København Atlas RM, Snyder JM. Reagents, Stains, and Media: Bacteriology. ASM Manual, 10th ed, 2011 Wikipedia 3

4 Historikk Leeuwenhoek ( ) Mikroskop <= x 300 Lyssvake, ufarga/mangefarga pga sfærisk abberasjon Betre mikroskop på 1800 talet Samansette akromatiske linser Immersjon (vatn, > olje) Frå 1880 åra om lag som i dag 4

5 Våtpreparat fram til Koch Koch (1877) innførte tørt preparat I løpet av 1880 åra vart fargemetodar av tørt preparat innført : Koch > Ehrlich > Ziehl > Neelsen: Farging av Tb Gram 1884: Cellekjerner vs bakteriar, Gram pos vs Gram neg. Loeffler : Flagellefarging Etc. 5

6 Fargestoff kjemi Dei fleste fargestoff til bakteriologisk bruk: Anilin fargar, som er syntetiske, organiske produkt. Anilin (C 6 H 5 NH 2 ) (=phenylamine el. aminobenzene), C6H5NH2, ei fargelaus oljet væske Framstillast ved reduksjon av nitrobenzen 6

7 Fuksin Basisk fuksin (i form av salt, t.d. som klorid) Magentaraudt, basisk «Konsentrert» til ZN 1% fuksin, 10% alkohol, 5% fenol = karbolfuksin Fortynna 1:10 i aqua dest. til Gram 7

8 Krystallfiolett Blåfiolett basisk fargestoff Krystallfiolett = gentianafiolett Brukast som 0,2% vandig oppløysing med 3% anilin og 10% etanol til Gramfarging 8

9 Metylenblått Basisk fargestoff Oksydert: blått, Redusert: fargelaust Ved henstand dannast raudfiolette fargestoff > polykromatiske eigenskapar, t.d. i Loefflers metylenblått Brukast som 1% løysing til enkel bakteriefarging 9

10 Pikrinsyre Gult, surt fargestoff Eit generelt cytoplasmafargestoff og eigna som kontrastfarge. Brukast som 0,75% vandig oppløysing ved ZN farging 10

11 Safranin Raudt fargestoff Brukast mest til kontrastfarging i Gram 11

12 Malakitt grønt Har ingenting med mineralet malakitt å gjere Brukast mest som kontrastfarge i ZN 12

13 Beisar Stoff som danna uløyselege forbindelsar med fargestoff, og fikserer dei til det materialet som skal fargast. Ulike metallsalt Tannin (garvesyre) Jod (I 2 ) Tungt løyseleg i vatn, er difor løyst i jod kalium (IK) (Lugols løysing) Nyttast som vandig løysing med 0,33% jod og 0,67% kaliumjodid 13

14 Differensieringsmiddel (avfargingsmiddel) Væsker som oppløyser og fjernar overskot av fargestoff som ikkje er bundne av dei spesifikt farga strukturane i preparatet. H 2 O, etanol, metanol, aceton, syrer Basiske fargestoff kan fjernast med syrer Sure fargestoff kan fjernast med basar Alkoholar reduserer fargestoffa sin ioniseringstendens, og fjernar dersom oppløyseleg i alkohol el. aceton Obs vatn og kontrastfargar kan også fungere som avfargingsmiddel 14

15 Framstilling og fiksering av preparat til farging Koch m.fl: Laga preparat på dekkglas Seinare: Objektglas I dag: Kan brukast som levert frå fabrikken (unngå å ta på med fingrane). Unntak: Glas til flagellefarging må rensast omhyggeleg etter særleg prosedyre) 15

16 Tillaging av preparat Frå fast medium Vandig suspensjon, svakt turbid, spre med steril ause. Mål: Ein celle lag med ca 100 bakt pr synsfelt v/ 1000 x. Lufttørking. Ikkje over flamme, då dette kan deformere celler Mekanisk skade øydelegg fargbarheita til bakteriar Frå flytande medium Evt sentrifugere (t.d. spinalvæske) Fast materiale (vev) Avtrykk frå frisk snittflate Homogenisere > suspensjon Snitt (frysesnitt, evt. parafinsnitt) Parafinsnitt må rehydrerast etter spesiell prosedyre for bakteriefarging 16

17 Fiksering Mål: Åhefte bakteriecellene fast til objektglaset og bevare deira naturlege struktur best mogleg Forhindre oppsvulming, vridning, oppløysing, skrumping, inaktivere autolytiske enzym. Koagulerande vs ikkje koagulerande metodar Koagulerande: Varme, etanol, metanol Ikkje koagulerande: td. formalin 17

18 Vanlegast i bakt.lab: Flammefiksering Fører preparatet med preparatsida opp (Lautrup et al) eller ned (Haukeland) raskt 3 gonger gjennom gassflamme, a ca 1 sekund Baksida av glaset skal kunne haldast mot huden på handryggen utan å framkalle smerte For kraftig oppvarming kan øydelegge preparatet og endre cellene si fargbarheit 18

19 Flamme vs metanol Metanol ser ut til åfiksere betre, både bakteriar og vevsceller Figure. 1. Mean number of Escherichia coli cells per field of view on slides that were heat fixed (n=10) versus methanol fixed (n=10). Figure. 2. Mean number of Staphylococcus aureus cells per field of view on slides that were heat fixed (n=10) versus methanol fixed (n=10). Minnerath et al. Bioscene; 35(2)

20 Metylenblått farging Modifikasjon av Loefflers metode (1884, 1886) Metylenblått bindast til sure grupper i cellekjerner og bakteriar. Cytoplasma fargast ikkje Diverse variantar finst 1% metylenblått Det lufttørka og fikserte preparat overhellast med metylenblått, la ligge i 3 min. Avskyllast i springvatn til ikkje meir farge let seg løyse (få sekund) Bruksområde: Generell farging. God på celler ut frå kjernemorfologi. Evt metakromatiske granulae i C. diphteriae I dag sjeldan i bruk 20

21 C. diphteriae i metylenblått farging life.umd.edu 21

22 Gram farging Utvikla av dansken Hans Christian Gram under eit opphald hos Friedländer i Berlin (1884) Under arbeid med nyresnitt og lungesnitt Opprinneleg Ehrlich s anilin gentiana oppløysing eller fuksin Beising med Lugols løysing Avfarging med absolutt alkohol Kontrastfarging med Bismark brunt eller vesuvin 22

23 Mange seinare modifikasjonar Ulike fargar Karbolsyre gentianafiolett, krystallfiolett, metylfiolett Ulike avfargingsmiddel Abs. etanol, abs. etanol + 5% salpetersyre, metanol, aceton, alkohol aceton, xylen i anilin olje Ulike kontrastfargar Fuksin, nøytralraudt, safranin I prinsippet kan alle fargestoff og beisar brukast, så lenge farge beis presipitatet er dårleg oppløyseleg i avfargingsmiddel og kontrastfarge 23

24 Gram framgangsmåte Førde a) Slåpåavtrekket over vasken. Bruk hanskar. b) Det fikserte preparatet fargast med krystallfiolett i 1 2 minutt. c) Skyll under rennande vatn d) Beis med Jod Jodkalium i 1 2 minutt. e) Skyll raskt under rennande vatn. f) Avfarg med alkohol 96% inntil der ikkje kan vaskast ut meir farge. g) Skyll under rennande vatn. h) Kontrast farging med safranin i 1 minutt. i) Skyll under rennande vatn. j) Lufttørkast (evt. med filtrerpapir). 24

25 Gram farging en.wikipedia.org 25

26 Biokjemisk bakgrunn Krystallfiolett bind seg til sure grupper på bakteriane Krystafiolett og jod dannar svartblå presipitat Hos Gram negative let presipitata seg trekke ut med alkohol, hos Gram positiv ikkje Skuldast ein vesentleg skilnad i celleveggstrukturen (permeabilitetsteorien) Sannsynleg: Alkoholen dehydrerer det tjukke peptidoglykanlaget hos Gram positive slik at krystallfiolettjodid komplekset ikkje kan vaskast ut med alkohol. Alternativt: Alkoholen trenger ikkje inn gjennom Grampositiv cellevegg 26

27 Gramnegativ Grampositiv Lipoprotein Yttermembran Septum Mesosom Cytoplasma Inklusionskropp Nukleoid Ribosom Innermembran Cellvägg Kapsel Grampositiv Gramnegativ Fixering Flagell Pili Flagell Kristallviolett Jod / Lugol Gramnegativ cellkapsel Porin protein LPS Fosfolipid Grampositiv cellkapsel Teikonsyra Lipoteikonsyra Yttermembran Protein Avfärgning Tunn cell vägg Lipoprotein Periplasma Peptidoglykan Tjock cell vägg Motfärgning (safranin) Fosfolipid Innermembran Protein Cytoplasma

28 Kommentarar til dei enkelte trinn i Gram farginga Krystallfiolett Tid 15 sek 5 min OK Jod jodkalium IIK blir sur ved henstand, som kompromitterer funksjonen. Mengda reaktivt jod fell til 40% av opprinnelege på 30 dagar. Tid 15 sek 5 min OK Viktig at alkohol og skyllevatn ikkje blandast. 60% alkohol avfargar sterkare enn abs. alkohol (eller 95%). Metanol avfargar svært raskt, så også aceton. 28

29 Kontrastfarging 0,25% safranin kan erstatte jod fargesoffkomplekset i Gram positive bakteriar på ½ time. 1 min er blitt tilrådd Vaskeprosedyrar mellom dei enkelte trinn Etter krystallfiolett. Kun kort (5 15 sek.) Etter IIK: Risikofritt Etter sprit: Kun kort (5 sek.) Etter safranin: Kun kort (5 sek.) 29

30 Andre faktorar av betydning for Gramfarging Alder på kulturen Yngre kulturar (<24 t) er kraftigast Gram pos Eldre (3 d): Mange Gram pos misser fargen Antibiotikabehandling Gram pos frå antibiotikabeh pas kan ha skadde celleveggar og framtre som Gram neg. For kraftig varmefiksering Gram pos framtrer som Gram neg Tjukke preparat Vanskeleg å avfarge Fysisk skade av bakteriane (td. mot kanten av anna objektglas) Gram positive framtrer som Gram neg 30

31 Gram variabilitet Sjåast ofte hos Bacillus spp., Clostrium spp., Gardnerella Venteleg samanheng med tjukkleiken av peptidoklykan laget textbookofbacteriology.net 31

32 Praktiske modifikasjonar Manuelle variantar På flattliggande objektglas over vask I kar med fargevæske Automatisert Automatisk flytting av preparat frå kar til kar Spraying av farge 32

33 Gram konfirmasjon Påvising av aminopeptidaser i celleveggen hos Gram negative APNA K915 disks (L alanine p nitroanilide in Tris buffer) (Key Scientific products) Gram Sure (L alanine 7 amido 4 methycoumarin) (Remel) som reagens impregnerte lappar. KOH stringtest Skal kunne skilje mellom Gram positive og Gramnegative, men er erfaringsmessig lite påliteleg 33

34 Syrefast farging Koch 1882: Farga tuberkelbakteriar i vev i alkalisk opplysning av metylenblått, fargetid nesten 1 døgn. Forkorta til ½ 1 time ved oppvarming til 40 O C. Kontrastfarge med vesuvin. Ehrlich 1882: Alkoholisk fuksin eller metylfiolett. Avfarging med salpetersyre, kontrastfarge med gult eller blått. Ziehl (1882, 1883): metylfiolett, metylgrønt, fuksin i karbolsyre (fenol) oppløysing. Raskare ved oppvarming. Neelsen (1883): fuksin i karbolsyre oppløysing (karbolfuksin), avfarging med 25% svovelsyre = Ziehl Neelsens fargemetode 34

35 Framgangsmåte ZN Førde a) Bruk hanskar. Heile prosedyren utførast i avtrekk over vasken. b) Det fikserte preparatet dekkast med eit tilpassa filtrerpapir. Det hellast på konsentrert karbolfuksin. Dette haldast over flammen til det dampar av preparatet. NB. Unngå koking. La preparatet ligge med farge på i ca. 5 minutt. Avkjølast. Filtrerpapiret fjernast. c) Skyll av med vatn d) Avfarging med saltsyrealkohol til all raudfargen er gått av. e) Skyll av med vatn. f) Kontrastfarg med malakittgrønt i 30 sekund. g) Skyll av med vatn. h) Tørkast. 35

36 Modifikasjonar av ZN «Kald» ZN Kinyouns metode Sterkare konsentrasjon av karbolfuksin, utan oppvarming Er rapportert å vere mindre sensitiv Tilsetjing av oppløysingsmiddel eller detergensar til karbolfuksin Ulike kontrastfargar pikrinsyre (gul) metylenblått malakittgrønt Avfarging med suksessivt syre > etanol, eller med etanol + syre i blanding 36

37 Bruk av fluorescerande fargar auramine O aleine eller i kombinasjon med rhodamine B Fordelar Mykje kortare avlesingstid Ikkje trong for å varme preparatet Ikkje meir komplisert enn vanleg ZN 37

38 FIG. 1. Mycobacterium tuberculosis (5). ry test/2870 acid fast stain protocols M. tuberculosis, Auramine Rhodamine _micro_img/images/mtb_auramine_rhod.jpeg roduct=63 38

39 Biokjemisk bakgrunn Mykobakteriar og andre syrefaste: Høgt innhald av lipid i celleveggen, spes. mykolsyre Utgjer barriere både for farging og avfarging 39

40 Modifisert Ziehl Neelsen Svakare avfarging, kun med (svakare) syre Fargar delvis syrefaste organismar, som Rhodococcus spp, Nocardia spp, Legionella micdadei, og cyster av Cryptosporidium, Isospora, Cyclospora, og Microsporidium sporar 40

41 Acridine orange Nukleinsyreselektiv fluorescerande kationisk farge, med mange bruksområde i biologi. Penetrerer celler, og interagerar med DNA og RNA ved høvesvis interkalering og elektrostatsike krefter. Ved sur ph får bakteriar oransje fluorescens, mens celler får grøn Göran Kronvall ning_mini Review.pdf 41

42 Bruksområde AO Screening for bakteriar av materiale med mogleg få bakteriar Blodkultur, cornea avskrap, spinalvæske Kan fargast i Gram etterpå 42

43 Flagellefarging Loeffler Beising før eller samtidig med farging Tannin, o.l. Metylenblått, fuksin eller metylfiolett Dei tynne flagellene blir tjukke nok til åbli synlege i lysmikroskop 43

44 Leifsons flagellefarging Buljongkultur Spesialt rensa objektglas Basisk fuksin + tannin Omstendeleg prosedyre Flagelleanordning Polart monotrik Polart multitrik Peritrik Subpolart Blanda 44

45 Sporefarging Wirtz Conklin sporefarging (= Schaeffer Fulton farging) Dekk preparatet med 5 10% vandig malakitt grønt 45 min Evt. under oppvarming (som ZN) i 3 6 min Skyll med vatn Kontrastfarg med vandig safranin (0,5%) i 30 sek. Skyll og tørk Nyttig for identifikasjon av Bacillus og Clostridum spp (i følgje litteraturen) 45

46 Bilete: Wikipedia Bacillus_subtilis_Spore.jpg 46

47 HMS I dei fleste kjemikalie datablad tilrådd: «God ventilasjon» Unngå kontakt med augene Farleg ved innanding, hudkontakt og svelging Bruk eigna verneklede og hanskar Nokre er brannfarlege Fleire er skadelege for «vannlevende organismer» 47

48 Døme datablad krystallfiolett 48

49 Døme datablad karbolfuksin 49

50 Konklusjon HMS Det er rimeleg å utføre fargeprosedyrane i avtrekk Bør helst unngå utslepp i avløp Konf. «Grønt sjukehus» ISO

51 Spørsmål og kommentarar? 51