RAPPORT fra prosjektet. «Konseptbevis genetisk sporing av rømt laks»

Transkript

1 RAPPORT fra prosjektet HELSE: LANDBRUK: Helsetjenester og helserelaterte Landbruksbasert næringer matog biomasseproduksjon «Konseptbevis genetisk sporing av rømt laks» 25. januar-2013

2 Innhold 1. Sammendrag av rapporten Bakgrunn og prinsipp for DNA-sporing Prosjektplanen Resultat Diskusjon og konklusjon Økonomirapport

3 1. Sammendrag av rapporten Prosjektets formål har vært å validere eller føre bevis for at DNA sporing fungerer i praksis, og fremskaffe beslutningsunderlag for bransjen i vurderingen av sporingssystemer. Hovedprinsippet for foreldrebasert DNA-sporing, som beskrevet i vår rapport av 14. september 2011, er å kombinere en genotypedatabase av matfiskforeldre med styrt logistikk av genetisk unike rognbatcher fra disse gjennom klekkeri/settefiskleddet og fram til matfiskoppdretter. Dette konseptet vil kunne spore en enkelt rømt fisk tilbake til oppdrettslokalitet ved å genotype rømling med samme sett av genetiske markører som anvendt ved opprettelse av genotypedatabasen av foreldre. Prosjektet har tatt utgangspunkt i et utsnitt av verdikjeden (et begrenset antall aktører av 1 stamfiskaktør og 3 klekkeri/smoltprodusenter) og den tilhørende genflyten fra avlskjerne/stamfisk via klekkeri/settefisk/smoltanlegg til matfiskoppdretter. Man har samlet prøver fra et begrenset antall stamfisk som er foreldre til genetisk unike rognpartier som går videre i verdikjeden. Aqua Gen har produsert rogn til 3 kunder, og ved hjelp av produksjonsstyringsprogrammet til Aqua Gen kan vi spore disse leveransene tilbake til stamfisk som er opphavet til rogna. El-sporingen i klekkeri/settefiskleddet utføres vha AKVA Groups system: Fishtalk. Konseptbeviset går ut på å kople yngel hos settefiskanlegg til stamfisk og rognbatch fra Aqua Gen ved å sammenligne genotyper på yngel med genotypene hos potensielle foreldre. Sporing til riktig foreldre vil da gi oss mulighet for å spore yngelen til riktig klekkeri. En av klekkeri/settefiskkundene vil, til tross for rutiner med blanding mellom batcher og innlegg, holde grupper av fisk adskilt helt til sjøsetting av smolt som har unike opphav med hensyn til mor. Dette vil gi oss muligheten for i praksis å teste DNA sporing til anlegg hos matfiskoppdretter. Genotyping med tilhørende tilhørighetsanalyser (kobling av avkom («rømling») til unikt foreldrepar) basert på SNP-markører er utført ved Cigene, UMB og tilsvarende analyser basert på mikrosatellitter er utført av GenoMar AS. Grunnet dårlig kvalitet av prøvematerialet og degradering av DNA kunne enkelte prøver ikke analyseres. Av de yngelprøvene som kunne analyseres og kobles til foreldre så treffer SNP-basert sporing 98% (221/226) og mikrosattelitt-basert sporing 99% (216/217) til riktig rognbatch/foreldre. Dette er overraskende høy treffprosent tatt i betraktning at markørantallet i eksperimentet er ca 1/3 av det teoretisk anbefalte (SNP 60 mot anbefalt 150, mikrosatellitter 16 mot anbefalt ca 50) og at man ikke har noen informasjon om individuelle krysninger mellom foreldre. Med referanse til punktene fremmet av Miljøfondet i tilsagnsbrevet og resultatene fra dette eksperimentet vil man måtte sette følgende forutsetninger for sikker rutinemessig installasjon av DNAbasert sporing i lakseindustrien: o Opprettholdelse av unike genetiske batcher fra stamfisk, gjennom klekkeri og settefiskanlegg til matfiskoppdretter, full el-sporing av logistikken. Dette vil medføre tilpasning av rutinene i klekkeri og settefiskleddet. o Anvendelse av tilstrekkelig antall genetiske markører i genotypingen vil øke styrken (treffsikkerheten og robustheten). o Både vår teoretiske analyse i rapporten av sept og det gjennomførte konseptbeviset viser at DNA-metoden ikke trenger mer enn én fisk for å spore til riktig foreldrepar og dermed fram til oppdrettslokalitet forutsatt ovenstående betingelser er på plass. Dette er nettopp styrken med foreldrebasert DNA-sporing i motsetning til sporing basert på populasjonsprint: man kan spore enkeltfisk og dermed også fange opp «drypprømming». Ved at flere rømlinger genotypes økes sikkerheten ytterligere for kopling til riktige foreldre. o Det anbefales at vevsprøvene legges rett på etanol i stedet for innfrysing, da dette vil redusere DNA-degraderingen til et minimum. 3

4 Forsøket har demonstrert at ved å kombinere DNA-basert tilhørighet mellom avkom (potensiell «rømling») og foreldre koblet med styring av unike batcher fra stamfisk til matfiskanlegg gir oss mulighet til sikker DNA-basert sporing av rømt oppdrettsfisk til matfiskoppdretter. Sikker operasjonalisering i praksis krever oppfyllelse av forutsetningene listet ovenfor. Prosjektgruppen har bestått av: Aqua Gen - Sissel Kjøglum (prosjektleder) Tel: sissel.kjoglum@aquagen.no BioBank Sigbjørn Gregusson Cigene - Sigbjørn Lien AKVA Group Softwares Einar Helsø Rognkundene: K.J. Eide Anders Jan Rød Hyen Rasmus Ommedal Smolten Eirik Welde Marelife (koordinator for prosjektet) - Øystein Lie. Tel: oystein.lie@marelife.org 2. Bakgrunn og prinsipp for DNA-sporing Fiskeri- og havbruksnæringens landsforening (FHL)s vedtok i april 2011 å øke satsingen på et miljømessig bærekraftig havbruk, der et av tiltakene var å forsterke innsats mot rømming. I denne sammenheng er ulike metoder knyttet til merking og sporing av fisk et sentralt tema. MareLife sammen med en ekspertgruppe fikk i oppdrag å utrede muligheten for og implikasjonene av DNA-basert sporing til matfiskanlegg. Ekspertgruppen hadde representanter fra produsentene, innsatsleverandørene og FoU-miljøene: AquaGen, Marine Harvest, BioBank, AkvaGroup, Lerøy Settefisk Vest, Rauma-Gruppen, SalmoBreed, UMB/Cigene, Nofima, Havforskningsinstituttet, Universitetet i Agder og NVH. Utredningen ble avsluttet med en rapport levert til FHL 14. september, Rapportens hovedfunn, konklusjoner og anbefalinger var: Ved å kombinere DNA-basert tilhørighetsanalyse (foreldre vs avkom) med informasjon om logistikk, er det mulig på en kostnadseffektiv og sikker måte å spore rømt oppdrettsfisk til klekkeri og i de aller fleste tilfeller til matfiskanlegg. Sikker eliminasjon av matfiskanlegg blant potensielle mistenkte kandidater, er mulig på samme grunnlag. Dette er viktig å presisere da dette er en sentral problemstilling for næringen. Sikker genetisk sporing direkte til matfiskanlegg er også mulig forutsatt systemoptimalisering på klekkeri- og settefiskleddene. Hovedprinsippet for DNA-sporing, slik det også fremgår av nevnte utredning, består av to komponenter: 1) DNA-database av foreldre. All stamfisk (matfiskforeldre, på sikt tusen årlig) tas prøve av og DNA-types med genetiske markører (SNP eller mikrosatellitter). Det etableres adekvat elektronisk sporingssystem hvor foreldreidentitet kobles til prøven som går til DNA-typing. Samme identitet kobles til rognsylinderen som inneholder avkommet som sendes til klekkeriet. 2) Logistikk-styring og el-sporing. Genetisk unike rognbatcher produseres og sendes til klekkeri/smoltprodusent. Man sørger for systemer og rutiner for el-sporing i to kritiske ledd: 1) stamfisk/rognprodusent og 2) klekkeri/settefisk/smolt-leddet. Hvert klekkeri får unike genetiske leveranser (rognsylindere) fra rognprodusenten (ingen overlappende foreldre). Tilsvarende er tilfelle med leveransene fra smoltprodusenten til matfiskleddet. Man kan opprettholde sikker sporingskraft selv om ikke begge foreldrekjønn er unike for hver leveranse. For praktiske formål bruker man gjerne hanfisk på tvers av leveranser, mens hunfisk er unik for hver leveranse eller batch. 4

5 3. Prosjektplanen Prosjektets formål. Validere eller føre bevis for at DNA - sporing fungerer i praksis. Fremskaffe beslutningsunderlag for bransjen i vurderingen av sporingssystemer. Sammenfattet prosjektbeskrivelse. Prosjektet tar utgangspunkt i et utsnitt av verdikjeden (et begrenset antall aktører) og den tilhørende genflyten fra avlskjerne/stamfisk via klekkeri/settefisk/smoltanlegg til matfiskoppdretter. Man samler prøver fra et begrenset antall stamfisk (noen hundre) som er foreldre til rognpartier som går ut til industrien. Vi ønsker å finne ut om vi kan spore anonymisert yngel til riktig foreldre basert på SNP genotyping etter prinsipper og krav som ble beregnet i rapporten av 14. september (vedlegg1). Cigene har utviklet et sett med SNPer som vil bli brukt til dette. Sporing til riktig foreldre vil sammen med El-sporing gi oss mulighet til å spore til riktig klekkeri og potensielt til riktig oppdrettsanlegg når disse har fått unike genetiske leveranser. Aqua Gen produserer rogn som distribueres til 3 kunder. Ved hjelp av produksjonsstyringsprogrammet til Aqua Gen kan leveransene spores tilbake til stamfisk som er opphavet til rogna. El-sporingen i klekkeriene utføres vha AKVA Groups system: Fishtalk. Konseptbeviset går ut på å spore yngel hos settefiskanlegg til stamfisk og rognbatch fra Aqua Gen ved å sammenligne genotyper på yngel med genotypene hos potensielle foreldre. Alle prøvene som analysers blir blindet. En av klekkeri/settefiskkundene vil holde grupper av fisk adskilt helt til sjøsetting av smolt for to partier som har unike opphav med hensyn til mor. Dette vil gi oss muligheten for i praksis å teste DNA sporing til hele veien til matfiskoppdretter. Prosedyrer, protokoller og andre verktøy. Aqua Gen, BioBank og CIGENE lager protokoller for henholdsvis prøvetaking, DNA-isolering, genotyping og tilhørighetsanalyse (software). Sistnevnte software var i bruk under utredningen (rapporten av 14. sept. 2011) og forventes å kunne brukes med mindre modifikasjoner til dette prosjektet. SNP-markørsettet forventes også å være klargjort med høyde for visse tilpasninger. AKVAGroup lager protokoller for datafangst på klekkeri/settefisknivå med tilsvarende tilpasning til sitt softwaresystem FishTalk. 5

6 Andre forhold samarbeidende prosjekter Det er tenkt at dette prøvematerialet også skal benyttes til en av arbeidspakkene i de FHF finansierte DNA sporingsprosjektene FHF# og FHF# til Nofima og NVH. I denne arbeidspakken skal et stort antall foreldrefisk samles inn fra flere rognprodusenter for å validere slektskap i produksjon av salgsrogn. Økonomi (Søknadsbeløp spesifisert på aktiviteter) Kommentar Beløp Prosjekt adm. Inkl rapportering Prøvetaking 500 stamfisk og 400 yngel DNA isolering og lagring 500 stamfisk og 400 yngel Genotyping 500 stamfisk og 400 yngel Protokoller og slektskapsbestemmelse El-sporing + ekstra logistikk fram til smolt Oppfølging av settefisk/smolt Totalt Resultat Rognproduksjon, merking av forelderspesifikke batcher og innsamling av vevsprøver Under stryking, ble det samlet inn vevsprøver (muskelbiopsi) fra all stamfisk som ble brukt til å produsere rogn til de tre deltagende settefiskanlegg. Kopling mellom stamfisk og vevsprøve ble registrert og vevsprøven ble sendt til BioBank AS for ekstraksjon av DNA. Figur 1: Prøverør med 2D-kodet ID og med biopsi fra stamfisk. Rogn ble inkubert i sylindre slik at hver sylinder med rogn var unik mhp hunfisk. Hannfisk ble brukt flere ganger, så for fedrene var det overlapp og batcher med rogn var ikke unike mtp fedre. I hver batch med rogn har vi også oversikt over hvilke foreldreparringer som er gyldige. Vi kjenner ikke slektskapet mellom foreldrene, men kan anta at det er hel- og halvsøsken blant foreldrene som kan komplisere jobben med å assigne avkom til riktig foreldre. Ingen flytting eller sortering ble gjort før rogna gjennomgikk sjokking og sortering før pakking til kunde. I disse operasjonene ble det ikke blandet rogn fra forskjellige sylindre, slik at rogn fra en hunfisk ikke ble sendt til to kunder. Dette medførte at unike mødre kunne bli koplet til hver ordre. Fedre som var brukt til produksjon av disse ordrene ble også registrert Ved ankomst til kunde ble disse rognleveransen lagt inn med ordrenummer som dannet grunnlaget for den videre sporingen hos settefiskprodusenten. Ved startfôring var fiskene så store at det var mulig å få ut tilstrekkelig med vev for DNA-ekstraksjon. Det ble samlet inn vevsprøver fra 93 yngel pr anlegg, og disse ble også sendt til BioBank AS. Isolering av DNA Vevsprøvene ble tatt ut ved hjelp av et lite biopsi-instrument som gir vevsbiter av tilnærmet lik størrelse og vekt. Hver vevsprøve ble lagt tørt i separate prøverør med skrukork og fraktet kjølig i brett à 96 rør til BioBank AS for DNA-ekstraksjon. Vevsbitene ble først fordøyd i rørene ved bruk av enzym før DNA blir isolert med DNeasy 96 Blood & Tissue Kit (Qiagen #69582). Dette er et system som 6

7 isolerer DNA ved hjelp av bufferløsninger som feller og vasker DNA i filterbrett som sentrifugeres gjentatte ganger. Denne metoden gir et godt og stabilt utbytte av intakt genomisk DNA i tilstrekkelig konsentrasjon så lenge utgangsmaterialet har god kvalitet. Konsentrasjon av alle prøver er målt spektrofotometrisk på Nanodrop ND-8000 (Thermo Scientific). SNP- typing og assignment-prosedyre CIGENE har utviklet et panel med SNP for slektskapskontroll som ble brukt til å assigne avkom til foreldre i dette materialet. Panelet består av 60 SNPer som ble selektert fra et utvalg på 6000 tilgjenelige SNPer. Disse utvalgte SNPene ble funnet informative ut fra 756 prøver fra 3 norske avlsprogram på laks (MOWI, Salmobreed og Aqua Gen), fordi de er polymorfe i alle tre populasjonene og er jevnt fordelt på koplingsgruppen. Det er også inkludert 3 mitokondrielle SNPer for kvalitetssikre kopling til mor. Genotyperingen er utført med MassArray 4 instrument (Sequenom). Dette instrumentet støtter PLATINUM assay teknologi, som gjør det mulig å kjøre genotypering for alle 60 SNPene i en reaksjon. Software for assigment ser først etter umulige Mendelsk nedarvinger for å eliminere foreldre-avkom koplinger som ikke eksisterer. Deretter identifiserer programvaren mulige foreldreparringer blant de gyldige foreldre i steg 1, og eliminerer parringer av foreldre som ikke vil gi avkom med den gitte SNPgenotypen. Mikrosatellitt typing og assignment-prosedyre Til genotypingen ble det brukt totalt 16 mikrosatelitt markører, henholdsvis 9 og 7 markører i hver sin multiplex. DNA kvailitet og mengde ble undersøkt ved bruk av elektroforese på 1 % agarose geler og Nanodrop (Thermo Scientific). Primere ble merket med fluorescens farge (enten FAM eller Hex) og PCR amplifikasjon av mikrosatelliter ble utført på T-100 thermal cyclers (Bio-Rad,Hercules, USA). PCR produktene ble separert med sekvensator ABI3730xl (Applied Biosystems, Foster City, USA), og mengde av PCR-produktet ble analysert med GeneMapper (Applied Biosystems, Foster City, USA). Kopling mellom foreldre og avkom er utført med å eliminere foreldre-avkom koplinger som ikke eksisterer mellom de to generasjonene. Resultater fra genotyping og assigments Det ble tatt prøver fra totalt 279 avkom som ble blindet og oversent til DNA isolering og genotyping vha henholdsvis SNP-panel eller mikrosatelitter. En del av prøvene var av en slik kvalitet at de ikke lot seg assigne. Henholdsvis 53 av prøvene til SNP analysene og 62 av prøvene til mikrosatelitt analysene var ikke assignbare grunnet dårlig prøvekvalitet og degradering av DNA. Antall avkom=279 SNP Mikrosatelitter Assignet til unike foreldre Ikke assignet til foreldre eller assignet til flere foreldre Assignet til riktig rognbatch Assignet til feil rognbatch 5 1 Antall assignet til samme foreldre med begge metoder 202 Sporing til foreldrespesifikk (hunndyrspesifikk) batch. Ser vi bort fra avkom som ikke kunne kobles til foreldre, så treffer hhv 98 % (221/226) og 99 % (216/217) riktig rognbatch basert på de to metodene SNP og mikrosatellitter. 7

8 Sporing til klekkeri. Siden de hunfisk-spesifikke batchene er sendt til ulike klekkerier (ingen batch er sendte til flere klekkerier), er sporing til riktig batch også sporing til korrekt klekkeri med ovenfor beskrevne treffsikkerhet. Sporing til matfiskoppdretter Konkret ble dette utført ved at Smolten AS fikk en rognleveranse på ca 2.8 mill rogn, og produserte ut fra dette yngel og 1.8 mill smolt. Rognleveransen ble lagt inn som 3 enheter i FishTalk, hvor 4 sylindre ble lagt inn som 2 enheter og en sylinder pluss en mix av alle sylinderne ble lagt inn som 1 enhet (tabell 2). Gjennom produksjon fram til smolt klarte de å holde en enhet ren i en gruppe på smolt fra enhet LM212b som ble satt ut på en lokalitet. I resterende gruppe på smolt er det blanding av de forskjellige enhetene, og disse er satt ut på forskjellig lokaliteter. Smolten AS har holdt yngel og smolt fra en rognbatch adskilt gjennom hele settefiskfasen (der de normalt blander ulike batcher, pga. behov for sortering etter størrelse, kvalitet etc) fram til sjøsetting av smolt. Logistikken av fisk kontrolleres med FishTalk, og med denne programvaren vil det være mulig å følge denne batchen fra innlegging av rogn til smoltutsett. Eksempelvis er avkom med ID i vårt eksperiment assignet til korrekt batch via sylinder 1427, ved at den er assignet til en unik mor 4486 (og far 0413C9584A) som kun er til denne sylinderen. Forutsatt at sylinder 1427 ikke inngår i andre enheter så er dermed fisk genetisk verifisert (sporet) fram til oppdretter som har mottatt settefisk fra enhet LM212b (Tabell 2). «Rømling» er dermed sporet til oppdretter med fisken fra enhet LM212b. Tabell. 2. El-sporing av batch Y fra stamfiskstasjon til farm: Sylinder Antall rogn ID på enhet i FishTalk hos Smolten LM212a LM212a LM212b LM212b LM212c mix av flere sylindre LM212c Totalt Diskusjon og konklusjon Det er dokumentert høy treff-prosent blant de prøvene som har blitt assignet. Fem av 226 (2 %) feil er funnet blant de som er assignet med SNP mens for mikrosatelitter er det kun 1 av 217 kopling (0.5 %) som er feil i forhold til logistikken. Sammenlikner vi de to metodene med SNPer og mikrosatelitter, er det 202 avkom som er koplet til samme foreldrepar. Av de som ikke er koplet til samme foreldrepar med begge metodene, har ca. 80 % kopling til lik far eller mor mens kopling til den andre av foreldrene er forskjellig. Det var ca 20 % av prøvene som ble analysert lot seg ikke assigne til foreldre. Årsaker til dette er mest sannsynlig dårlig prøvekvalitet og degradert DNA. Alle vevsprøvene som inngikk i dette forsøket ble fryst uten å bli lagt i noe lagringsmedium. Det er nå etablert en bedre metode hvor prøvene lagres i etanol. Dette medfører at vevsprøver holder seg bedre og ekstrahert DNA blir mer stabilt under lagring. For optimalisering av prøvetaking og DNA-isolering viser vi til arbeidspakke 1 i de FHFfinansierte prosjektene FHF og FHF ( 8

9 Resultatene viser at % av avkom kunne kobles til unike foreldre og spores til korrekt klekkeri via korrekt morspesifikk rognbatch. For delforsøket som ble utført i samarbeid med Smolten ble det demonstrert at vha intern sporingssytem kunne sporingen føres helt frem til matfiskoppdretter. Resultatene er lovende, spesielt med tanke på at det er anvendt et SNP- og mikrosatellittantall på ca 1/3 av det optimale (hhv 50 og 16 mot optimalt hhv 150 og 50) og at ingen individuell krysning er kjent (i motsetning til i avlskjernen der man har alle pedigree-detaljer). Man kjenner identiteten til hvert dyr i foreldrepanelet av hun- og hanfisk, men hver sylinder/batch har blandet befruktet rogn fra en rekke hundyr og noen færre hanfisk. Hver sylinder er dog hunspesifikk, og hanfiskene brukes ikke over alle sylindre slik at assigning til unik foreldrepar gir mulighet for treff på riktig sylinder. Med referanse til punktene fremmet av Miljøfondet i tilsagnsbrevet og resultatene fra dette eksperimentet vil man måtte sette følgende forutsetninger for sikker rutinemessig installasjon av DNAbasert sporing i lakseindustrien: o o o o Opprettholdelse av unike genetiske batcher fra stamfisk, gjennom klekkeri og settefiskanlegg til matfiskoppdretter. Dette vil kreve full el-sporing av batchene bla ved at intern el-sporing hos stamfiskaktør kobles til klekkeri/settefisk-leddet (FishTalk etc). Dette vil som vår tidligere utredning har påpekt også medføre tilpasning av dette til rutinene i klekkeri og settefiskleddet. Det må derfor lages en IT eller el-spor kravspesifikasjon som tar høyde for disse betingelsene. Anvendelse av større antall genetiske markører i genotypingen vil øke styrken (treffsikkerheten og robustheten). Dette eksperimentet brukte 50 SNP og 16 mikrosatellitter (2 multiplexer à 9 og 7 mikrosatelitter), mens det optimale etter våre teoretiske simuleringer (se vedlagt artikkel) er SNP og 50 mikrosatelitter. Både vår teoretiske analyse i rapporten av sept og det gjennomførte konseptbeviset viser at DNA-metoden ikke trenger mer enn én fisk for å spore til riktig foreldrepar og dermed fram til oppdrettslokalitet forutsatt ovenstående betingelser er på plass. Dette er nettopp styrken med foreldrebasert DNA-sporing i motsetning til sporing basert på populasjonsprint. Man kan spore enkeltfisk og dermed adressere det viktigste nemlig «drypprømming», herunder funn av enkelt fisk fra vassdrag. Ved at flere rømlinger genotypes økes sikkerheten for å identifisere riktig foreldre riktig matfiskanlegg. Hvis slektskapstesting av alle (antall N) rømlinger peker mot same oppdretter, er sannsynligheten for at dette er tilfeldig gitt ved følgende formel α 2N. Variablene α er sannsynligheten for falske koplinger mellom foreldre og avkom, og faktor 2 er utfra at alle har 2 foreldre. Sannsynligheten for falske koplinger er en gitt ved en LOD score regnet ut fra antall potensielle foreldre og antall SNPer. Meuwissen viser i rapporten av sept at α= i tilfeller med stamfisk og 75 SNP til slektskapsanalyser. Det anbefales også at vevsprøvene legges rett på etanol i stedet for innfrysing, da dette vil redusere DNA-degraderingen til et minimum. Forsøket har demonstrert at ved å kombinere DNA-basert tilhørighet mellom avkom (potensiell «rømling») og foreldre koblet med styring av unike batcher fra stamfisk til matfiskanlegg gir oss mulighet til sikker DNA-basert sporing av rømt oppdrettsfisk til matfiskoppdretter. Sikker operasjonalisering i praksis krever oppfyllelse av forutsetningene listet ovenfor. 6. Økonomirapport Det vil bli levert et revidert prosjektregnskap senest innen 2 mnd etter avlevering av denne fagrapporten. 9