Regulering av eukaryotisk cellesyklus- Kap. 13

Transkript

1 Regulering av eukaryotisk cellesyklus- Kap. 13 Tor-Henning Iversen, Plantebiosenteret (PBS),Botanisk institutt,ntnu Tor-Henning.Iversen@chembio.ntnu.no Tlf PBS`s hjemmeside (hvor forelesningene er samlet) ;

2 Emner som gjennomgåes i dette kapittelet Oversikt over cellesyklus og dens kontroll Skjematisk oversikt over syklusen Reguleringsmekanismer i syklus Eksperimenter for påvisning av kontroll-proteiner i syklus Biokjemiske studier av utvikling hos frosk Modningsfaktorer (MPF) i oocyter (eggcelle i utvikling) Cyclin B-nivåer og MPF Nedbrytning av cykliner Genetiske studier av gjærceller Mutasjoner og modningsfaktorer i gjærceller Regulering av MPF kinase aktivitet Molekylære mekanismer for regulering av mitose Laminer og nedbrytning av kjernemembranen Start av anafase Fosfatase-aktivitet for gjendanning av kjernemembran og cytokinese

3 Emner som gjennomgåes i dette kapittelet Genetiske studier av gjærceller (kun overfladisk gjennomgang) Saccharomyces cerevisiae Cdc28 G 1 cykliner og Cdc28 - start på S-fase Nedbrytning av S-fase inhibitor og DNA-replikasjon Multiple cykliner styrer kinaseaktivitet Celle-syklus kontroll i dyreceller Multiple Cdk og cykliner regulerer dyrecellesyklus To gen-klasser og deres uttrykk Passasje gjennom restriksjonspunkter Cyclin A gir DNA-syntese - Cdk1 mitose Cyklin-kinase inhibitorer medvirker i cellesyklus-kontroll Sjekkpunkter i reguleringen av cellesyklus Ikke-replikert DNA hindrer mitose Uregelmessig samling av mitotisk spindel stopper anafase Betydning av tumor- og cyklin-kinase hemmere

4 Oversikt over cellesyklus og dens kontroll Innledning Regulering av cellesyklus er kritisk for normal utvikling - manglende kontroll gir kreftcelleutvikling Celle-replikasjon er styrt av riktig timing av kjerne DNA-replikasjon og mitose Hovedkontrollen skjer vha heterodimere protein kinaser -med en regulatorisk og katalytisk underenhet Kinasene regulerer aktiviteten av multiple proteiner - som deltar i DNA-replikasjon og mitose - ved forsforylering på bestemte regulatoriske seter. Skjematisk oversikt over syklusen Cellesyklus består av 4 hoveddeler (Figure 13-1) : S-fasen (DNAsyntese og replikasjon av kromosomer) G 2 -fasen M-fasen (start av mitosen- profase, metafase, anafase, telofase) G 1 -fasen (perioden før DNA-syntesen starter i S-fasen) Postmitotiske celler kan gå over i en G 0 -fasen - en hvilefase - før de evt. går over i S- fasen

5 Oversikt over cellesyklus og dens kontroll (forts.) Reguleringsmekanismer i syklus Cykliner (regulatoriske underenheter) og deres katalytiske underenhet cyklinavhengige kinaser (Cdk) i de heterodimere protein kinaser er ansvarlige for reguleringen av syklus. CdkC=Cyclin-dependent kinase Complexes Tre klasser av Cdk kontrollerer de ulike trinn i syklusen - G 1 -, S-fase og mitotiske Cdkkomplekser (Figure 13-2) Detaljer i trinnene 1-10 omfatter - i tillegg til de tre Cdk-klasser - S-fase-inhibitorer, pre-replikasjonskomplekser og anafase-promoterende-komplekser (APC). Figure 13-2 er viktig og detaljene må læres. I høyere organismer oppnås kontroll av cellesyklus ved regulering av G 1 -Cdk komplekser. Syntesen av disse skjer ved ekstracellulære vekstfaktorer = mitogener. Når den først er aktivisert av mitogenene fortsetter cellesyklus gjennom mitose - selv om mitogene forsvinner. Det kritiske trinnet i sen G 1 -fase hvor ikke mitogener lenger trenges, kalles restriksjonspunktet.

6 Oversikt over cellesyklus og dens kontroll (forts.) Eksperimenter for påvisning av kontroll-proteiner i syklus Mikroskopisk lett gjenkjennelige og temperatur-følsomme mutanter av to arter av gjærceller - S. cerevisiae og S. pombe - som respektivt formeres ved knoppskyting og fisjon, har vært av betydning for klarlegging av kritiske reguleringstrinn i cellesyklus. Mutanter av S. cerevisiae med en cellesyklus-defekt kalles cdc(cell-division-cycle)- mutanter (Figure 8-9). Tilsvarende vil S. pombe danne sterkt forlengete cdc- og weemutanter som er lett gjenkjennelige pga morcellen sin korte form. I Figure 13-4 er vist den eksperimentelle basis for reguleringstudier av cellesyklus ved transformasjon av cdc-mutanter. Også biokjemiske analyser av celle-ekstrakter av egg og tidlige embryoer av bl.a amfibier, gir mye kunnskap om regulering av cellesyklus.

7 Biokjemiske studier av utvikling hos frosk Innledning Studier av oocyter dvs. eggceller i utvikling hos frosk og de faktorer som bestemmer inngang til mitose, har vært avgjørende for kunnskap ervervet om cellesyklusregulering. For å forstå eksperimentene må man ha kunnskap om froskeeggenes utvikling i ovariene via en DNA-arrestert G 2 -vekstfase, steroid-hormonet progesteron -->meiose I og II, overgangen til egg og til en diploid zygote hvorfra mitosen starter med utviklingen av tidlig embryogenese (Figure 13-5a). Modningsfaktorer (MPF) i oocyter In vitro-forsøket vist i Figure 13-5 demonstrerer at progesteron induserer dannelsen av en modningsfaktor (MPF). MPF er vist å ha en nøkkelrolle ved starten av mitose i alle eukaryote celler. MPF-nivået i ulike cellestadier er vist i Figure MPF kontrollerer starten av mitosen hos alle somatiske celler - såvel som froskens oocyt-overgang til meiose. MPF kalles derfor også en mitose-promoterende -faktor. MPF er et av de heterodimere komplekser sammensatt av et cyklin og en cyklinavhengig protein-kinase (Cdk) - nå kjent for å regulere cellesyklus (Figure 13-2).

8 Biokjemiske studier av utvikling hos frosk Cyklin B-nivåer og MPF Proteinet cyklin B syntetiseres kontinuerlig gjennom de embryoniske cellesykluser men forsvinner brått ved starten av anafasen. Påvist eksperimentelt at cyklin B er en underenhet i MPF. På basis av observasjoner av dannelse/oppløsning av kjernemembran og kondensering/dekondensering av kromosomer følges parallelliteten i konsentrasjonen av Cyklin B og MPF-aktiviteten (Figure 13-7). Tilførsel av cycloheximide (proteinsyntese hemmer) stoppet syntesen av cyklin B og samtidig økningen i MPF-aktivitet. Figure 13-7 illustrerer også hvordan tilførsel av RNAse, sperm kromatin, WT cyklinb mrna og og ikke-nedbrytbar cyklinb mrna påvirker tidlige (blått på figur; kromosom kondensering/oppløsning av kjernemembran) og sene (orange på figur; kromosom-dekondensering og dannelse av kjernemembran) mitotiske hendelser. I sum kan det sies at proteolyse av mitotiske cykliner - som fører til nedsettelse av MPF-aktiviteten - er et krav for avslutningen av mitosen. Nedbrytning av cykliner Nedbrytningen av de mitotiske cyklinene (cyklin A og B) skjer i destruksjonsbokser (Figure 13-8) hvor ubiquitin,tre typer av enzymer (E1-E3) og proteasomer deltar i en prosess kalt polyubiquitinering.

9 Genetiske studier av gjærceller Mutasjoner og modningsfaktorer i gjærceller Mer kunnskap om MPF og dens regulering kom fra studier av fisjonsgjærcellene Cdc2 i S. pombe med fenotypiske karakter hvor lange celler skal inn i mitose mens korte celler nettopp har avsluttet cytokinese (Figure 13-10). Basis for alle forsøkene er bruk av to grupper av mutanter: 1. cdc (ekstremt lange, deler seg ikke) og 2. wee (mindre enn normale celler) - se Figure En rekke gener er identifisert i begge mutanter; for nomenklatur av villtype-gener (cdc2 + ), reccessive muatsjoner (cdc2 - ) og proteiner (Cdc2 = protein kinase ) kodet for av spesifikke gener- se boken. Mangel på Cdc2 aktivitet forhindrer at mitose igangsettes - overskudd av Cdc2 gjør at mitosen starter tidligere dvs. Cdc2 er en nøkkelregulator for mitose i S. pombe. Funnet at humant cdna koder for et protein identisk med Cdc2 dvs. støtte for antakelsen om at mitose styres av proteiner som er konservert gjennom evolusjonen. cdc2-genet koder for en protein-kinase med homologi til cyklin B i sjøpinnsvin og frosk. Cdc2- proteinet som assosieres med et B-type mitotisk cyklin, kodes for av cdc13 + -genet og danner en heterodimer som er identisk med MPF. Videre undersøkelser av mutantene har vist at MPF-reguleringen i S. pombe skjer ved fosforylering og defosforylering av spesifikke regulatoriske seter (Y15 og T161) i den katalytiske underenhet. For detaljer om reguleringen ved MPF protein-kinase vises til Figure som er en sentral figur når det gjelder regulering ved bruk av MPF. I sum kan det sies at det er to dominerende mekanismer for kontroll av start av mitose : 1. Regulering av konsentrasjonen av mitotiske cykliner (se Figure 13-9) 2. Regulering av aktiviteten av MPF (se Figure 13-13)

10 Molekylære mekanismer for regulering av mitose Laminer og nedbrytning av kjernemembranen En sentral figur som viser de viktigste trinn i mitosen er Figure (s. 824) - kromosom-kondensasjon, dannelse av mitotisk spindel og nedbrytning av kjernemembranen. Disse prosessene skjer ved bruk av proteiner fosforylert av MPF. Den indre kjernemembranen (utvidelse av ER) er støttet av kjernelaminer (A, B og C) - en type cytoskjellett proteiner (Figure 13-15). Kjernemembranen nedbrytes tidlig i mitosen ved depolymerisering av kjernelaminene som en konsekvens av at MPF fosforylerer spesifikke serin-rester i alle tre typer laminer (Figure 13-15b). Også andre mitotiske reaksjoner (f.eks. kromosom-kondensasjon) er styrt av MPF katalyserte fosforyleringer. I denne sammenheng deltar SMC (structural maintenance of chromosomes)-proteiner i større protein-komplekser kalt condensin som har en viktig rolle ved kromosom-kondensasjonen.

11 Molekylære mekanismer for regulering av mitose (forts.) Start av anafase Gjennom anafasen skal de to søster-kromatidene skilles i to uavhengige kromosomer. Hver inneholder en sentromer som er bundet med spindelfibrer til den polen som den beveger seg mot. Samtidig strekkes cellen og pol-til-pol spindlene. Cytokinesen starter når brytningsfuren( cleavage furrow) kommer til syne (Figure 19-34). Sentralt i starten av anafasen er kinetochoren samlet i sentromeren og multiproteinkomplekser kalt cohesiner som reguleres av anafase-inhibitorer. Ved inaktivering av cohesin-funksjonen vil søsterkromatidene kunne beveges mot polene (Figure 13-18). Den kompliserte kontrollen av starten av anafasen og utgangen fra mitosen er vist i Figure Fosfatase-aktivitet kreves for gjendanning av kjernemembran og cytokinese I telofase skal kjernemembranen gjendannes ved repolymerisering av kjerne-laminer. Dette krever spesifikke protein-fosfataser. Figure viser skjematisk gjendannelsen av kjernemembranen hvor karyomerer (minikjerner) tilslutt smelter sammen til kjernene i de to dattercellene.

12 Genetiske studier av gjærceller Saccharomyces cerevisiae Cdc28 Avgjørende for om en celle skal dele seg er at den bestemmer seg for å gå inn i S-fasen. Kunnskap om molekylær kontroll av inngang til S-fasen og av DNA-replikasjon kommer fra undersøkelser av S. cerevisiae som formeres ved knoppskyting (Figure 13-22). Sentral i undersøkelsene av S. cerevisiae har vært mutanten Cdc28 - som funksjonelt er lik S. pombe Cdc2. Etter å ha nådd en viss størrelse i G 1 -fasen (avhenger av næringstilførsel), starter et genekspresjonsprogram i gjærcellen som tilslutt ender med overgang til S-fasen. Etter at kritisk cellestørrelse er nådd kan ikke prosessen reverseres( the point of no return ) - selv om cellen kommer over på et mindre næringsrikt medium. G 1 cykliner og Cdc28 - start på S-fase S. cerevisiae vill-type genet (CDC28) uttrykker en enkel cyklin-avhengig protein-kinase (Cdk) som samvirker med ulike cykliner gjennom ulike faser av cellesyklusen (se Figure 13-26). Tre cykliner er aktive i G 1 -fasen (Cln1, Cln2 og Cln3) og andre B-type cykliner i S-fasen (Clb3-6) med spesifikke oppgaver. DENNE DELEN AV KAP. 13 ER FOR TEKNISK DETALJERT UTEN AT DEN GIR OVERORDNET KUNNSKAP. AV DENNE GRUNN GÅR s UT AV PENSUM.

13 Celle-syklus kontroll i dyreceller Innledning I pattedyr må vi skille mellom ulike celletypers potensiale for å gjenomgå en cellesyklus mer enn en gang. Postmitotiske celler går ut av cellesyklus i G 1 - før de differensieres og går over i G 0 hvor de blir der resten av sin levetid (se Figure 13-1). Noen differensierte celler (fibroblaster og lymfocytter) kan stimuleres i G 0 -fasen til å inngå i cellesyklus på nytt og replikeres. De fleste cellesyklus-studier av dyreceller har vært utført med celler i kultur som krever visse polypeptid-vekstfaktorer (mitogener) som signalmolekyler som bindes til receptorer før start av celledeling. Mitogenene starter en kaskade av fenomener - kalt signal transduksjon - som tilsist påvirker transkripsjon og cellesykluskontroll. Omtales utførlig i Kap. 20. Uten mitogener er cellene i G 0 -fasen - når disse tilsettes vil de hvilende (quiescent) cellene passere gjennom restriksjonspunktet (tilsvarer START i gjærceller - se Figure 13-22) og gå inn i S-fasen for siden å fortsette i cellesyklus.restriksjonspunktet er the point of no return.

14 Celle-syklus kontroll i dyreceller Multiple Cdk og cykliner regulerer dyrecellesyklus I motsetning til gjærceller- som produserer en enkel cyklin-avhengig kinase (Cdk) - så bruker dyreceller en liten familie av nærbeslektede Cdk (Cdk1, 2,4,6 - Cdk3 og 5 brukes ikke i cellesykluskontroll) til å regulere fremdriften gjennom cellesyklus. I likhet med gjærceller så uttrykker dyreceller multiple cykliner. Alle eukaryote celler har cyklin A og B proteiner - i humane celler finnes også cyklin D og E som uttrykkes i G 1. Hvordan og når Cdk-cykliner virker i G 0 -arresterte dyreceller - etter tilførsel av vekstfaktorer dvs. mitogener - er vist i Figure To gen-klasser og deres uttrykk Tilførsel av vekstfaktorer induserer transkripsjon av multiple gener ; 1. Tidlig respons-gener og 2. Forsinket respons-gener (Figure 13-30a). De siste blokkeres av proteinsynteseinhibitorer (Figure 13-30b) - de første koder for dannelse av transkipsjonsfaktorer (c-fos, c- Jun) som da er tilstede i G 0 -celler. Konsentrasjonen av Tidlig respons-gener (egentlig deres mrna) faller raskt, men har allerede gitt grunnlag for produksjonen av Forsinket respons-gener. Forsinket respons-gener koder i sin tur for D-og E-type cykliner og Cdk2,4,6 (se over).

15 Celle-syklus kontroll i dyreceller Passasje gjennom restriksjonspunkter Passasje gjennom restriksjonspunkter avhenger av aktivisering av E2F transkripsjonsfaktorer. E2F-faktorene stimulerer transkripsjon av gener som kreves for DNA-replikasjon, DNA-syntese, og syntese av Cdk2, cyklin E og cyklin A. E2F-aktiviteten hemmes ved binding til RB-protein og to nærbeslektede proteiner (p107 og p130). Ved bindingen mellom RB-proteinet og E2F vil E2F gå over fra å være transkripsjonsfaktorer til repressorer. Fosforylering av RB-proteinet hemmer dets represserende evne i midt G 1 og sen G 1 (Figure 13-31) - først ved Cdk4/6-cyklin D og deretter når ekspressjon av Cdk2-cyklin E er stimulert. Prosessene resulterer i positiv feedback (blå piler på Figure 13-31) som fører til rask økning av både E2f og Cdk2-cyklin E ettersom cellene nærmer seg sen G 1 --> S-fasen.

16 Celle-syklus kontroll i dyreceller Cyklin A gir DNA-syntese - Cdk1 leder til mitose Syntese av cyklin A starter når cellene nærmer seg G 1 --> S-fasen. Cyklin A blir umiddelbart transportert til kjernen. Cdk2-cyklin A kreves for DNA-replikasjon og kan være den kinasen som aktiverer prereplikasjonskompleksene som starter DNA-syntesen. Cyklin B blir først syntetisert i S-fasen, øker i mengde når cellene gjennomgår G 2, når en topp i tidlig mitose og faller etter anafase.cdk1-cyklin B leder inn i mitosen. Cyklin A og B blir polyubiquitinated av anafase-promoting complex (APC) med påfølgende nedbrytning i proteasomene i sen anafase ( se parallel i Figure 13-9). Cyklin-kinase inhibitorer medvirker i cellesyklus-kontroll En cyklin-kinase inhibitor (CKI) er ennå ikke påvist i dyreceller, men man antar at det finnes to klasser ; 1. CIP (Cdk inhibitory protein) og 2. INK4 (inhibitor av kinase 4). Disse to inhibitorene og fosforylering og defosforylering som i S. pombe (se Figure 13-13) medvirker til å regulere aktiviteten av dyrecelle Cdk-cyklin-komplekser.

17 Sjekkpunkter i reguleringen av cellesyklus Innledning Medisinske aspekter med katastrofale følger kan komme som en konsekvens av at cellesyklus-reguleringen svikter. Eksempler er når sammensmelting av celler på ulike trinn i syklus finner sted (se boken). Fenomener som opptrer er bl.a. nondisjunction-->down syndrom (Figure 13-33). For å minimalisere slike mistak i cellesyklus, har cellen 4 sjekkpunkter (Figure 13-34). Ikke-replikert DNA hindrer mitose Celler som ikke replikerer alle kromosomer går ikke inn i mitose.sjekkpunktkontrollen her er ikkereplikert DNA (S-arrest; Figure 13-34) og hemming av MPF-aktivering. Hvordan denne kontrollen foregår er under utredning ved bruk av gjærcelle-mutanter med defekter i dette sjekkpunktet.

18 Sjekkpunkter i reguleringen av cellesyklus Uregelmessig samling av mitotisk spindel stopper utgang av anafase Bruk av colchicine som hemmer av mikrotubuli-polymerisering og derved oppbygging av mitotisk spindel, er et annet sjekkpunkt (M-arrest; Figure 13-34). Cellene når mitose men det stopper opp med kondenserte kromosomer. Mangel på mitotisk spindel registreres og derved hindres APC-polyubiquitination dvs. anafase-inhibitor er fortsatt tilstede og metafase--> anafase uteblir. I sum : MPF-aktivitet forblir høy, kromosomer forblir kondenserte og kjernemembrane gjendannes ikke. Betydning av tumor- og cyklin-kinase hemmere Celler skadet av UV eller røntgen-stråler dvs. DNA-skader, stopper opp i G 1 - og G 2 -fasene - inntil skadene er reparert. Medisinske aspekter : Tumor-suppressor-gener er gener hvis inaktivering bidrar til utvikling av en tumor. Kreft i humane celler kan skyldes p53-protein. Dette virker mest i G 1 -fasen, men også i G 2 -fasen i sjekkpunkt for DNA-skader. For mer utførlig omtale av p53 vises til forelesninger av Berit Johansen om kreft og Kap. 23 og 24.