Prosjektet og gjennomføringen. Prosjektets bakgrunn

Transkript

1 Prosjekt Preventive vaccination against allergy: the effect in offspring of maternal allergen exposure and immune response. Post-doc: Jitka Stilund Hansen Prosjektets bakgrunn Årsakene til allergi er ikke kjente, og forbygging er derfor også meget vanskelig og usikker. Det er heller ikke økonomisk interessant for andre enn storsamfunnet å investere i forebygging, og svært mye av allergiforskningen er mer eller mindre direkte innsiktet mot å utvikle bedre metoder for diagnostikk og behandling med kommersielt potensiale. Forebygging blir i hovedsak en oppgave for det offentlige, og forskning på forebyggingsmuligheter gjennom for eksempel vaksinasjon er derfor en viktig oppgave for forskningsråd og folkehelseinstitutt. Allergiske sykdommer rammer anslagsvis 30% av befolkningen, representerer trolig den største og viktigste miljøbetingete sykdomsgruppe, og den potensielle helsegevinsten av god forebygging er enorm. Vi hadde i tidligere forsøk gjennomført med støtte fra Norges astma- og allergiforbund vist og publisert at vaksinasjon av drektige mus med allergen sterkt reduserte allergisk immunrespons mot det samme allergenet hos avkommet når dyrene ble immunisert i ung voksen alder. Et oppfølgings-prosjekt fra Forskningsrådet der vi skulle ta fatt i problemstillingen med større tyngde, ble avbrutt på grunn av en parsittinfeksjon i dyreavdelingen, for øvrig oppdaget av stipendiaten. De arbeidsintensive, kompliserte forsøkene med synkronisering av drektighet og tilsyn med dyrene døgnet rundt i perioder kunne ikke gjennomføres i leide lokaler i noen avstand fra instituttet. Videre, det opplegget Folkehelseinstituttet valgte for å rense opp sin forsøksdyravdeling, var slik at det tok svært lang tid før man med noenlunde sikkerhet hadde en hygienetilstand som gjorde det forsvarlig å starte opp igjen med arbeidsintensive og ressurskrevende flergenerasjonsforsøk av 4 6 måneders varighet. Dette førte til at stipendiaten i dette forutgående prosjektet sluttet. Det aktuelle post-doc-prosjektet som nå rapporteres kom derfor etter en periode med liten forskningsaktivitet når det gjaldt den meget viktige problemstillingen: forebyggende vaksinasjon mot allergi. Prosjektet og gjennomføringen Fordi vi skulle inn i et ganske ukjent og uforutsigbart terreng var prosjektet i betydelig grad lagt opp som et menyprosjekt, det vil si ut fra en felles kjerne var det flere fingre som skulle utprøves. Hvor tyngden i arbeidet ville bli lagt, ville i stor grad avhenge av funnene underveis hva som virket og hva som ikke virket. Hovedsiktemålet var ganske praktisk utvikling av vaksine mot allergi. Det var to hovedelementer: 1) utprøving av betingelsene for å få en optimal beskyttelse av vaksinasjon i den etablerte modellen 2) karakterisering av de aktive mekanismene i den etablerte modellen for på den måten å kunne optimalisere prosedyrene. Post-doc-stipendiaten var meget aktiv og entusiastisk. Med store, komplekse langtidsforsøk som begrenset hvor mange forsøk man kunne gjøre, var det viktig å optimalisere opplegget slik at maksimal mengde informasjon kunne hentes ut av de relativt få forsøkene som kunne gjennomføres hvert. Samtidig var det viktig å begrense kompleksiteten slik at vi kunne få mest mulig klare svar på mest mulig veldefinerte problemstillinger. Et viktig hjelpemiddel var moderne forsøksdesign og moderne statistiske metoder. Stipendiaten var også meget aktiv deltager i prosjekter som med hensyn til problemstillinger og/eller metoder lå i grenselandet til hennes eget prosjekt, noe som gjenspeiles i publikasjonslisten, uten at disse randsoneaktivitetene beskrives nærmere her. Som helhet var det en viktig oppgave for prosjektleder en tilhenger av oversiktlig og klar design av forsøkene med klare problemstillinger - å sørge for god nok avgrensning og fokusering av aktivitetene, i forhold til en meget aktiv og faglig frodig stipendiat med sterk personlighet. Etter en del spenninger i innledningsfasen da prosjektleder opplevde en reell risiko for at post-doc en skulle gå seg bort i komplekse forsøk med mangslungne problemstillinger, fungerte samarbeidet etter hvert meget godt. Prosjektleder ville nok fortsatt ha designet forsøkene enda enklere og enda mer innsiktet mot anvendt vaksineutvikling, men vi fant en god og produktiv samarbeidsform, og jeg opplevde en god faglig 1

2 utvikling og modning hos post-doc-stipendiaten. Unni Cecilie Nygaard hadde en meget viktig funksjon som medveileder og ga et meget verdifullt bidrag til prosjektgjennomføringen. Ressursmessig fungerte prosjektgjennomføringen greit, med noenlunde adekvat økonomi. I forhold til vaksineutviklingsoppgaven er imidlertid ett prosjekt med én post-doc alt for lite, oppgaven krever egentlig at iallfall 3 5 stipendiater/forskere jobber parallelt om man skulle nå et stadium der man kunne begynne å tenke på mer definitiv utforming av et opplegg for å kunne starte kliniske studier. Som isolert prosjekt ser jeg imidlertid gjennomføringen av det aktuelle prosjektet som meget vellykket. Som evaluator av forskningssøknader for forskningsfinansierende institusjoner i Østerrike, Sveits og Belgia er jeg kjent med at det nå startes arbeid med utvikling av forebyggende allergivaksine i mer ressurstunge prosjekter. Om ikke annet så vil arbeid ut fra våre grunnidéer bli viderført der. Prosjekter basert på store, komplekse dyreforsøk har et innebygget problem, at resultathøsten i prosjektet kommer som lagene i en bløtkake, med artiklene som kakestykker som ikke kan tas ut før alt er ferdig. Heller enn å være tverrsnitt i forhold til prosjektets tidsakse, går artiklene på langs en fordel med det er imidlertid at de blir mer komplette og definitive. Prosjektleder har noen tiårs erfaring med denne problematikken, og den opprinnelige prosjektutformingen tok sikte på å få til en tidligere og mer trinnvis publisering, men med det opplegg vi endte med (jmfr. ovenfor) ble det likevel slik at ingen av hovedartiklene kunne skrives før helt mot prosjektslutt. Det publikasjonsmessige utbyttet blir imidlertid godt. Nedenfor følger en summarisk oversikt over resultatene, kommentar i forhold til opprinnelige mål og delmål, og til slutt en publikasjonsoversikt. 1. Generelle, mekanistiske forhold: Forekomsten av allergisk sykdom varierer med alder og kjønn. Selv om musemodeller er mye brukt i allergiforskningen, er det få eksperimentelle studier som har sett på samspillet mellom alder og kjønn. Vi undersøkte betydningen av alder og kjønn hver for seg og i samspill i en musemodell med i.p. (intraperitoneal) og i.n. (intranasal) immunisering, og dessuten så vi på betydningen av allergendose i dette samspillet. Mus av begge kjønn ble immunisert i.p. og i.n. ved 1, 6 eller 20 ukes alder. Allergen-challenge etter sensibilisering ble gitt i.n. Antistoff i serum, cytokin-frigjøring fra cellene i drenerende lymfeknuter og inflammatorisk respons i luftveiene ble undersøkt. Etter i.p. immunisering var antistoffrespons, cytokiner og betennelse i luftveiene meget avhengig av allergendose og individets alder. Ved lav dose økte responsen med økende alder, mens det motsatte ble observert ved høg dose. I modellen med i.n. immunisering økte antistoffresponsen og betennelsesreaksjonen med økende alder. Hun-mus viste generelt sterkere antisoffrespons og betennelsesrealsjon enn han-mus. Studiene viste på en mer systematisk måte enn tidligere mer fragmentariske forsøk at det er grunnleggende viktig å ta hensyn til dyrenes alder og kjønn samt allergendose når man konstruerer allergimodeller i mus. (Hansen JS, Alberg T, Rasmussen H, Lovik M, Nygaard UC. Determinants of experimental allergic responses: interactions between allergen dose, sex and age. Scand J Immunol. 2011;73: ). Videre ble det tatt ut materiale (miltceller) til studier av epigenetiske effekter av immunisering av både mor og avkom. Resultatene her samsvarte i hovedlinjene med de funksjonelle studiene; en egen publikasjon om epigenetiske og cellulære effekter er under utforming (Hansen JS, Nygaard UC, Lyle R, Lovik M. Epigenetic and cellular markers for increased resistance to allergic sensitisation in offspring of immunized mothers. Manuscript in progress). Resultatene av de generelle og mekanistiske studiene av respons på allergivaksinasjon har klare implikasjoner for arbeidet med vaksineutvikling. 2. Toleranseinduksjon med vaksinasjon: Vaksinasjon mot allergi må bygge på en eller annen form for toleranse-induksjon eller blokkering av allergenet. Bortsett fra at vi vet at livet før fødselen kan være viktig i denne sammenheng, vet vi imidlertid lite om hva som styrer utvikling av allergi og av toleranse mot allergi. Et individs egen utvikling av toleranse er imidlertid essentiell for å unngå allergi i det lange løp, og det var derfor viktig å sammenligne toleranse indusert gjennom vaksinasjon av mor, med toleranse indusert gjennom slimhinneeksponering hos avkommet selv. Dette dels for å undersøke om vaksinasjon av mor påvirker toleranseutviklingen hos avkommet (en hemming ville være en meget uønsket bivirknig, særlig dersom beskyttelse indusert ved vaksinasjon av mor er forbigående), dels fordi slimhinnevaksinasjon av barnet kan være et attraktivt alternativ til vaksinasjon av mor. Vi gjorde derfor forsøk der opplegget var å se på avkom av vaksinerte eller ikke vaksinerte mødre; halvparten av avkommet fra begge typer mødre fikk slimhinnevaksinasjon med 2

3 allergen i nesen i fem uker. Alt avkom ble så utsatt for en sensibiliserende immunisering med allergen, for å undersøke graden av allergisk immunrespons. Vaksinasjon av mor reduserte allergen-spesifikk IgE-respons hos avkommet, men økte paradoksalt nok Th2-avhengig cytokinrespons i miltceller, og økte Th1-avhengig IgG2a-respons. Postnatal intranasal vaksinasjon derimot reduserte både IgE, IgG1, miltcelleantall og cytokinsekresjon, og var slik distinkt forskjellig (også bekreftet gjennom de epigenetiske studiene). Intranasal immunisering hemmet den inflammatoriske responsen på allergen i luftveiene, en virkning vi ikke så etter vaksinasjon av mor. Meget viktig var det at toleranseutvikling etter intranasal vaksinasjon ikke ble hemmet av vaksinasjon av mor, men var lik hos avkom av vaksinerte og av uvaksinerte mødre. Effekten av vaksinasjon av mor ble svekket i avkommet ettersom det ble eldre, og kan skyldes overføring av IgG1-antistoffer (noenlunde tilsvarende IgG4 hos menneske) med svekkelse etter hvert som de overførte antistoffene ble borte. En mer kortvarig beskyttelse mot allergiutvikling etter maternell vaksinasjon kan likevel være meget viktig og beskytte barnet inntil det utvikler toleranse. Funnene viser at vi har minst to metoder for allergenvaksinasjon, og gir ennå et argument for å studere toleranseinduksjon hos barnet som metode for vaksinasjon, også fordi denne toleransen trolig vil være mye mer langvarig enn den trolig forbigående beskyttelsen man ser etter vaksinasjon av mor. Intranasal allergeneksponering så ikke ut til å forlenge varigheten av beskyttelsen av avkommet. (Hansen JS, Nygaard UC, Lyle R, Lovik M. Early life interventions to prevent allergy in offspring: the role of maternal immunisation and postnatal mucosal allergen exposures. Scand J Immunol 2011, innsendt/referee-kommentar) 3. Optimalisering av vaksinasjonsbetingelser: I dette settet av forsøk undersøkte vi hvordan genetiske, paternelle og maternelle faktorer påvirker vaksinasjonsresponsen. Vi immuniserte hunmus av stammene NIH/OlaHsd, Balb/cA and C57BL/6 mice etter vanlig protokoll, og testet beskyttelse mot allergiutvikling hos avkommet likeledes etter vanlig protokoll. Allergenspesifikt IgE, IgG1 and IgG2a ble målt i serum. Den beskyttende effekten av maternell vaksinasjon ble funnet i alle musestammene, og var slik ikke avhengig av genetisk bakgrunn. I separate forsøk parret vi totalt immundefekte Balb/c SCID hunmus med immunkompetente Balb/c hanner, og kjørte forsøk med avkommet etter vanlig protokoll. Ingen beskyttende effekt av vaksinasjon ble funnet, noe som indikerer at mor må ha en (normal?) immunrespons for at avkommet skal bli beskyttet av maternell vaksinasjon. Likeldes immuniserte vi NIH/OlaHsd hun-mus på vanlig måte under svangerskapet men også 4 eller 8 uker før parring, og fant at selv tidlig vaksinasjon av mor 8 uker før parring hadde beskyttende effekt. Dette indikerer bant annet at mekanismen for beskyttelse neppe involverer overføring av allergen til avkommet. Endelig immuniserte vi han-mus i adekvat tid før parring slik at epigenetiske effekter i forhold til relevant spermatogenese skulle kunne oppdages. Paternell vaksinasjon ga ingen beskyttende effekt, og vaksinasjon av far synes derfor ikke å være en aktuell metode for videre utprøving. Kommentarer i forhold til opprinnelige mål og delmål: Som nevnt var prosjektet til en viss grad et menyprosjekt, for best å kunne vektlegge det som funnene i forsøkene og den faglige utvikling gjorde mest interessant i forhold til hovedmålet: bestemme optimale betingelser for beskyttelse av avkommet etter allergenvaksinasjon av mor: Delmål 1: optimale betingelser ved s.c. vaksinasjon i) arvelig anlegg/atopi ii) tidligere eksponering for allergenet iii) forlenger allergeneksponering varigheten av beskyttelsen hos avkommet. Delmål 2: (mest valgfrie elementer:) i) andre allergener ii) andre dyrearter/rotte iii) kryssreaksjoner iv) peroral vaksinasjon v) epicutanvaksinasjon vi) intranasal vaksinasjon. Delmål 3: klarlegge mekanismer for beskyttende effekt: i) mors antistoff ii) regulatoriske T- lymfocytter iii) cytokiner iv) epigenetiske mekanismer Av delmål 1 har vi dekket (helt eller viktige elementer av) i) og iii), og i mindre grad grad ii) Av delmål 2 har vi dekket vi), mens iv) er under utprøving i et annet prosjekt Av delmål 3 har vi dekket alle fire elementene 3

4 Publiseringsinformasjon Manus under utarbeidelse (arbeidstittel): Nygaard UC, Hansen JS, Groeng E-C, Løvik M. The influence of genetic, paternal and maternal factors on allergen-specific IgE suppression in offspring. Manuscript to be submitted August Hansen JS, Nygaard UC, Lyle R, Lovik M. Epigenetic and cellular markers for increased resistance to allergic sensitisation in offspring of immunized mothers. Manuscript in progress. Under revidering etter referee-kommentarer: Hansen JS, Nygaard UC, Lyle R, Lovik M. Early life interventions to prevent allergy in offspring: the role of maternal immunisation and postnatal mucosal allergen exposures. Scand J Immunol Fulle artikler publisert: Alberg T, Nilsen A, Hansen JS, Nygaard UC, Løvik M. Nitrogen dioxide: no influence on allergic sensitization in an intranasal mouse model with ovalbumin and diesel exhaust particles. Inhal Toxicol. 2011; 23: Hansen JS, Alberg T, Rasmussen H, Lovik M, Nygaard UC. Determinants of experimental allergic responses: interactions between allergen dose, sex and age. Scand J Immunol. 2011;73: doi: /j x. Nygaard UC, Hansen JS, Samuelsen M, Alberg T, Marioara CD, Løvik M. Single-walled and multiwalled carbon nanotubes promote allergic immune responses in mice. Toxicol Sci 2009;109: Debattinnlegg, publiserte abstracts: Nygaard UC, Hansen JS, Groeng E-C, Løvik M. Allergen immunisation of female mice before conception reduces allergic sensitisation in offspring. Eur J Immunol 2009; 39 (suppl 1): S331 Alberg T, Nilsen A, Hansen J, Nygaard U, Løvik M. Nitrogen dioxide did not promote allergic sensitisation to ovalbumin in an intranasal mouse model. Allergy 2009; 64 (Suppl. 90): 297. Nilsen A, Alberg T, Hansen JS, Nygaard UC, Lovik M. Mixed air pollution, allergy and inflammation. Toxicol Sci 2008;102 (Suppl 1): 295. Nygaard UC, Hansen JS, Samuelsen M, Lovik M. Carbon nanotubes enhance allergic responses in mice. Toxicol Sci 2008;102 (Suppl 1): 296. Hansen JS, Larsen ST, Nielsen GD. Comment to "Di-(2-ethylhexyl) phthalate is without adjuvant effect in mice on ovalbumin" [Toxicology 244 (2008) ]. Toxicology. 2008; 247(2-3): Møtepresentasjoner: Hansen J, Nygaard U, Løvik M. Allergy and tolerance development in offspring after maternal immunisation. EAACI 2010 (29 th Congress of the European Academy of Allergology and Clinical Immunology), London, England, 5-9 June Hansen JS, Nygaard UC, Løvik M. IgE suppression in offspring due to maternal allergen imunisation is sex- but not strain-dependent. World Immune Regulation Meeting-III, Davos, Sveits, March

5 Alberg T, Nilsen A, Hansen J, Nygaard U, Løvik M. Nitrogen dioxide did not promote allergic sensitisation to ovalbumin in an intranasal mouse model. Allergy 2009: 64 (Suppl. 90): 297. Hansen JS, Nygaard UC, Løvik M. Strain and gender differences in the response to preventive vaccination against allergy in a mouse model. Nordforsk Allergy Symposium, Sønderborg, DK, September Alberg T, Nilsen A, Hansen JS, Nygaard UC, Løvik M. The combined effect of diesel and nitrogen dioxide on the allergic immune response. 5 th ITCASS meeting, Oslo, September Nygaard UC, Hansen JS, Samuelsen M, Alberg T, Marioara CD, Løvik M. Single-walled and multiwalled carbon nanotubes promote allergic responses in mice. 5 th ITCASS meeting, Oslo, September Nygaard UC, Hansen JS, Samuelsen M, Alberg T, Marioara CD, Løvik M. Karbonfibre og rør kan forsterke allergiske responser i mus. Norges forskningsråds nettverksmøte Karbon-materialer i Norge, Oslo, 28 August Nygaard UC, Hansen JS, Samuelsen M, Lovik M. Carbon nanotubes enhance allergic responses in mice. 47 th Annual meeting of Society of Toxicology (SOT), Seattle, USA, March Nilsen A, Alberg T, Hansen JS, Nygaard UC, Lovik M. Mixed air pollution, allergy and inflammation. 47 th Annual meeting of Society of Toxicology (SOT), Seattle, USA, March