(12) Oversettelse av europeisk patentskrift

Transkript

1 (12) Oversettelse av europeisk patentskrift (11) NO/EP B1 (19) NO NORGE (51) Int Cl. C07K 14/315 ( ) A61K 38/17 ( ) A61K 39/09 ( ) Patentstyret (21) Oversettelse publisert (80) Dato for Den Europeiske Patentmyndighets publisering av det meddelte patentet (86) Europeisk søknadsnr (86) Europeisk innleveringsdag (87) Den europeiske søknadens Publiseringsdato (30) Prioritet , US, P , US, P (84) Utpekte stater AT BE BG CH CY CZ DE DK EE ES FI FR GB GR HR HU IE IS IT LI LT LU LV MC MT NL NO PL PT RO SE SI SK TR (73) Innehaver Novartis AG, Lichtstrasse 35, 4056 Basel, Sveits (72) Oppfinner BENSI, Giuliano, Novartis Vaccines and Diagnostics SRL1 Via Fiorentina, Siena, Italia MARGARIT Y ROS, Immaculada, Novartis Vaccines and Diagnostics SRL1 Via Fiorentina, Siena, Italia CHIAROT, Emiliano, Novartis Vaccines and Diagnostics SRL1 Via Fiorentina, Siena, Italia GRANDI, Guido, Novartis Vaccines and Diagnostics SRL1 Via Fiorentina, Siena, Italia SCARSELLI, Maria, Novartis Vaccines and Diagnostics SRL1 Via Fiorentina, Siena, Italia (74) Fullmektig Bryn Aarflot AS, Postboks 449 Sentrum, 0104 OSLO, Norge (54) Benevnelse Mutante former av Streptolysin O (56) Anførte publikasjoner GB-A US-A WO-A-2004/ WO-A-2005/ WO-A-2007/ WO-A-2008/ WO-A-93/05155 WO-A-99/49049 PALMER M ET AL: "Assembly mechanism of the oligomeric streptolysin O pore: the early membrane lseion is lined by a free edge of the lipid membrane and is extended gradually during oligomerization" THE EMBO JOURNAL, vol. 17, no. 6, 1998, pages , XP PINKNEY M ET AL.: "The Thiol-Activated Toxin Streptolysin O Does Not Require a Thiol Group for Cytolytic Activity" INFECTION AND IMMUNITY, vol. 57, no. 8, August 1989 ( ), pages , XP

2 1 Mutante former av Streptolysin O Beskrivelse OMRÅDE FOR OPPFINNELSEN [0001] Foreliggende oppfinnelse vedrører områdene av immunologi og vaksinologi. BAKGRUNN FOR OPPFINNELSEN [0002] Streptolysin O (SLO; GAS25) er en av de mest viktige virulensfaktorer av det humane patogene Streptococcus pyogenes (GAS). På grunn av dets kapasitet til å aktivere en tidlig og sterk immunrespons i mennesker, blir det rutinemessig anvendt som en diagnostisk markør for GAS infeksjon. [0003] SLO hører til familien av sterkt homologe tiol-aktiverte cytolysiner (TACY) som utviser deres cytolytiske aktivitet gjennom interaksjon med kolesterol på cellemembranen, selv-oligomerisasjon og dannelsen av porer. Videre, deres evne til å aktivere direkte den klassiske komplementreaksjonsveien ved binding til Fc regionen av human IgG kan resultere i direkte komplementmediert angrep på vertsceller. TACY kan også interferere med vertsforsvar og immuncellefunksjon ved hjelp av induksjon av cytokiner og inflammatoriske mediatorer. [0004] Noen TACY kan passivt og aktivt beskytte laboratoriedyr. Se FEMS Lett. 182, , Derimot har denne anvendelsen av disse toksiner som vaksinekandidater blitt redusert ved deres komplekse mønster av skadelige bieffekter. Der er derfor et behov innenfor fagområdet for SLO proteiner som ikke er toksiske. [0005] WO 2005/ beskriver vaksinesammensetninger som omfatter muterte kolesterolbindende cytolisinproteiner inkludert mutante SLO proteiner. [0006] WO 93/05155 beskriver ekspresjon og rensing av et mutant SLO protein og analyse av dets hemolytiske aktivitet. [0007] Pinkey et al. (Infection and Immunity 57:8, 1989) beskriver analyse av de hemolytiske aktivitetene til villtype SLO og et antall mutante SLO proteiner. [0008] GB beskriver mutante SLO proteiner og beskriver analyse av deres cytolytiske aktivitet.

3 2 KORT BESKRIVELSE AV FIGURENE [0009] FIG. 1. Tredimensjonal datamodell av SLO. Proliner er representert som fylte områder. Pro427 er farget med hvitt. FIG. 2. Grafen viser resultater av den hemolytiske analysen ved anvendelse av E. coli ekstrakter inneholdende villtype SLO og SLO mutant P427L. FIG. 3. Fotomikrograf av SDS-polyakrylamidgel som viser renset SLO mutant P427L. FIG. 4. Grafen viser resultater av den hemolytiske analysen ved anvendelse av renset villtype SLO og SLO mutant P427L. FIG. 5. Fotomikrograf av SDS-polyakrylamidgel av E. coli lysat supernatanter. Kolonne A, E. coli negativ kontroll; kolonne B, rslo villtype, uten tag; kolonne C, rslo P427L, uten tag, og kolonne D, renset rslo villtype, uten tag (5 mg). FIG. 6. Grafen demonstrerer at under de samme betingelsene er SLO mutanten P427L 1000 ganger mindre hemolytisk enn villtype SLO. Fig. 7. Grafen demonstrerer effekten av kolesterol på hemolyse av villtype SLO og SLO mutant P427L. FIG. 8. Fotomikrografer av SDS-PAGE analyse av totale tag-frie proteiner i celleekstrakter. FIG. 8A, ekspresjon av SLO villtype og P427L tag-frie proteiner; FIG. 8B, ekspresjon av SLO P427L + W535, P427L + C530G og P427L + C530G + W535F tag-frie proteiner. FIG. 9. Fotomikrograf av SDS-PAGE analyse av totale His-taggede proteiner i celleekstrakter.

4 FIG 10. Fotomikrograf av SDA-PAGE analyse av rensede His-taggede proteiner. 3 FIG. 11. Fotomikrografer av SDS-PAGE analyse av rensede tag-frie proteiner. FIG. 11A, kolonnene: A, SLO villtype tag-frie; B SLO P427L tag-frie; molekylvektmarkører (116-66, ,4-14,4); svart pil indikerer SLO protein renset fra mutanter og villtype kloner. FIG 11B, kolonne A, SLO villtype tag-frie (3 g), kolonne B, SLO P427L-W535F tag-frie (3 g); molekylvektsmarkører (116-66, ,4-14,4); svart pil indikerer SLO protein renset fra mutanter og villtype kloner. FIG. 12. Fotomikrograf av SDS-PAGE analyse av renset tag-frie SLO villtype protein. Prøver av forskjellige rensningsprøver av villtype SLO ble analysert under reduserende og ikkereduserende betingelser. FIG. 13. Grafen viser resultater av hemolysetester av His-taggede SLO mutanter. FIG. 14. Grafen viser inhibisjon av SLO-indusert hemolytisk aktivitet av anti-slo antiserum. FIG. 15. Grafen viser titrering av anti-slo antiserum inhibisjon av SLO hemolyse. FIG. 16. Grafen viser SLO hemolytisk aktivitetstitrering. FIG. 17. Grafen viser titrering av hemolytisk aktivitet av villtype SLO, kjemisk detoksifisert villtype SLO og SLO mutanter (P427L; P427L + W535F). FIG. 18. Grafen viser titrering av hemolytisk aktivitet av villtype SLO og SLO mutanter (P427L; P427L + W535F). FIG 19. Grafen viser titrering av den hemolytiske aktiviteten til villtype SLO og kjemisk detoksifisert villtype SLO. FIG. 20. Grafen viser fortynning av antiserum mot SLO mutant P427L + W535F nødvendig for å oppnå 50 % reduksjon av SLO hemotytisk aktivitet (50 ng/ml SLO).

5 4 FIG. 21. Grafen viser fortynning av antiserum mot SLO mutant P427L + W535F nødvendig for å oppnå 50 % reduksjon av SLO hemolytisk aktivitet (100 ng/ml SLO). FIG. 22. Titreringskurve som viser at hemolyse inhibisjonsanalyser ble utført med toksinkonsentrasjoner som muliggjør 100 % hemolyse. FIG 23. Oppstilling av SLO proteiner. M1_SF370, SEQ ID NR:1; M12_2096, SEQ ID NR:2; M12_9429, SEQ ID NR:3; M1_5005, SEQ ID NR:4; M2, SEQ ID NR:5; M28, SEQ ID NR:6; M6, SEQ ID NR:7; M18, SEQ ID NR:8; M5, SEQ ID NR:9; M3, SEQ ID NR:10; M3_SSI, SEQ ID NR:11 og M4, SEQ ID NR:12. FIG. 24. Oppstilling av villtype SLO og his-taggede SLO mutanter. SLO_M1 stammesf370, SEQ ID NR:1; SLO WT_histagget, SEQ ID NR:13 SLOmut.P427L_histagget, SEQ ID NR:15; SLOmut.C530G_histagget, SEQ ID NR:16; SLOmut.DeltaA248_histagget, SEQ ID NR:17; SLOmut.W535F_histagget, SEQ ID NR:18 og SLOmutW535F&D482N_histagget, SEQ ID NR:19. FIG. 25. Grav som sammenligner reduksjon av SLO hemolytisk aktivitet med antiserum mot villtype SLO og antiserum mot SLO mutant P427L + W535F. FIG. 26. Grafen viser in vivo beskyttende egenskaper av rekombinant SLO mutant P427L + W535F ved anvendelse av enten alum eller MF59 som en adjuvant. DETALJERT BESKRIVELSE AV OPPFINNELSEN [0010] Oppfinnelsen tilveiebringer mutanter av streptolysin O (SLO; GAS25) som er ikketoksiske men som fortsatt opprettholder deres evne til å indusere beskyttelse overfor S. pyogenes. Mutante former av SLO er nyttige, inter alia, i vaksinesammensetninger, for å indusere beskyttelse overfor S. pyogenes. [0011] Oppfinnelsen tilveiebringer et renset mutant streptolysin O (SLO) protein ifølge SEQ ID NO:1, hvor aminosyrene i posisjonene P427 og W535 er substituerte med en annen aminosyre, og hvor den hemolytiske aktiviteten av det mutant SLO proteinet blir redusert med minst 50 % i forhold til villtype SLO.

6 5 [0012] Oppfinnelsen tilveiebringer også et renset mutant SLO protein som omfatter en aminosyresekvens valgt fra gruppen bestående av SEQ ID NO:25 og SEQ ID NO:27. [0013] Oppfinnelsen tilveiebringer også et nukleinsyremolkyl kodende for et mutant SLO protein som beskrevet ovenfor. [0014] Oppfinnelsen tilveiebringer også en vaksinesammensetning omfattende: (a) et aktivt middel valgt fra: (i) renset mutant streptolysin O (SLO) protein som beskrevet ovenfor; og (ii) et nukleinsyremolekyl som koder for det rensede mutante streptolysin O (SLO) protein som beskrevet ovenfor; og (b) en farmasøytisk akseptabel bærer. [0015] Oppfinnelsen tilveiebringer også en fremgangsmåte for fremstilling av en vaksine for forebygging eller behandling av infeksjon med Streptococcus pyogenes omfattende kombinering: (a) et aktivt middel valgt fra: (i) et renset mutant streptolysin O (SLO) protein som beskrevet ovenfor; og (ii) et nukleinsyremolekyl som koder for et renset mutant streptolysin O (SLO) protein som beskrevet ovenfor; og (b) en farmasøytisk akseptabel bærer. [0016] Oppfinnelsen tilveiebringer også anvendelse av et aktivt middel for fremstilling av et medikament for behandling eller forebygging av infeksjon med Streptococcus pyogenes, idet det aktive middelet er valgt fra gruppen bestående av: (i) et renset mutant streptolysin O (SLO) protein som beskrevet ovenfor; og (ii) et nukleinsyremolekyl som koder for det rensede mutante streptolysin O (SLO) protein som beskrevet ovenfor.

7 6 [0017] Oppfinnelsen tilveiebringer også et renset mutant SLO protein som beskrevet ovenfor eller et nukleinsyremolekyl som beskrevet ovenfor for anvendelse som en vaksine. [0018] Oppfinnelsen tilveiebringer også et renset mutant SLO protein som beskrevet ovenfor, et nukleinsyremolekyl som beskrevet ovenfor, eller en vaksinesammensetning som beskrevet ovenfor for anvendelse i terapi, så som for behandling eller forebygging av infeksjon ved Streptococcus pyogenes. Mutante SLO proteiner [0019] Mutante former av SLO ifølge oppfinnelsen har minst 50 % mindre hemolytisk aktivitet enn villtype SLO (f.eks. 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99 eller 100 %) i forhold til villtype SLO som bestemt i en hemolytisk analyse men er immunogene, f.eks., de gir beskyttelse overfor GAS -dødelig- eksponering i en musemodell (f.eks. se eksempel 7). SLO mutanter beskrevet heri inkluderer SLO mutantene P427L (SEQ ID NR:20), W535F (SEQ ID NR:21), C530G (SEQ ID NR:22), ΔA248 (SEQ ID NR:23), W535F + D482N (SEQ ID NR:24), P427L + W535F (SEQ ID NR:25), P427L + C530G (SEQ ID NR:26) og P427L + C530 G + W535F (SEQ ID NR:27). Beskrivelsen inkluderer også his-taggede versjoner av disse mutantene. Eksemplene er vist i FIG. 24. [0020] SLO mutantene beskrevet heri inkluderer de med en aminosyreendring (dvs. en substitusjon, delesjon eller innskudd) i en eller flere av aminosyrene P427, W535, C530, A248 og D482 nummerert ifølge villtype SLO sekvensen vist i SEQ ID NR:1. FIG. 23 tilveiebringer en oppstilling av villtype GAS25 sekvenser fra forskjellige M typer. [0021] SLO mutantene beskrevet heri inkluderer enkelt, dobbelt eller trippel aminosyreendringer ( enkelt mutanter, dobbelt mutanter, trippel mutanter ) i posisjonene P427, W535, C530, A248 og/eller D482. Følgelig kan SLO mutantene omfatte følgende: i. P427L (SEQ ID NR:20), P427R, P427N, P427C, P427Q, P427E, P427G, P427H, P427I, P427L, P427K, P427M, P427F, P427A, P427S, P427T, P427W, P427Y eller P427V; ii. W535F (SEQ ID NR:21), W535R, W535N, W535D, W535C, W535Q, W535E, W535G, W535I, W535L, W535K, W535M, W535A, W535P, W535S, W535T, W535Y eller W535V;

8 7 iii.c530g (SEQ ID NR:22), C530R, C530N, C530D, C530S, C530Q, C530E, C530A, C530H, C530I, C530L, C530K, C530M, C530F, C530P, C530T, C530W, C530Y eller C530V; iv. D482L, D482R, D482N, D482C, D482Q, D482E, D482G, D482H, D482I, D482L, D482K, D482M, D482F, D482A, D482S, D482T, D482W, D482Y eller D482V; v. A248L, A248R, A248N, A248C, A248Q, A248E, A248G, A248H, A248I, A248L, A248K, A248M, A248F, A248S, A248T, A248W, A248Y eller A248V vi. ΔP427; eller ΔW535; eller ΔC530; eller ΔD482; eller ΔA248 (SEQ ID NR:23); og vii. kombinasjoner derav, så som W535F + D482N (SEQ ID NR:24), P427L + W535F (SEQ ID NR:25), P427L + C530 G (SEQ ID NR:26) og P427L + C530G + W535F (SEQ ID NR:27). [0022] Dobbel mutantene beskrevet heri inkluderer P427L + W535F (SEQ ID NR25), P427L + C530G (SEQ ID NR:26), P427L + A248L, P427L + D482L, W535F + C530G, W535F + A248L, W535F + D482L, C530G + A248L og A248L + D482L. Trippel mutanter inkluderer P427L + C530G + A248L, P427L + C530G + D482L, P427L + A248L + D482L, P427L + C530G + W535F (SEQ ID NR:27), W535F + C530G + A248L, W535F + C530G + D482L, W535F + A248L + D482L og C530G + A248L + D482L. [0023] Mutante SLO proteiner beskrevet heri inkluderer også fusjonspolypeptider som omfatter et mutant SLO protein som beskrevet ovenfor og et annet GAS antigen. GAS antigenene er beskrevet f.eks. i WO 02/34771 som inkluderer, men er ikke begrenset til GAS39 (spy0266; gi ), GAS40 (spy0269; gi ), GAS42 (spy0287; gi ), GAS45 (M5005_spy0249; gi ), GAS57 (spy0416; gi ), GAS58 (spy0430; gi ), GAS84 (spy1274; gi ), GAS95 (spt1733; gi ), GAS117 (spy0448; gi ), GAS130 (spy0591; gi ), GAS137 (spy0652; gi ), GAS159 (spy1105; gi ), GAS193 (spy2025; gi ), GAS202 (spy1309; gi ), GAS217 (spy0925; gi ), GAS236 (spy1126; gi ), GAS253 (spy1524; gi ), GAS277 (spy1939; gi ), GAS294 (spy1173; gi ), GAS309 (spy0124; gi ), GAS366 (spy1525; gi ), GAS372 (spy1625; gi ), GAS384 (spy1874; gi ), GAS389 (spy1981; gi ), GAS504 (spy1751; gi ), GAS509 (spy1618; gi ), GAS290 (spy1959; gi ), GAS511 (spy1743; gi-

9 ), GAS527 (spy1204; gi ), GAS529 (spy1280; gi ) og GAS533 (spy1877; gi ). Ytterligere GAS antigener inkluderer, men er ikke begrenset til GAS68 (Spy0163; gi ), GAS84 (Spy1274; gi ), GAS88 (Spy1361; gi ), GAS89 (Spy1390; gi ), GAS98 (Spy1882; gi ), GAS99 (Spy1979; gi ), GAS102 (Spy2016, gi ), GAS146 (Spy0763; gi ), GAS195 (Spy2043; gi ), GAS561 (Spy1134; gi ), GAS179 (Spy1718, gi ) og GAS681 (spy 1152, gi ). Nukleinsyremolekyler kodende for mutante SLO proteiner [0024] Oppfinnelsen inkluderer nukleinsyremolekyler som koder for mutante SLO proteiner. Også beskrevet er nukleinsyremolekyler som omfatter nukleotidsekvenser som har minst 50 % sekvensidentitet med slike molekyler. Avhengig av den bestemte sekvensen er grad av sekvensidentitet fortrinnsvis høyere enn 50 % (f.eks. 60 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % eller mere). Identiteten mellom nukleotidsekvensene blir fortrinnsvis bestemt av Smith-Waterman homologi søkalgoritmen som implementert i MPSRCH programmet (Oxford Molecular), ved anvendelse av et affine gap søk med parametrene gap open penalty = 12 og gap extension penalty = 1. [0025] Også beskrevet heri er nukleinsyremolekyler som kan hybridisere til disse molekylene. Hybridiseringsreaksjonene kan bli utført under betingelser med forskjellig stringenthet. Betingelser som øker stringentheten til en hybridiseringsreaksjon er velkjent og publisert innenfor fagområdet. Se f.eks. side 7.52 i Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Eksempler på relevante betingelser inkluderer (i rekkefølge med økende stringenthet); inkubasjonstemperaturer på 25 o C, 37 o C, 50 o C, 55 o C og 68 o C; bufferkonsentrasjoner på 10X SSC, 6X SSC, 1X SSC og 0,1X SSC (hvor SSC er 0,15 M NaCl og 15 mm citratbuffer) og deres ekvivalenter ved anvendelse av andre buffersystemer; formamidkonsentrasjoner på 0 %, 25 %, 50 % og 75 %; inkubasjonstider fra 5 minutter til 24 timer; 1, 2 eller flere vasketrinn; vaske inkubasjonstider på 1, 2 eller 15 minutter; og vaskeløsninger på 6X SSC, 1X SSC, 0,1X SSC eller deionisert vann. Hybridiseringsteknikker og deres optimalisering er velkjent innenfor fagområdet. Se f.eks. Sambrook, 1989; Ausubel et al., eds. Short Protocols in Molecular Biology, 4th ed., 1999, U.S. Patent 5,707,829; Ausubel et al., eds., Current Protocols in Molecular Biology, Supplement 30, 1987.

10 9 [0026] I noen aspekter hybridiserer nukleinsyremolekylene beskrevet heri til et mål under betingelser med lav stringenthet; i andre utførelsesformer hybridiserer nukleinsyremolekylene beskrevet heri under intermediære betingelser for stringenthet; i visse aspekter, hybridiserer nukleinsyremolekylene beskrevet heri under høy stringensbetingelser. Et eksempel på lav stringent hybridiseringsbetingelse er 50 o C og 10X SSC. Et eksempel på en intermediær stringenthet hybridiseringsbetingelse er 55 o C og 1X SSC. Et eksempel på en betingelse med høy stringenthybridisering er 68 o C og 0,1X SSC. Produksjon av mutante SLO proteiner Rekombinant produksjon [0027] Det at den genetiske koden er degenerert er velkjent. Følgelig kan et hvilket som helst nukleinsyremolekyl (polynukleotid) som koder for villtype SLO protein eller et SLO mutant protein ifølge oppfinnelsen bli anvendt for å produsere det protein rekombinant. Eksempler på nukleotidsekvenser som koder for villtype SLO, SLO mutant P427L, W535F, C530G, A248, W535F + D482N, P427L + W535F, P427L + C530G og P427L + C530G + W535F er gitt i sekvenslisten (se også SEQ ID NO:28, 29, 30, 31, 32 og 33). Nukleinsyremolekyler som koder for villtype SLO kan også bli isolert fra den hensiktsmessige S. pyogenes bakterien ved anvendelse av standard nukleinsyre renseteknikker eller kan bli syntetisert ved anvendelse av en amplifikasjonsteknikk, som polymerasekjede reaksjon (PCR), eller ved anvendelse av en automatisk syntetiseringsinnretning. Se Caruthers et al., Nucl. Acids Res. Symp. Ser , 1980; Horn et al. Nucl. Acids Res. Symp. Ser , 1980; Hunkapiller et al., Nature 310, , 1984; Grantham et al. Nucleic Acids Res. 9, r43-r74, [0028] cdna molekyler kan bli dannet med standard molekylær biologiske teknikker ved anvendelse av mrna som et templat. cdna molekylene kan deretter bli replikert ved anvendelse av molekylære biologiske teknikker som er velkjente innenfor fagområdet. En amplifikasjonsteknikk, så som PCR, kan bli anvendt for å oppnå ytterligere kopier av polynukleotidene ifølge oppfinnelsen for anvendelse av enten genomisk DNA eller cdna som et templat. [0029] Om ønskelig kan polynukleotider bli omkonstruert ved anvendelse av metoder generelt kjent innenfor fagområdet for å endre de antigen-kodende sekvensene av forskjellige grunner, inkludert men ikke begrenset til, endringer som modifiserer koling,

11 10 prosessering og/eller ekspresjon av polypeptidet eller mrna produktet. DNA forflytning ved tilfeldig fragmentering og PCR reoppstilling av genfragmenter og syntetiske oligonukleotider kan bli anvendt for å omkonstruere nukleotidsekvensene. For eksempel kan seterettet mutagenese bli anvendt for å innsette nye restriksjonsseter, endre glykosyleringsmønstre, forandre kodon preferanse, produsere spleisevarianter, introdusere mutasjoner og så videre. [0030] Sekvensmodifikasjoner, så som tilføring av en rensnings tag sekvens eller kodon optimalisering, kan bli anvendt for å lette ekspresjon. For eksempel kan den N-terminale ledersekvensen bli erstattet med en sekvens kodende for et tag protein så som polyhistidin ( HIS ) eller glutation S-transferase ( GST ). Slike tag proteiner kan bli anvendt for å lette rensing, deteksjon og stabiliteten av det uttrykte proteinet. Kodoner foretrukket av en bestemt prokaryot eller eukaryot vert kan bli valgt for å øke raten av protein ekspresjon eller for å produsere et RNA transkript som har de ønskede egenskapene, så som en halveringstid som er lengre enn det til et transkript dannet fra den naturlige forekommende sekvensen. Disse metodene er velkjente innenfor fagområdet og er videre beskrevet i WO 05/0325. Ekspresjonsvektorer [0031] Et nukleinsyremolekyl som koder for et mutant SLO protein kan bli satt inn i en ekspresjonsvektor som inneholder de nødvendige elementer for transkripsjon og translasjon av den innskutte kodende sekvensen. Metoder som er vel kjente for fagfolk innenfor detteområdet kan bli anvendt for å konstruere ekspresjonsvektorer inneholdende kodende sekvenser og hensiktsmessige transkripsjonelle og translasjonelle kontrollelementer. Disse metodene inkluderer in vitro rekombinante DNA teknikker, syntetiske teknikker og in vivo genetisk rekombinasjon. Vertsceller [0032] Vertsceller for produsering av mutante SLO proteiner kan være prokaryote eller eukaryote. E. coli er en foretrukket vertcelle, men andre egnede verter inkluderer Lactococcus lactis, Lactococcus cremoris, Bacillus subtillis, Vibro cholerae, Salmonella typhi, Salmonella typhimurium Neisseria lactamica, Neisseria cinerea, Mycobacteria (f.eks. M. tuberculosis), gjær, bakulovirus, pattedyrceller osv.

12 11 [0033] En vertscellestamme kan bli valgt for dets evne til å modulere ekspresjonen av de innskutte sekvensene eller for å prosessere det uttrykte polypeptidet på ønsket måte. Slike modifikasjoner av polypeptider inkluderer, men er ikke begrenset til, acetylering, karboksylering, glykosylering, fosforylering, lipidering og acylering. Posttranslasjonell prosessering som spalter en prepro form av polypeptidet kan også bli anvendt for å lette korrekt innskudd, folding og/eller funksjon. Forskjellige vertsceller som har spesifikke cellulære maskineri og karakteristiske mekanismer for posttranslasjonelle aktiviteter er tilgjengelig fra American Type Culture Collection (ATCC; Uuniversity Boulevard, Manassas, VA ) og kan bli valgt for å forsikte korrekt modifikasjon og prosessering av et fremmed protein. Se WO 01/ [0034] Ekspresjonskonstruksjoner kan bli introdusert i vertsceller ved anvendelse av veletablerte teknikker som inkluderer, men er ikke begrenset til, transferrin-polykationmediert DNA overføring, transfeksjon med nakne eller innkapslede nukleinsyrer, liposommediert cellulær fusjon, intracellulær transportering av DNA-belagte latekskuler, protoplastfusjon, viral infeksjon, elektroporasjon, gen pistol metoder, og DEAE- eller kalsiumfosfatmediert transfeksjon. [0035] Vertsceller transformert med ekspresjonsvektorer kan bli dyrket under betingelser egnede for ekspresjon og isolering av proteinet fra cellekulturen. Proteinet produsert av en transformert celle kan bli utskilt eller innbefattet intracellulært avhengig av nukleotidsekvensen og/eller ekspresjonsvektoren som blir anvendt. Fagfolk innenfor dette området forstår at ekspresjonsvektorer kan bli konstruert for å inneholde signalsekvenser med direkte sekresjon av oppløselige antigener gjennom en prokaryot eller eukaryot cellemembran. Rensing [0036] Signaleksport sekvenser kan bli inkludert i et rekombinant produsert mutant SLO protein slik at antigenet kan bli renses fra cellekulturmedium ved anvendelse av kjente metoder. Alternativt kan rekombinant produserte mutante SLO proteiner ifølge oppfinnelsen bli isoleres fra omkonstruerte vertsceller og separert fra andre komponenter i cellen, så som proteiner, karbohydrater eller lipider, ved anvendelse av metoder er velkjente innfor fagområdet. Slike metoder inkluderer, men er ikke begrenset til, størrelseseksklusjonskromatografi, ammoniumsulfatfraksjonering, ionebytterkromatografi, affinitetskromatografi og preparativ gel elektroforese. En preparering av rensede mutante SLO proteiner er minst 80 % rene; fortrinnsvis, er prepareringene 90 %, 95 % eller 99 %

13 12 rene. Renheten av prepareringen kan bli vurdert ved hvilken som helst metoder kjent innenfor fagområdet, så som SDS-polyakrylamid gelelektroforese. Hvor hensiktsmessig kan mutante SLO proteiner bli oppløst, for eksempel med urea. Kjemisk syntese [0037] Mutante SLO proteiner kan bli syntetisert, for eksempel ved anvendelse av fast faseteknikker. Se f.eks. Merrifield, J. Am. Chem. Soc. 85, , 1963; Roberge et al., Science 269, , Proteinsyntese kan bli utført ved anvendelse av manuelle teknikker eller ved automatisering. Automatisert syntese kan bli oppnådd, for eksempel ved anvendelse av Applied Biosystems 431 A Peptide Synthesizer (Perkin Elmer). Eventuelt kan fragmenter av et mutant SLO protein bli separat syntetisert og kombinert ved anvendelse av kjemiske metoder for å produsere et fullstrekklengde molekyl. Antistoffer [0038] Som beskrevet heri er antistoffer som spesifikt bindes til et mutant SLO protein ifølge oppfinnelsen men som ikke binder villtype SLO protein. Betegnelsen antistoff inkluderer intakte immunglobulinmolekyler, samt fragmenter derav som har evne til å binde et antigen. Disse inkluderer hybride (kimære) antistoffmolekyler (f.eks. Winter et al., Nature 349, , 1991; U.S. Patent 4,816,567); F(ab )2 og F(ab) fragmenter og Fv molekyler; ikke-kovalente heterodimerer (f.eks. Inbar et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 69, , 1972; Ehrlich et al., Biochem 19, , 1980); enkeltkjede Fv molekyler (sfv) (f.eks. Huston et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85, , 1988); dimere og trimere antistoffragment konstruksjoner; minilegemer (f.eks. Pack et al., Biochem 31, , 1992; Cumber et al., J. Immunology 149B, , 1992); humanisert antistoffmolekyler (f.eks. Riechmann et al., Nature 332, , 1988; Verhoeyan et al., Science 239, , 1988; og U.K. Patentpublikasjon nr. GB , publisert 21. september 1994); og hvilke som helst funksjonelle fragmenter oppnådd fra slike molekyler, samt antistoffer oppnådd gjennom ikke-konvensjonelle prosesser så som fagfremstilling. Det er foretrukket at antistoffene er monoklonale antistoffer. Metoder for oppnåelse av monoklonale antistoffer er velkjente på fagområdet. [0039] Typisk er minst 6, 7, 8, 10 eller 12 påfølgende aminosyrer nødvendig for å danne en epitope. Derimot kan epitoper som involvere ikke-kontinuerlige aminosyrer kreve mere, f.eks. minst 15, 25 eller 50 aminosyrer. Forskjellige immunanalyser (f.eks. Western blots,

14 13 ELISA, radioimmunanalyser, immunohistokjemiske analyser, immunopresipiteringer eller andre immunkjemiske analyser kjent innenfor fagområdet) kan bli anvendt for å identifisere antistoffer som har den ønskede spesifisiteten. En mengde protokoller for konkurrerende binding eller immunradiometriske analyser er velkjent innfor fagområdet. Slike immunanalyser involverer typisk måling av kompleksdannelse mellom en immunogen og et antistoff som spesifikt bindes til immunogenet. En preparering av antistoffer som spesifikt bindes til et mutant SLO protein tilveiebringer typisk et deteksjonssignal på minst 5-, 10- eller 20-ganger høyere enn et deteksjonssignal tilveiebrakt med andre proteiner når anvendt i en immunkjemisk analyse og tilveiebringer ikke et detekterbart signal hvis det kontaktes med et villtype SLO protein. Det er foretrukket at antistoffene ikke detekterer andre proteiner i immunkjemiske analysene og kan immunopresipitere det bestemte antigenet fra løsningn. Dannelse av antistoffer [0040] Mutante SLO proteiner eller ikke-slo polypeptidantigener (beskrevet nedenfor) kan bli anvendt for å immunisere et pattedyr, så som en mus, rotte, kanin, marsvin, ape eller menneske, for å produsere polyklonale antistoffer. Om ønskelig kan et antigen bli konjugert til et bærerprotein, så som bovint serumalbumin, thyroglobulin og keyhole limpet hemocyanin. Avhengig av vertsartene kan de forskjellige adjuvans bli anvendt for å øke den immunologisks responsen. Slike adjuvans inkluderer, men er ikke begrenset til, Freunds adjuvans, mineralgeler (f.eks. aluminiumhydroksid) og overflateaktive forbindelser (f.eks. lysolecitin, pluron polyoler, polyanioner, peptider, oljeemulsjoner, keyhole limpet hemocyanin og dinitrofenol). Blant adjuvans som blir anvendt er humane, BCG (bacilli Calmette-Guerin) og Corynebacterium parvum er spesielt nyttig. [0041] Monoklonale antistoffer som spesifikt bindes til et antigen kan bli fremstilt ved anvendelse av en hvilken som helst teknikk som tilveiebringer produksjon av antistoffmolekyler ved kontinuerlig cellelinjer i kultur. Disse teknikkene inkluderer, men er ikke begrenset til, hybridomteknikken, humane B celle hybridomteknikk og EBV hybridomteknikk (Kohler et al., Nature 256, , 1985; Kozbor et al., J. Immunol. Methods 81, 31 42, 1985; Cote et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 80, , 1983; Cole et al., Mol. Cell Biol. 62, , 1984).

15 14 [0042] I tillegg, kan teknikker utviklet for produksjon av kimære antistoffer, spleising av musantistoffgener til humane antistoffgener for å oppnå et molekyl med hensiktsmessig antigen spesifisitet og biologisk aktivitet, bli anvendt (Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 81, , 1984; Neuberger et al., Nature 312, , 1984; Takeda et al., Nature 314, , 1985). Monoklonale og andre antistoffer kan også bli humanisert for å unngå at en pasient danner en immunrespons mot antistoffet når anvendt terapeutisk. Slike antistoffer kan være tilstrekkelig lik i sekvens med humane antistoffer som blir anvendt direkte i terapi eller kan kreve alterering av noen få nøkkelresidier. Sekvensforskjeller mellom gnager antistoffer og human sekvenser kan bli minimalisert ved erstatning av residier som er forskjellige fra de i de humane sekvensene ved seterettet mutagenese av individuelle residier eller ved grating av hele de komplementære bestemmende regionene. [0043] Alternativt kan humaniserte antistoffer bli produsert ved anvendelse av rekombinante metoder, som beskrevet nedenfor. Antistoffer som spesifikt bindes til et bestemt antigen kan inneholde antigen bindingsseter som er enten delvis eller fullstendig humanisere, som beskrevet i U.S [0044] Alternativt kan teknikker beskrevet for produksjon av enkeltkjede antistoffer bli tilpasset ved anvendelse av metoder kjent innenfor fagområdet for å produsere enkeltkjedeantistoffer som spesifikt bindes til et bestemt antigen. Antistoffer med relatert spesifisitet, men med distinkt idiotypisk sammensetning, kan bli dannet ved kjedeblanding fra tilfeldig kombinatoriske immunoglobulin bibliotek (Burton, Proc. Natl. Acad. Sci. 88, , 1991). [0045] Enkeltkjede antistoffer kan også bli konstruert ved anvendelse av en DNA amplifikasjonsmetode, så som PCR, ved anvendelse av hybridom cdna som et templat (Thirion et al., 1996, Eur. J. Cancer Prev. 5, ). Enkeltkjede antistoffer kan være mono- eller bispesifikke, og kan være bivalente eller tetravalent. Konstruksjon av tetravalente, bispesifikke enkeltkjede antistoffer er beskrevet f.eks. i Coloma & Morrison, Nat. Biotechnol. 15, , Konstruksjon av bivalente, bispesifikke enkeltkjede antistoffer er beskrevet i Mallender & Voss, J. Biol. Chem. 269, , [0046] En nukleotid sekvens kodende for et enkeltkjede antistoff kan bli konstruert ved anvendelse av manuell eller automatisert nukleotid syntese, klonet inn i en

16 15 ekspresjonskonstruksjon ved anvendelse av standard rekombinante metoder og introdusert i en celle for å uttrykke den kodende sekvensen, som beskrevet nedenfor. Alternativt kan enkeltkjede antistoffer bli produsert direkte ved anvendelse av f.eks. filamentøs fagteknologi (Verhaar et al., Int. J. Cancer 61, , 1995; Nicholls et al., J. Immunol. Meth. 165, 81-91, 1993). [0047] Antistoffer som spesifikt bindes til et bestemt antigen kan også bli produsert ved indusering av in vivo produksjon i lymfocytt populasjon eller ved screening av immunoglobulin bibliotek eller paneler med høyt spesifikke bindingsreagenser som beskrevet i litteraturen (Orlandi et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 86, , 1989; Winter et al., Nature 349, , 1991). [0048] Kimære antistoffer kan bli konstruert som beskrevet i WO 93/ Bindingsproteiner som er avledet fra immunoglobuliner og som er multivalente og multispesifikke, så som diabodies beskrevet i WO 94/13804, kan også bli dannet. [0049] Antistoffer kan bli renset ved metoder som er velkjent innefor fagområdet. For eksempel kan antistoffer bli affinitetsrenset ved føring over en kolonne hvortil det relevante antigenet er bundet. De bundede antistoffene kan deretter bli eluert fra kolonnen ved anvendelse av en buffer med en høy saltkonsentrasjon. Farmasøytiske sammensetninger [0050] Oppfinnelsen tilveiebringer også sammensetninger for anvendelse som medikamenter (f.eks. som immunogene sammensetninger eller vaksiner). Sammensetninger ifølge oppfinnelsen er nyttig for forebygging og/eller behandling av sykdommer forårsaket som et resultat av S. pyogenes infeksjon og omfatter minst et aktivt middel, som kan være et polypeptid, et nukleinsyremolekyl eller et antistoff. Nevnte sykdom kan f.eks. være bakteremi, meningitt, puerperalfeber, skarlagensfeber, erysipelas, faryngit, impetigo, nekrotising fascilitis, myositt eller toksisk sjokk syndrom. [0051] Sammensetninger inneholdende mutante SLO proteiner er fortrinnsvis immunogene sammensetninger, og er mere foretrukket vaksine sammensetninger. ph til slike sammensetninger er fortrinnsvis mellom 6 og 8, fortrinnsvis omtrent 7. ph kan bli opprettholdt ved anvendelse av en buffer. Sammensetningen kan være steril og/eller pyrogenfri. Sammensetningen kan være isotonisk med hensyn til mennesker.

17 16 [0052] Vaksiner ifølge oppfinnelsen kan bli anvendt i enten profylaktisk eller terapeutisk, men vil typisk være profylaktisk. Følgelig inkluderer oppfinnelsen en fremgangsmåte for terapeutisk eller profylaktisk behandling av en Streptococcus pyogenes infeksjon. Dyret er fortrinnsvis et pattedyr, mest foretrukket et menneske. Fremgangsmåtene involverer administrering til dyret en terapeutisk eller profylaktisk mengde av de immunogene sammensetningene ifølge oppfinnelsen. [0053] Noen sammensetninger ifølge oppfinnelsen omfatter et polypeptid mutant SLO protein som beskrevet heri. Andre sammensetninger ifølge oppfinnelsen omfatter et nukleinsyremolekyl som koder for det mutante SLO proteinet(ene) og eventuelt andre antigener som kan bli inkludert i sammensetningen (se nedenfor). Se f.eks. Robinson & Torres (1997) Seminars in Immunologi 9: ; Donnelly et al. (1997) Ann. Rev Immunol 15: ; Scott-Taylor & Dalgleish (2000) Expert Opin Investig Drugs 9: ; Apostolopoulos & Plebanski (2000) Curr Opin Mol Ther 2: ; Ilan (1999) Curr Opin Mol Ther 1: ; Dubensky et al. (2000) Mol Med 6: ; Robinson & Pertmer (2000) Adv Virus Res 55:1-74; Donnelly et al. (2000) Am J Respir Crit Care Med 162(4 Pt 2):S ; Davis (1999) Mt. Sinai J. Med. 66: Typisk er nukleinsyremolekylet et DNA molekyl, f.eks. i form av et plasmid. [0054] I noen utførelsesformer kan sammensetningen ifølge oppfinnelsen inkludere en eller flere ytterligere aktive midler. Slike midler inkluderer, men er ikke begrenset til, (a) et annet mutant SLO protein ifølge oppfinnelsen, (b) et polypeptid antigen som er nyttig i en pediatrisk vaksine, (c) et polypeptid antigen som er nyttig i en vaksine for eldre eller immunokomprimerte individer, (d) et nukleinsyremolekyl kodende for (a)-(c), og et antistoff som spesifikt bindes til (a)-(c). Ytterligere antigener [0055] Sammensetningene ifølge oppfinnelsen kan bli administrert i sammenheng med en eller flere ytterligere antigener for anvendelse i terapeutiske eller profylaktiske metoder ifølge foreliggende oppfinnelse. Egnede antigener inkluderer de som er oppført nedenfor. I tillegg kan sammensetningene ifølge foreliggende oppfinnelse bli anvendt for å behandle eller forebygge infeksjoner forårsaket av hvilke som helst av de nedenfor anført patogenene. I tillegg til kombinasjonen med antigenene beskrevet nedenfor, kan sammensetningene ifølge oppfinnelsen også bli kombinert med en adjuvans som beskrevet heri.

18 17 [0056] Antigener for anvendelse i oppfinnelsen inkluderer, men er ikke begrenset til, en eller flere av de følgende antigenene angitt nedenfor, eller antigener avledet fra en eller flere av patogenene angitt nedenfor: A. Bakterielle antigener [0057] Bakterielle antigener som er egnede for anvendelse i oppfinnelsen inkluderer proteiner, polysakkarider, lipopolysakkarider og ytre membranbærere som kan bli isolert, renset eller avledet fra en bakterie. I tillegg kan bakterielle antigener inkludere bakterielle lysater og inaktiverte bakterieformuleringer. Bakterieantigener kan bli produsert ved rekombinant ekspresjon. Bakterielle antigener inkluderer fortrinnsvis epitoper som er eksponert på overflaten av bakteriene i løpet av minst ett stadium av dets livssyklus. De bakterie antigenene blir fortrinnsvis konservert over multiple serotyper. Bakterielle antigener inkluderer antigener avledet fra en eller flere av bakteriene angitt nedenfor samt de spesifikke antigeneksemplene identifisert nedenfor. [0058] Neisseria meningitides: Meningitides antigener kan inkludere proteiner (så som de identifisert i referansene 1-7), sakkarider (inkludert et polysakkarid, oligosakkarid eller lipopolysakkarid), eller ytre-membran vesikler (referansene 8, 9, 10, 11) renset eller avledet fra N. meningitides serogruppe så som A. C, W135, Y og/eller B. Meningitides protein antigener kan bli valgt fra adhesjoner, autotransportere, toksiner, Fe akvisisjonsproteiner og membranassosierte proteiner (fortrinnsvis integral ytre membranprotein). [0059] Streptococcus pneumoniae: Streptococcus pneumoniae antigener kan inkludere et sakkarid (inkludert et polysakkarid eller et oligosakkarid) og/eller protein fra Streptococcus pneumoniae. Sakkarid antigener kan bli valgt fra serotypene 1, 2, 3, 4, 5, 6B, 7F, 8, 9N, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 15B, 17F, 18C, 19A, 19F, 20, 22F, 23F og 33F. Protein antigener kan bli valgt fra et protein identifisert i WO 98/18931, WO 98/18930, US patent nr , US patent nr , WO 97/43303 og WO 97/ Streptococcus pneumoniae proteiner kan bli valgt fra Poly Histidine triadefamilien (PhtX), Choline Binding Protein familien (CbpX), CbpX trunkater, LytX familien, LytX trunkater, CbpX trunkat-lytx trunkat kimeriske proteiner, pneumolysin (Ply), PspA, PsaA, Sp 128, Sp101, Sp130, Sp125 eller Sp133. [0060] Streptococcus pyogenes (gruppe A Streptococcus): Gruppe A. Streptococcus antigener kan inkludere et protein identifisert i WO 02/34771 eller WO 2005/032582

19 18 (inkludert, men ikke begrenset til, GAS39 (spy0266; gi ), GAS40 (spy0269; gi ), GAS42 (spy0287; gi ), GAS45 (M5005_spy0249; gi ), GAS57 (spy0416; gi ), GAS58 (spy0430; gi ), GAS84 (spy1274; gi ), GAS95 (spt1733; gi ), GAS117 (spy0448; gi ), GAS130 (spy0591; gi ), GAS137 (spy0652; gi ), GAS159 (spy1105; gi ), GAS193 (spy2025; gi ), GAS202 (spy1309; gi ), GAS217 (spy0925; gi ), GAS236 (spy1126; gi ), GAS253 (spy1524; gi ), GAS277 (spy1939; gi ), GAS294 (spy1173; gi ), GAS309 (spy0124; gi ), GAS366 (spy1525; gi ), GAS372 (spy1625; gi ), GAS384 (spy1874; gi ), GAS389 (spy1981; gi ), GAS504 (spy1751; gi ), GAS509 (spy1618; gi ), GAS290 (spy1959; gi ), GAS511 (spy1743; gi ), GAS527 (spy1204; gi ), GAS529 (spy1280; gi ) og GAS533 (spy1877; gi )), fusjoner av fragmenter av GASS M proteiner (inkludert de beskrevet i WO 02/ og Dale, Vaccine (1999) 17: , og Dale, Vaccine 14(10): ), fibronektin bindingsprotein (Sfbl), Streptococcal heme-assosiert protein (Shp), og Streptolysin S (SagA). Ytterligere GASS antigener inkluderer GAS68 (Spy0163; gi ), GAS84 (Spy1274; gi ), GAS88 (Spy1361; gi ), GAS89 (Spy1390; gi ), GAS98 (Spy1882; gi ), GAS99 (Spy1979; gi ), GAS102 (Spy2016, gi ), GAS146 (Spy0763; gi ), GAS195 (Spy2043; gi ), GAS561 (Spy1134; gi ), GAS179 (Spy1718, gi ) og GAS681 (spy1152; gi ). [0061] Moraxella catarrhalis: Moraxella antigener inkluderer antigener identifisert i WO 02/18595 og WO 99/58562, ytre membranprotein antigener (HMW-OMP), C-antigen og/eller LPS. [0062] Bordetella pertussis: Pertussis antigener inkluderer petussis holotoksin (PT) og filamentøs haemagglutinin (FHA) fra B. pertussis, eventuelt også i kombinasjon med pertaktin og/eller agglutinogenene 2 og 3 antigen. [0063] Staphylococcus aureus: Staphylococcus aureus antigener inkluder S. aureus type 5 og 8 kapsulære polysakkarider eventuelt konjugert til ikke-toksisk rekombinant Pseudomonas aeruginosa eksotoksin A, så som StaphVAX TM, eller antigener avleder fra overflateproteiner, invasiner (leukocidin, kinaser, hyaluronidase), overflatefaktorer som hemmer fagocyttisk oppsluking (kapsler, protein A) karotenoider, katalase produksjon, protein A, koagulase, koaguleringsfaktor og/eller membranskadende toksiner (eventuelt

20 19 detoksifisert) som lyserer aukaryotiske cellemembraner (hemolysiner, leukotoksin, leukocidin). [0064] Staphylococcus epidermis: S. epidermidis antigener inkluderer slim-assosiert antigen (SAA). [0065] Clostridium tetani (Tetanus): Tenanus antigener inkluderer tatanus toksoid (TT), fortrinnsvis anvendt som er et bærerprotein i sammenheng/konjugert med sammensetningene i den foreliggende oppfinnelse. [0066] Cornynebacterium diphtheriae (Diphtheria): Diphtheria antigener inkluderer difteri toksin, fortrinnsvis detoksifisert, så som CRM197. I tillegg antigener som har evne til å modulere, hemme eller assosiere med ADP ribosylering er kontemplert for kombinasjon/koadministrering/konjugasjon med sammensetningene for den foreliggende oppfinnelse. Difteritoksinene kan bli anvendt som bærerproteiner. [0067] Haemophilus influenzae B (Hib): Hib antigener inkluderer et Hib sakkarid antigen. [0068] Pseudomonas aeruginosa: Pseudononas antigener inkluderer endotoksin A, Wzz protein, P. aeruginosa LPS, mer spesielt LPS isolert fra PAO1 (O5 sterotype), og/eller ytre membranproteiner, inkludert ytre membran proteiner F (OprF) (Infect Immun May; 69(5): ). [0069] Legionella pneumophilia. Bakterielle antigener kan bli avledet fra Legionella pneumophila. [0070] Streptococcus agalactiae (gruppe B Streptococcus): Gruppe B Streptococcus antigener inkluderer et protein eller et sakkarid antigen identifisert i WO 02/34771, WO 03/093306, WO 04/ eller WO 2005/ (inkludert proteinene GBS 80, BGS 104, GBS 276 og BGS 322 og inkludert sakkarid antigener avledet fra serotypene Ia, Ib, Ia/c, II, III, IV, V, VI, VII og VIII). [0071] Neiserria gonorrhoeae: Gonorrhoeae antigener inkluderer (eller porin) protein, så som PorB (se Zhu et al., Vaccine (2004) 22: ), et overføringsbindingsprotein, så som TbpA og TbpB (Se Price et al., Infection and Immunity (2004) 71(1): ), et opasitetsprotein (så som Opa), et reduksjonsmodifiserbart protein (Rmp) og ytre membran vesikkel (OMV) prepareringer (se Plante et al., J Infectious Disease (2000) 182: ) se også f.eks. WO99/24578, WO99/36544, WO99/57280, WO02/079243). [0072] Chlamydia trachomatis: Chlamydia trachomatis antigener inkluderer antigener avledet fra serotypenes A, B, Ba og C (midler av trachoma, en årsak til blindhet), serotypene L1, L2 & L3 (assosiert med Lymphogranuloma venereum) og serotyper, D-K. Klamydia trachomas antigener kan også inkludere et antigen identifisert i WO 00/37494,

21 20 WO 03/049762, WO 03/ eller WO 05/002619, inkludert PepA (CT045), LcrE (CT089), ArtJ (CT381), DnaK (CT396), CT398, OmpH-lignende (CT242), L7/L12 (CT316), OmcA (CT444), AtosS (CT467), CT547, Eno (CT587), HrtA (CT823) og MurG (CT761). [0073] Treponema pallidum (Syphilis): Syphilis antigener inkluderer TmpA antigen. [0074] Haemophilus ducreyi (forårsaker chancroid): Ducreyi antigneer inkluderer ytre membranprotein (DsrA). [0075] Enterococcus faecalis eller Enterococcus faecium: Antigenene inkluderer en trisakkarid gjentagelse eller andre enterococcus avledede antigener tilveiebrakt i US patent nr [0076] Helicobacter pylori: H. pylori antigneer inkluderer (Cag, Vac, Nap, HopX, HopY og/eller urease antigen. [0077] Staphylococcus saprophyticus: Antigener inkluderer 160 kda hemagglutinin av S. saprophyticus antigen. [0078] Yersinia enterocolitica antigener inkluderer LPS (Infect Immun August; 70(8): 4414). [0079] E. coli: E coli antigener kan bli avledet fra enterotoksigen E. coli (ETEC), enteroaggregativ E. coli (EAggEC), diffust adherende E. coli (DAEC), enteropatogen E. coli (EPEC) og/eller enterohemorrhagisk E. coli (EHEC). [0080] Bacillus anthracis (anthrax): B. anthracis antigener blir eventuelt detoksifisert og kan bli valgt fra A-komponenter (dødelig faktor (LF) og ødem faktor (EF)), idet begge kan dele en felles B-komponent kjent som beskyttende antigen (PA). [0081] Yersinia pestis (plakk): Plakk antigener inkluderer F1 kapsulært antigen (Infect Immun Jan; 71(1)): , LPS (Infect Immun Oct; 67(10: 5395), Yersinia pestis V antigen (Infect Immun Nov; 65(11): ). [0082] Mycobacterium tuberculosis. Tuberkulose antigener inkluderer lipoproteiner, LPS, BCG antigener, et fusjonsprotein av antigen 85B (Ag85B) og/eller ESAT-6 eventuelt formulert i kationiske lipid vesikler (Infect Immun 2004 October; 72(10): 6148), Mycobacterium tuberculosis (Mtb) isocitrat dehydrogenase assosierte antigener (Proc Natl Acad Sci U S A Aug 24; 101(34): 12652), og/eller MPT51 antigener (Infect Immun July, 72(7): 3829). [0083] Rickettsiaki: Antigener inkluderer ytre membranproteiner, inkludert ytre membranprotein A og/ellrr B (OmpB) (Biochim Biophys Acta Nov 1; 1702(2): 145), LPS og overflateprotein antigen (SPA) (J Autoimmun Jun; 2 Suppl:81).

22 21 [0084] Listeria monocytogenes: Bakterielle antigener kan bli avledet fra Listeria monocytogener. [0085] Chlamydia pneumoniae: Antigenene inkluderer de som er identifisert i WO 02/ [0086] Vibrio cholerae: Antigener inkluderer proteinase antigener, LPS, spesielt lipopolysakkaridene til Vibrio cholerae II, O1 Inaba O-spesifikke polysakkarider, V. cholera O139, antigener av IEM 108 vaksinen (Infect Immun Oct; 71(10): ) og/eller Zonula okkludens toksin (Zot). [0087] Salmonella typhi (tyfoid feber): Antigener inkluderer kapsulære polysakkarider fortrinnsvis konjugater (Vi, dvs. vax-tyvi). [0088] Borrelia burgdorferi (Lym sykdom): Antigener inkluderer lipoproteiner (så som OspA, OspB, Osp C og Osp D), andre overflateproteiner så som OspE-relaterte proteiner (Erps), dekorin-bindende proteiner (så som DbpA) og antigene variable VI proteiner, så som antigener assosiert med P39 og P13 (et integral membranprotein, Infect Immun May; 69(5): ), VisE Antigenic Variation Protein (J Clin Microbiol Dec; 37(12): 3997). [0089] Porphyromonas gingivalis: Antigener inkluderer P. gingivalis ytre membranprotein (OMP). [0090] Klebsiella: Antigener inkluderer et OMP, inkludert OMP A, eller et polysakkarid eventuelt konjugert til tetanus toksoid. [0091] Ytterligere bakterielle antigener ifølge oppfinnelsen kan være kapsulære antigener, polysakkaridantigener eller proteinantigener av hvilke som helst av de ovennevnte. Ytterligere bakterielle antigener kan også inkludere en ytre membranvesikkel (OMV) preparering. Ytterligere antigener inkluderer levende attenuerte og/eller rensede versjoner av hvilke som helst av ovennevnte bakterier. Antigenene ifølge oppfinnelsen kan bli avledet fra gram-negative eller gram-positive bakterier. Antigenene ifølge foreliggende oppfinnelse kan bli avledet fra aerobe eller anaerobe bakterier. [0092] I tillegg kan hvilke som helst av ovennevnte bakterielle avledede sakkarider (polysakkarider, LPS, LOS eller oligosakkarider) bli konjugert til et annet middel eller antigen, så som et bærerprotein (f.eks. CRM 197). Slik konjugasjon kan være direkte konjugasjon oppnådd ved reduktiv aminering av karbonylgrupper på sakkaridet til aminogrupper på proteinet, som tilveiebrakt i US-patent no. 5,360,897 og Can J Biochem Cell Biol May; 62(5): Alternativt kan sakkaridene bli konjugert gjennom en linker, så som, med succinamid eller andre bindinger tilveiebrakt i Bioconjugate Techniques, 1996 and CRC, Chemistry of Protein Conjugation and Cross-Linking, 1993.

23 22 B. Virale antigener [0093] Virale antigener egnede for anvendelse i oppfinnelsen inkluderte inaktiverte (eller drepte) virus, attenuert virus, split virusformuleringer, renset subenhetsformuleringer, virale proteiner som kan bli isolert, renset eller avledet fra et virus, og viruslignende partikler (VLPs). Virale antigener kan bli avledet fra viruser propagert på cellekulturen eller annet substrat. Alternativt kan virale antigener bli uttrykt rekombinant. Virale antigener inkluderer fortrinnsvis epitoper som blir eksponert på overflaten av viruset i løpet av minst ett stadium av dets livssyklus. Virale antigener blir fortrinnsvis konservert over multiple serotyper eller isolater. Virale antigener inkluderer antigener avledet fra en eller flere av virusene angitt nedenfor samt de spesifikke antigeneksemplene identifisert nedenfor. [0094] Orthomyxovirus: Virale antigener kan bli avledet fra et Orthomyxovirus, så som influensa A, B og C. Orthomyxovirus antigener kan bli valgt fra en eller flere av de virale proteinene, inkludert hemagglutinin (HA), neuraminidase (NA), nukleoprotein (NP), matriksprotein (M1), membranprotein (M2), en eller flere av transkriptase komponentene (PB1, PB2 og PA). Foretrukne antigener inkluderer HA og NA. [0095] Influensaantigener kan være avledet fra interpandemi (årlige) influensastammer. Alternative influensaantigener kan bli avledet fra stammer med potensiale til å forårsake et pandemisk utbrudd (dvs. influensastammer med nytt haemagglutinin sammenlignet med haemagglutinin i for tiden sirkulerende stammer, eller influensastammer som er patogene i fugler og som har potensiale til å bli overført horisontalt i den humane populasjonen, eller influensastammer som er patogene for mennesker). [0096] Paramyksoviridaeviruser. Virale antigener kan bli avledet fra paramyksoviridaeviruser, så som pneumoviruser (RSV), Paramyxoviruses (PIV) og Morbilliviruses (meslinger). [0097] Pneumovirus: Virale antigener kan være avledet fra et pneumovirus, så som respiratorisk synsytialvirus (RSV), bovint respiratorisk synsytialvirus, pneumonivirus fra mus og tyrkisk rhinotracheitis virus. Foretrukket pneumovirus er RSV. Pneumovirus antigener kan bli valgt fra en eller flere av de følgende proteiner, inkludert overflateproteinene fusjon (F), glykoprotein (G) og lite hydrofobprotein (SH, matriksproteinene M og M2, nukleokapsidproteinene N, P og L og ikke-strukturelle proteiner NS1 og NS2. Foretrukne pneumovirusantigener inkluderer F, G og M. Se f.eks. J Gen Virol Nov. 85(Pt 11):3229). Pneumovirusantigener kan også bli formulert i eller avledet fra kimære