NOTAT. DN-notat 6-2011. Anvendelse av forbedrede frysemetoder for laksemelke i genbank for villaks

NOTAT DN-notat 6-2011 Anvendelse av forbedrede frysemetoder for laksemelke i genbank for villaks

Anvendelse av forbedrede frysemetoder for laksemelke i genbank for villaks Notat 6-2011 Utgiver: Direktoratet for naturforvaltning Dato: Januar 2012 Antall sider: 21 Emneord: Frossen genbank, sæd, laks, levende genbank, genetisk variasjon, stamfiskhold, produksjonskapasitet Keywords: Cryopreservation, sperm, salmon, gene bank, genetic variation, brood stock, production capacity Bestilling: Direktoratet for naturforvaltning, postboks 5672 Sluppen, 7485 Trondheim Telefon: 73 58 05 00 Telefaks: 73 58 05 01 www.dirnat.no/publikasjoner Refereres som: Anvendelse av forbedrede frysemetoder for laksemelke i genbank for villaks Notat 6-2011 EKSTRAKT: Ny frysemetode av melke utviklet av Geno, markedsført av Cryogenetics, er så god at frossen melke kan brukes direkte i produksjon nesten på linje med fersk melke. Dette er interessant for genbanken fordi det kan gi genetiske og kapasitetsmessige fordeler. Genetisk er det en fordel å kunne bruke 1. generasjons melke i produksjonen, også i stammer som holdes over flere generasjoner, og på den måten dempe virkningen av uønsket seleksjon i anlegg. Vi fant at nedfrysing av melke fra 100 hanner pr dag var et fornuftig nivå både for genbanken og Cryogenetics. Flaskehalsene for hurtig gjennomføring var transport av melke og nedfrysingstempo. ABSTRACT: A new freezing method of salmon sperm developed by Geno, marketed by Cryogenetics is so good that frozen milk can be used directly in production almost on line with fresh milk. This is interesting for the gene bank as it may provide genetic and capacity benefits. We found that cryopreservation of milt from 100 males per day was a reasonable level for both the Gene Bank and Cryogenetics. Bottlenecks for effective implementation were the transport of milk and freezing capacity at Cryogenetics. Forfatter: Bjørn Bjøru, Veterinærinstituttet ISBN (Trykt): 978-82-8284-007-1 ISBN (PDF): 978-82-8284-008-8 ISSN (Trykt): 0802-1546 ISSN (PDF): 1890-7628 Layout: Guri Jermstad AS Alle foto: Veterinærinstituttet 2

Forord Genbank for laks er et viktig virkemiddel for å bevare genvariasjonen fra norske laksevassdrag for fremtidige generasjoner og reetablering i friskmeldte vassdrag. Direktoratet for naturforvaltning startet i 1986 arbeidet med å etablere slike genbanker. Vi har to typer genbanker i Norge; frossen genbank og levende genbank. Cryogenetics AS har utviklet arbeidsmetoder, prosedyrer og protokoller som kan få praktiske konsekvenser for både levende og frossen genbank. Ved anvendelse av ny fryseteknologi, pakking og lagringsmetoder, er det mulig å oppnå høy og forutsigbar befruktningsevne på frosset melke som i praktisk genbankdrift konkurrerer med fersk melke. Dette åpner muligheter for bedre utnyttelse av ressursene på anleggene, styrke sikkerheten i bevaringsarbeidet og produksjonen samt øke den totale genetiske bredden fra de enkelte populasjonene. For å klargjøre hvordan vi skal tilnærme oss og implementere denne teknologien i vårt arbeid, har Veterinærinstituttet utført en del praktiske tester som blir presentert i denne rapporten. Trondheim, desember 2011. Yngve Svarte Direktør, artsforvaltningsavdelingen i DN 3

Innhold Forord... 3 Sammendrag... 5 Summary... 5 1 Innledning... 6 2 Gjennomføring av forsøket... 6 2.1 Fisk brukt... 6 2.2 Stryking og transport... 6 2.3 Melkekvalitet... 7 2.4 Frysing... 7 2.5 Tining og befruktning... 8 3 Resultat... 8 3.1 Befruktning... 8 3.2 Melkekvalitet og mengde... 9 3.3 Logistikk og ressursbehov...10 4 Konsekvenser og muligheter...12 4.1 Melkebehov...12 4.2 Gjennomføring av framtidig stryking...13 4.3 Produksjon og biomasse...13 4.4 Sikkerhet...13 5 En generell vurdering av genetiske fordeler og ulemper ved å erstatte hanner med frossen melke...14 5.1 Fordeler...14 5.2 Negative virkninger...14 5.3 Hvordan redusere negative virkninger...14 5.4 Konklusjon...14 6 Anbefalinger til DN...15 7 Referanser...15 8 Vedlegg 1. Befruktningsforsøk frosset melke. Vurdering av ny metode fra Cryogenetics...16 4

Sammendrag Ny frysemetode av melke utviklet av Geno, markedsført av Cryogenetics, er så god at frossen melke kan brukes direkte i produksjon nesten på linje med fersk melke. Dette er interessant for genbanken fordi det kan gi genetiske og kapasitetsmessige fordeler. Genetisk er det en fordel å kunne bruke 1. generasjons melke i produksjonen, også i stammer som holdes over flere generasjoner, og på den måten dempe virkningen av uønsket seleksjon i anlegg. Det vil også kunne sikre likt bidrag fra alle familier og individer. Ved å redusere biomassen av hanner, vil man kunne frigi kapasitet til flere stammer eller større rognproduksjon ved å øke biomassen hunner. For å avklare muligheten til å erstatte levende hanner med frossen melke i levende genbank gjennomførte vi et større forsøk med nedfrysing og befruktning sesongen 2010/2011. Målsettingen var å tydeliggjøre kostnader, tidsbruk, utfordringer knyttet til logistikk, samt å se på hvordan et samarbeid med Cryogenetics ga genbanken nødvendig kontroll og dokumentasjon. Stryking av hannene til frysing medførte lite ekstra arbeid. Transport av melken medførte økte kostnader og utfordringer knyttet til logistikk. Vi fant at nedfrysing av melke fra 100 hanner pr dag var et fornuftig nivå både for genbanken og Cryogenetics. Flaskehalsene for hurtig gjennomføring var transport av melke og nedfrysingstempo. Summary A new freezing method of salmon sperm devel oped by Geno, marketed by Cryogenetics is so good that frozen milk can be used directly in production almost on line with fresh milk. This is interesting for the gene bank as it may provide genetic and capacity benefits. Genetically, it is advantageous to use 1 generation sperm in production, even in stocks that are held over several generations, and thus reduce unwanted selection over generations. The access to frozen sperm will also ensure equal contribution of all families and individuals. By reducing the biomass of males the Gene bank will achieve capacity for more stocks or greater egg production by increasing the biomass of females. To clarify the potential to replace living males with frozen milk in the living gene bank, we conducted a larger experiment with freezing and insemination season 2010/2011. The aim was to clarify the costs, time, challenges related to logistics, as well as looking at how a partnership with Cryogenetics gave the Gene Bank required control and documentation. Stripping of the males to freezing resulted in little additional work. Transport of milk resulted in increased costs and challenges related to logistics. We found that cryopreservation of milt from 100 males per day was a reasonable level for both the Gene Bank and Cryogenetics. Bottlenecks for effective implemen tation were the transport of milk and freezing capacity at Cryogenetics. 5

1 Innledning Ny frysemetode av melke utviklet av Geno og markeds ført av Cryogenetics, kan fryse ned større porsjoner laksemelke enn tidligere. Porsjonene kalles squarepack og inneholder rundt tre ml melke. Befruktningsevnen på opptint melke er også meget god. Denne kombinasjonen gir nye muligheter for bruk av frosset laksemelke i levende genbank for villaks. Man kan fryse melke fra unge hanner og frosset melke kan siden brukes direkte i produksjonen. Alle hanner kan slaktes etter at det er frosset nok melke. Dette vil frigi kapasitet til flere hunner og økt rognproduksjon, eller hold av flere stammer på en genbankstasjon. Store lagre frosset melke vil gjøre det mulig og kun bruke første- generasjons hanner i produksjonen, selv for stammer som må holdes flere tiår i genbanken. Dette vil dempe virkningen av uønsket seleksjon i fangenskap. For å klargjøre hvordan man i praksis kan ta i bruk ny frysemetodikk i genbanken, ble det høsten 2010 gjennomført et større nedfrysingsforsøk på genbankstasjonene Haukvik i Sør-Trøndelag og Bjerka i Nordland. Målsettingen var å tydeliggjøre kostnader, tidsbruk, utfordringer knyttet til logistikk, samt å se på hvordan et samarbeid med Cryogenetics ga genbanken nødvendig kontroll og dokumentasjon. 2 Gjennomføring av forsøket 2.1 Fisk brukt Det ble strøket fisk med ulik alder og størrelse. På Haukvik var fisken tre år gammel, 1 familie fra Lærdals elva og 6 fra Vosso. På Bjerka ble det strøket tre årganger, 6, 7 og 8 år gammel fisk fra Fusta. 2.2 Stryking og transport Fisken ble strøket på vanlig måte uten bruk av kateter. Dette ga en hurtigere gjennomføring av strykingen. De tre år gamle fiskene fra Vosso på Haukvik ble vurdert for små til bruk av kateter. Tidligere forsøk med samme metode i 2004 viste gode resultat uten bruk av kateter. Et framtidig forsøk hvor stryking med og uten kateter sammenlignes, er ønskelig for å avklare om kateter gir betydelig kvalitetsforbedring. Fisken ble strøket i et plastbeger og melken helt over i en liten zip-pose. Før posen ble lukket, ble den fylt med vanlig luft. Posene ble lagret i en isoporkasse med is i bunnen, se bilder. 6

2.3 Melkekvalitet Melkekvaliteten ble vurdert visuelt ved stryking ut fra konsistens og farge. Tykk melke har større tetthet av sædceller (Agarwal and Raghuvanshi 2009). Antatt tetthet av sædceller ble vurdert ut fra konsistensen på melke på en skala fra 1-3 hvor; a) 1 er normalt tykk, b) 2 er tynn og c) 3 meget tynn melke. Blod og urininnhold ble vurdert ut fra farge i en skala fra 0-2 hvor; a) 0 er uten blod eller urin, b) 1 er noe blod eller urin og c) 2 er stort innslag av blod eller urin. 2.4 Frysing Melken ble frosset på Hallsteingården i Trondheim. Tetthet av sædceller ble målt og melken fortynnet slik at mengden sædceller i hver enhet ble standardisert. Målet var 4 squarepack og 10 strå fra hvert individ. Dersom det var lite melke ble squarepack prioritert. Strå er godt egnet til befruktning av små rognvolum, som ved innlegging av nye generasjoner. 7

2.5 Tining og befruktning Vossomelke frosset på Haukvik og lagret på Hallsteingården i Trondheim, ble kjørt ned til Eidfjord i to termoser. Individene var sortert på familie. Anbefalt rogn/melke forhold var 2000 rognkorn pr squarepack. Rognporsjonene ble standardisert til 1,65 kg med antatt rognantall på 12400. Til å befrukte dette ble det brukt seks squarepack. Det ble brukt en squarepack fra hver av de seks familiene på hver porsjon. Ved tining ble seks squarepack lagt i vannbad på 25 ºC i 30 sekund. Ved befruktning ble emballasjen til den tinte melken klipt i to. Melken ble tømt over rogna og det hele blandet forsiktig men godt med en plastskje. Etter ca 30 sekunder ble det tilsatt befruktningsvæske. Rogna stod i ro i ti minutter før skylling og behandling med buffodin. Antall rognkorn pr porsjon ble senere beregnet ut fra rogndiameter. Mengde øyerogn, rognvolum og dødrogn ble målt. Andelen øyerogn ble brukt som befruktningsprosent. 3 Resultat 3.1 Befruktning Frossen melke fra Haukvik ble brukt i produk sjonen i Eidfjord flere ganger vinteren 2011. Første innlegget var 5. januar og resultatet er vist i tabell 1. Rognmengden som var antatt å være 12400 pr porsjon viste seg å være 12690 i gjennomsnitt for porsjonene som ble befruktet med frossen melke. Antall rognkorn pr squarepack var 2115 i gjennomsnitt og godt i nærheten av anbefalte 2000 rognkorn. Ved bruk av frossen melke 5. januar ble det i gjennomsnitt oppnådd 83 % overlevelse fra innlegg til øyerogn. Dette er et bra resultat. Til sammenligning var resultatene i produksjon med fersk melke på genbankanleggene sesongen 2009/2010; - 50 % på Eidfjord, - 85-90 % på Bjerka og - 70 % på Haukvik. Overlevelse er ikke synonymt med befruktning da overlevelsen også påvirkes av andre faktorer som sopp, bevegelse og hvor optimalt stryketidspunktet er i forhold til modning. Ved de andre innleggene med frossen melke var overlevelse fra innlegg til øyerogn også rundt 80 %. 8

Tabell 1. Frossen melke fra Haukvik ble brukt i produksjonen i Eidfjord flere ganger vinteren 2011. Første inn legget var 5. januar og resultatet er vist i tabell 1. Rognmengden som var antatt å være 12400 pr porsjon viste seg å være 12690 i gjennomsnitt for porsjonene som ble befruktet med frossen melke. Antall rognkorn pr squarepack var 2115 i gjennomsnitt og godt i nærheten av anbefalte 2000 rognkorn. Type melke porsjon øyerogn pr liter rogn pr porsjon Andel befruktet Rogn pr squarepack Frosset 1 6404 12680 0,77 2113 Frosset 2 6404 12680 0,82 2113 Frosset 3 5981 11842 0,82 1974 Frosset 4 6847 13557 0,91 2260 gjennomsnitt 6409 12690 0,83 2115 Fersk 5 7309 14472 0,77 Fersk 6 6847 13557 0,86 Fersk 7 6847 13557 0,32 Fersk 8 6404 12680 0,55 gjennomsnitt 6852 13566 0,63 3.2 Melkekvalitet og mengde Tydelig innslag av blod og urin observeres visuelt og slik melke antas å ha dårlig kvalitet. Visuell vurdering av konsistensen på melken bidro til etablering av en enkel og funksjonell skala for sortering av melkekvalitet (fig. 1 ). Visuell gradering er følgelig en grei måte å ta ut dårlig melke på. Med god opplæring vil det ikke være nødvendig med en mer grundig sjekk i det praktiske arbeidet ved anleggene. 15 målt tetthet av sædceller (mrd/ml) 10 5 0 1 2 3 Konsistens melke Figur 1. Visuell klassifisering av melke (1 er normalt tykk, 2 er tynn og 3 meget tynn) og målt tetthet av sædceller. 9

Dersom noen hanner skal strykes flere ganger pr sesong kan disse strykes første gang før hunnene er modne. Dette var tilfelle for Vosso i dette forsøket. Vi benyttet ung og relativt liten fisk på Haukvik. Erfaringsmessig har vi et inntrykk av at ung fisk har bedre kvalitet på melken. Tetthet av sædceller fra de ulike årgangene viser det samme (fig. 2), med et forbehold på at det sammenlignes fisk fra ulike anlegg og opphav. Mengden melke som produseres i et kar er avhengig av fiskens størrelse, kjønnsfordeling og andel kjønnsmodne hanner. Dette vil variere med alder, karmiljø og arvbare forskjeller. Andel kjønnsmodne hanner for 3 åringene var svært høy, tilnærmet 100 %. For den eldre fisken 70 %. Mengden melke vi fikk fra hanner med ulik størrelse er vist i fig. 3. Fisken over 70 cm ble ikke strøket helt tom, slik at plottet i fig. 3 viser nedre grense og ikke største mulige volum for den største fisken. Selv om små fisk leverer mindre volum melke, kompenseres dette delvis med økt tetthet. Total mengde spermier i en stryking og måloppnåelse på 4 squarepac er vist i fig. 4. Det er ca 20 mrd sædceller i en squarepack. Vi trenger følgelig 80 mrd for å nå målet på 4 squarepack pr stryking. De fleste fisk over 50 cm gir nok melke. For de som er mindre må en del strykes flere ganger for å oppnå samme resultat. 3.3 Logistikk og ressursbehov Ved stryking på vanlig måte med fem personer og en ekstra person til pakking og lagring av melke ble det strøket 100 hanner på 2,5 timers effektiv arbeidstid. Det gir bare en ekstra innsats på 2,5 timer for frysing av kar vi likevel skal gå gjennom. Dersom hannene er plassert i ulike kar, eller det er modne hunner som må strykes samtidig, vil tidsforbruket øke. For å unngå lang lagring av melken fra stryking til frysing er det trolig ikke hensiktsmessig å stryke mer enn 100 individer pr dag til frysing. Skal det fryses flere pr dag, må kapasiteten på Hallsteingården i Trondheim økes. Stryking av flere hanner medfører også lengre lagringstid på anlegget før transport. Vi kjørte melken selv til Hallsteingården 16 14 tetthet melke (mrd/ml) 12 10 8 6 4 2 0 3 6 7 8 alder (år) Figur 2. Tetthet av sædceller i melke fra fisk av ulik alder. 10

35,0 Volum 30,0 25,0 ml melke 20,0 15,0 10,0 5,0 0,0 0 200 400 600 800 1000 1200 lengde (mm) Figur 3. Mengde melke (ml) på en stryking i forhold til fiskens størrelse. mrd sædceller pr porsjon 320,00 300,00 280,00 260,00 240,00 220,00 200,00 180,00 160,00 140,00 120,00 100,00 80,00 60,00 40,00 20,00 0,00 0 100 200 300 400 500 600 lengde (mm) Figur 4. Antall sædceller på en stryking i forhold til fiskens størrelse. fra henholdsvis Haukvik i Sør-Trøndelag og Bjerka i Nordland. Transporten tok mye tid og er dermed kostbar og ressurskrevende. Frysing må planlegges slik at det passer med transporter vi allerede har, alternativt kan det brukes transportfirma der det er mulig. Transport av fersk melke og frysekapasitet på Hallsteingården er flaskehalsene for rask gjennomføring av storskala nedfrysing. Bruk av kateter vil ta noe lengre tid, dette har vi ikke målt. Kateter er vanskelig på så små fisk som tre-åringer og vil medføre at innfrysing kommer i gang et år seinere. Dersom ikke gevinsten med kateter er betydelig, er vanlig stryking å foretrekke av økonomiske og kapasitetsmessige årsaker. 11

4 Konsekvenser og muligheter 4.1 Melkebehov En squarepack består av tre poser som hver inneholder ca. en ml melke. En slik enhet er anbefalt brukt til 2000 rognkorn. Hvor mye rogn vi skal bruke pr enhet bør vi finne med egne forsøk, 2000 synes lavt. Tidligere forsøk på Haukvik viser at vi kan presse forholdet rogn melke utover det oppgitte (se vedlegg 1). Produksjonen varierer mye mellom individ og stammer, men vi kan generalisere ut fra erfaring. En hunn leverer rogn i gjennomsnitt tre sesonger og en liter rogn pr sesong. Rognstørrelsen varierer med fiskens størrelse, alder samt mellom anlegg og stammer, se figur 5 for eksempel fra Haukvik. Dersom vi går ut fra 6000 rognkorn pr liter, blir dette en livsproduksjon på 18000 rogn. Befruktning av en hunns livsproduksjon krever 6-9 squarepack avhengig av om vi bruker 2 eller 3000 rognkorn pr squarepack. Dersom vi tar utgangspunkt i at kjønnsfordelingen i produksjonen er slik at vi har like mange hanner som hunner, betyr dette at vi må fryse ned 6-9 squarepack pr hann. Dersom rogn størrelsen er mindre må vi fryse flere porsjoner fra hver hann. Alternativt kan vi fryse ned fra flere hanner enn hva vi har av produktive hunner. Vi må da ta vare på flere fisk pr familie opp til den er fire år gammel. For å sikre en mest mulig effektiv bruk av frossen melke, bør det utredes om én enhet frossen melke kan befrukte én volumenhet rogn i stedet for et gitt antall rognkorn. Mengden melke og rogn man har behov for, er avhengig av produksjonsmålet til de ulike elvene. Gitt at reetablering/oppbygging skal skje på fem år og målsettingen er et definert gytebestandsmål, kan vi ut fra modeller kvantifisere mengde befruktet rogn og følgelig nødvendig mengde melke. Dette vil variere mye med størrelsen på den naturlige produksjonen i elvene. Det bør fryses ned nok melke til at man har en reserve i tilfelle reetableringsperioden økes. Frysing i strå eller pellets gir i tillegg flere mindre porsjoner som er egnet til bruk ved innlegg av nye generasjoner i levende genbank. For de store vassdragene er et produksjonsinnlegg på en mill rognkorn pr år, i en oppbyggingsfase på fem år, realistisk. Dette gir et samlet behov på frossen melke på (5 mill/2-3000) 2500-1667 squarepack. Dersom vi fryser åtte squarepack pr hann trenger vi melke fra ca. 210-312 hanner. Det er normalt noe svinn på innlagt rogn pga. sopp og/eller mangelfull befruktning. Levert rogn i dette eksempelet vil anslagsvis være rundt 700 000 rognkorn pr år. For mindre vassdrag og smålaksstammer med lavere produksjonsmål, kan man fryse noe mindre, for eksempel fire squarepack fra like mange hanner, avhengig av produksjonsmål. 12000 10000 rogn pr liter før svelling 8000 6000 4000 2000 0 3 år 4 år 5 år 6 år 10 år alder Figur 5. Antall rognkorn pr liter for fisk av ulik alder. Gjennomsnitt fra Ogna, Byaelva og Figga sesongen 2010/2011. 12

4.2 Gjennomføring av framtidig stryking Det bør fryses melke fra samtlige kjønnsmodne årsklasser og familier. Forsøket viste at vi får en brukbar mengde med melke av tre- åringer, men ikke nok til åtte squarepack. Kvaliteten ser ut til å være best på den yngste fisken. For de stammene der vi skal ha åtte squarepack eller mer pr hann kan disse strykes ved tre- og fire- års alder. Det går fint å stryke hannene flere ganger pr sesong om nødvendig. Trolig er kvaliteten best tidlig i sesongen (Agarwal et al.) 2009). For de stammene der fire squarepack pr individ er nok, kan man fryse ved tre- og fire- års alder på de individene som ikke leverte nok første år. For å unngå seleksjon på tidlig modning, må alle hannene fryses og de som ikke modnes som tre- og fire- åringer må holdes lengre. Dersom vi får problemer med kjønnsmodningsalder, kan kjønnsmodning manipuleres med styrt lyssetting. Forsøk med regnbueørret viser at kvaliteten på melken bedres dersom urinblæra tømmes først (Dietrich et al. 2005). Dette bør vi gjøre til fast rutine og kan være et greit nok alternativ til bruk av kateter. 4.3 Produksjon og biomasse Slakt av hannene etter fire års alder vil fjerne ca. 40 % av biomassen på stamfiskavdelingene. At dette ikke utgjør 50 % skyldes at hunnene lever lengre og har høyere gjennomsnittsvekt. Utslakting av hannene etter nedfrysing av melke, kan redusere den totale biomassen med ca. 30 % i et genbankanlegg. Dette er tall hentet fra Haukvik genbankstasjon i årene 2008 og 2009. Det er flere måter å nyttiggjøre frigjort kapasitet på. Vannforbruket kan reduseres med inntil 30 %. Antall hunner kan økes for hver stamme slik at den totale rognproduksjonen økes med inntil 30 %. Det kan holdes flere stammer i produksjon på samme antall kar og/eller vannforbruk. Separasjon av stammer, årsklasser og til en viss grad størrelsesgrupper, medfører at gevinsten ikke alltid kan tas helt ut. Flere små karenheter i stedet for store kar vil gjøre det lettere å nyttiggjøre ledig kapasitet. Dersom den ledige kapasiteten utnyttes til hold av flere hunner, vil arbeidsmengden i strykesesongen øke fordi hunner er vesentlig tyngre å stryke enn hanner. På samme tid vil imidlertid produksjonsvolumet av rogn øke. Arbeidsinnsats pr liter rogn produsert reduseres derimot da det er lettere å tine melke enn å stryke hanner. 4.4 Sikkerhet Ved å ha melken frosset ned sikrer man tilgang på melke selv om man på anlegget har hatt driftsuhell eller sykdommer som reduserer produksjonskapasiteten. Dersom dødeligheten er større for hanner enn hunner kan dette være verdifullt. Sikkerhet for genetikken er ivaretatt med det som fryses ned med pellets i dag, men ikke like bra som med mer moderne metoder, se kapitel om genetikk. 13

5 En generell vurdering av genetiske fordeler og ulemper ved å erstatte hanner med frossen melke 5.1 Fordeler Med tilgang på frossen melke blir det lettere å styre at alle familier og hanner bidrar likt. Likt bidrag fra individer og familier øker den genetiske bredden på tilbakeført materiale (Wang 1997, Hederich et al. 2000, Woodworth et al. 2002). Ved å fryse ned melke fra 1. generasjons stamfisk vil all produksjon og innlegg av nye familier skje med 1. generasjons melke selv om vi må holde stammen i mange år i genbanken. Ved at hannene ikke holdes i flere generasjoner vil risiko for domestisering og tap av genetisk variasjon reduseres (Sonesson, Goddard og Meuwissen 2002). 5.2 Negative virkninger Det er vist i forsøk at hanner som har sitt opphav i frossen melke har melke som tåler frysing bedre enn andre hanner (Babiak et al. 2002). Sædcellenes egenskaper til å tåle frysing og tining har sannsynligvis en genetisk variasjon. Bruk av frossen melke medfører derfor risiko for en uønsket seleksjon i retning av sædceller som tåler frysing og tining. Hos regnbueørret er det funnet at avkom fra frossen melke ble mer påvirket av stress enn avkom fra ferskmelke, dette kan teoretisk ha sin årsak i seleksjon ved frysing (Hayes et al. 2005). I forsøk med karpe er det funnet haploide avkom hos deformert yngel ved bruk av frossen melke. Andel deformert yngel var ca 15 % og andel haploid yngel av denne 0-6 %. Fryseprosessen kan skade sædcellene slik at avkommet blir haploid (Horvath et al. 2007). Skader på avkom kan imidlertid også forklares med metoder brukt ved tining av melke og temperaturer rogna utsettes for ved befruktning. 5.3 Hvordan redusere negative virkninger Ved å anvende best mulige frysemetode, som skader færrest mulig sædceller og reduserer befruktningsevnen minst mulig, vil risiko for uønsket seleksjon eller påvirkning minimaliseres. Ved å fryse melke fra kun 1. generasjonsfisk i stor bredde, antall og volum vil seleksjonen ved frysing bli mindre enn ved å fryse ned melke over to eller flere generasjoner. 5.4 Konklusjon I en vurdering av sædbank for ørret i Spania, fant man ingen forskjell i genetisk profil mellom avkom fra fersk og frossen melke. Dette tyder på at den genetiske profilen fra frosset melke er representativ for den bestanden man ønsker å bevare. Det ble argumentert med at høy fekunditet vil medføre at nok individer produseres slik at den genetiske profilen opprettholdes (Martinez-Paramo et al. 2009). Ut fra dagens kunnskap om ytelsen til avkom fra frossen melke, ser det ut til at de genetiske fordelene med å bruke frossen melke til omfattende opp bygging av stammer er overveiende større en farene (Young et al. 2009). Hvordan avkom fra frossen melke presterer gjennom livsløpet er lite dokumentert. Hvordan dagens ledene metoder for frysing og tining av melke virker på dette, er det mulig å undersøke i samarbeid med genbanken. 14

6 Anbefalinger til DN Bruk av frossen melke som erstatning for hold av eldre stamfisk kan anbefales både ut fra genetikk og kapasitet. Det er en mulighet for at frysing av melke kan medføre uønsket seleksjon. Dette er et emne som, i den grad det er mulig, bør utredes i samarbeid med Cryogenetics. Det største hinderet for implementering av storskala nedfrysing av melke er kostnadene. For å sikre en mest mulig effektiv bruk av frossen melke, bør det utredes om én enhet frossen melke kan befrukte én volumenhet rogn i stedet for et gitt antall rognkorn. Hvor mye rogn vi skal bruke pr enhet bør også utredes med egne forsøk. For å få erfaring og sikkerhet med metoden, er det startet med noen stammer som er under oppbygging i genbanken, dvs Vosso og Lærdalelva på Haukvik. Dersom erfaringene svarer til forventningene, bør man gjøre tilsvarende med andre stammer for å øke kapasiteten på genbankanleggene. 7 Referanser Agarwal, N. K. and S. K. Raghuvanshi. (2009) Spermatocrit and sperm density in snowtrout (Schizothorax richardsonii): Correlation and variation during the breeding season. Aquaculture, 291.1-2: 61-64. Babiak,I.; Glogowski,J.; Dobosz,S.; Kuzminski,H.; Goryczko,K. (2002) Semen from rainbow Trout produced using cryopreserved spermatozoa is more suitable for cryopreservation. Journal of Fish Biology, 60.3: 561-70. Dietrich G.J,R.Kowalski,M.Wojtczak,S.Dobosz,K. Goryczko and A.Ciere (2005) Motility parameters of rainbow trout (Oncorhynchus mykiss) spermatozoa in relation to sequential collection of milt, time of post-mortem storage and anesthesia. Fish Physiol. Biochem. 31:1-9. Hayes,M.C.; Rubin,S.P.; Hensleigh,J.E.; Reisenbichler, R.R.; Wetzel,L.A. (2005) Performance of juvenile steelhead trout (Oncorhynchus mykiss) produced from untreated and cryopreserved milt. Aquaculture, 249.1-4: 291-302. Hedrick PW, Hedgecock D, Hamelberg S, Croci SJ. (2000) The impact of supplementation in winter-run chinook salmon on effective population size. Journal of Heredity, 91.2 : 112-116. Horvath, A.; Miskolui, E.; Mihalffy, S.; Osz, K.; Szabo, K.; Urbanyi, B. (2007) Cryopreservation of common carp (Cyprinus carpio) sperm in 1.2 and 5 ml straws and occurrence of haploids among larvae produced with cryopreserved sperm. Cryobiology, 54.3: 251-57. Martinez-Paramo, S., et al. (2009) Cryobanking as tool for conservation of biodiversity: Effect of brown trout sperm cryopreservation on the male genetic potential. Theriogenology, 71.4: 594-604. Sonesson, A.K., Goddard, M.E. and Meuwissen, T.H. (2002) The use of frozen semen to minimize inbreeding in small populations. Genetic Research, 80: 27-30. Young, W.P.; Frenyea, K.; Wheeler, P.A.; Thorgaard, G.H. (2009) No increase in developmental deformities or fluctuating asymmetry in rainbow trout (Oncorhynchus mykiss) produced with cryopreserved sperm. Aquaculture 289.1-2: 13-18. Wang, J. (1997) More efficient breeding systems for controlling inbreeding and effective populations. Heredity,79: 591-599. Woodworth LM, Montgomery ME, Briscoe DA, Frankham R (2002) Rapid genetic deterioration in captive populations: Causes and conservation implications. Conservation Genetics, 3. 3: 277-288. 15

8 Vedlegg NOTAT Befruktningsforsøk med frosset melke Vurdering av ny metode fra Cryogenetics Cryogenetics er et selskap opprettet av Aquagen og Geno. Cryogenetics har utviklet en ny frysemetodikk for laksemelke. Høsten 04 testet vi metodikken med tanke på nytte for sædbank og levende genbank for villaks. Hensikten med forsøket var å finne ut hvor mye rogn vi kunne befrukte med frosset melke fra en stryking av en hann. Deretter ønsket vi å få tall på prosent befuktning, og antall rogn befrukta, av en standard mengde rogn (2dl/ca 1100 rognkorn) krysset med en standard mengde melke. Til sammenligning kjørte vi et parallelt forsøk med melke frosset ned som pellets. Det ble brukt hanner fra Rauma 97 årgang og hunner fra Rauma 92 og 94 årgang til forsøket. Rogna ble lagt inn 18. november. Resultatet ble sjekket når rogna var i øyerognstadiet 10. mars Forsøksoppsett Forsøk 1a Porsjoner frosset melke pr stryking Det ble tatt melke fra 6 hanner. Mengden melke fra disse ble standardisert til ca10 ml. Melken ble hentet på Haukvik og fraktet til Hallsteingården og frosset ned av Cryogenetics. Før frysing ble melken fortynnet slik at det ble tilnærmet samme mengde sædceller i hver porsjon. En porsjon er totalt 5ml bestående av melke og ekstender. Vi ønsket å finne hvor mange porsjoner frosset melke blir oppnådd fra hver hann? Forsøk 1b Posemetoden Det ble tatt 3 porsjoner frosset melke fra hver hann. Hver porsjon ble nyttet til befruktning av 2 dl rogn. Rognmaterialet i forsøkene ble produsert ved å stryke 6 hunner. All rogna ble blandet godt før bruk. Ut av denne blandingen ble det tatt ut rognpartier hver på 2 dl. Det var noe prikkrogn i denne rogn blandingen. Rognporsjonene ble krysset med en porsjon frosset melke fra hver hann. Det ble tatt ut en tilfeldig melkeporsjon fra de nedfrossede porsjonene fra hver av hannene. Rogna ble befruktet i rognmottaket utenfor Haukvik genbankstasjon. Rogna ble behandlet med buffodin og sluset inn på anlegget på vanlig måte. Vi ønsket å finne hvor mye rogn som ble befruktet av porsjonen på 2 dl med en porsjon frosset melke. Det ble beregnet absolutt antall befrukta rognkorn og befruktningsprosent. I tillegg ble det brukt tre porsjoner melke fra tre ulike hanner til befruktning av 4 dl rogn, for å se om det var noen nedgang i befruktningsprosent. Forsøk 1c Pelletsmetoden Det ble tatt ut 3ml melke fra de samme 6 hannene som i 1a. Melken ble frosset ned med bruk av Stoss sin metode til pellets. Det ble nyttet 1ampulle (ca 0,9 ml melke) til befruktning av 2dl rogn. Rogna var fra den samme blandingen av rogn beskrevet i 1b. Vi ønsker å finne hvor stor andel av et rognparti på 2 dl blir befruktet ved bruk av melke fra 1 ampulle. Kontroll Fersk melke fra tre hanner Rauma 94 årgang ble brukt til å befrukte tre porsjoner på hver 2dl rogn fra samme rognblanding brukt til forsøket. Rogninnlegg Rogna ble ikke skyldt før befruktning. Etter tilsetting av melke og befruktningsveske stod rogna i 10 minutter før skylling. Til posemetoden ble det brukt natriumhydrogenkarbonat (5,04 g/l) og Tris(hydroxymethyl)-aminomethane (6,06 g/l). Til pellets metoden ble det brukt 1 % natriumhydrogenkarbonat. Rogna ble pakket i vibert esker før desinfisering og desinfisert i en bøtte på vanligmåte. Eskene ble merket b1-18 og c1-18 med sprit tusj. Eskene ble lagt inn i klekkebakker og behandlet som vanlig innlegg. Opptelling av rogn Rogna ble sjokket den 9. mars, den var da tidlig i øyerogn stadiet (54 % utvikling). Deretter ble totalmengde rogn (ml) målt i målesylinder sammen med vann. Neste dag ble rogna kjørt gjennom en rognsorteringsmaskin. Mengden levende rogn ble målt opp i målesylinder. Rogndiameter ble funnet ved å måle antall rogn pr cm, dette ble gjort ved 6 separate uttak av rogn. Ut fra tabell ble antall rogn pr volumenhet utledet fra rogndiameteren (Akvakultur 82, red. Ingebrigsten). Organisering Forsøk 1 a og b ble utført i samarbeid med Aquagen. Forsøk 1 c ble gjennomført som ett separat forsøk i regi av genbanken. 16

Resultat 1.a: Etter fortynning av ca 10 ml melke fra 6 ulike hanner ble resultatet 6-10 porsjoner frosset melke. I gjennomsnitt ble det 0,8 porsjoner melke pr ml fersk melke, se tabell 1. 1.b: Posemetoden ga meget gode resultat ved alle repetisjoner, uavhengig av hvilket individ melken ble frosset ned fra. Forsøk med dobbel rogn mengde dvs. 4 dl eller 2000 rognkorn ga samme resultat som ved 2dl eller 1000 rognkorn (fig. 1). Ut fra forsøket vil 10 ml frosset melke kunne befrukte 4 l rogn. Metoden ga like god eller bedre befruktningssuksess enn kontrollprøvene. 1.c: Pelletsmetoden ga et meget ujevnt resultat. Generelt mye dårligere enn posemetoden. Det var stor variasjon i resultat mellom hannene som ble brukt. Test på samsvar mellom tetthet av spermier og befruktings prosent ga en korrelasjonskoeffisient på 0,6. Variasjon i resultat fra prøver fra samme hann skyldes trolig god og dårlig befukting eller nedfrysing. Se Fig. 2 og 3. Tabell 1. Antall standardporsjoner frosset melke fra fersk melke fra 6 ulike hanner. Fisk nr. Mengde melke Fortynnet til Tetthet(mrd/ml) Antall poser Ml melke pr porsjon 1 9,3 48 10,34 9 1,03 2 9,7 55 11,25 10 0,97 3 8,0 36 9,08 6 1,3 4 9,7 45 9,33 9 1,07 5 10,0 34 6,89 6 1,6 6 9,6 38 7,92 6 1,6 prosent befruktning 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 posemetode 1 2 3 4 5 6 7 8 Hann ID Figur 1. Befruktning i prosent for18 porsjoner frosset melke fra 6 hanner. 3 gjentak pr hann(maks, min og gjennomsnitt) D: dobbel rogn mengde (4 dl rogn) K: kontroll med fersk melke fra 3 hanner. 17

prosent befruktning 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 pellets 1 2 3 4 5 6 hann ID Figur 2. Befruktning i ved bruk av en ampulle frosset melke fra 6 hanner. antall befrukta rognkorn 1400 1200 1000 800 600 400 200 0 pellets 1 2 3 4 5 6 Hann ID Figur 3. Antall rogn korn befruktet ved bruk av en ampulle frosset melke fra 6 hanner. 18

Diskusjon Kontroll Posemetoden ga bedre resultat enn kontrollgruppa. Dette kan være tilfeldig eller skyldes god befruktningsvæske. Hannene brukt til kontroll var 94 årgang og kunne ha dårligere melke enn yngre hanner fra 97 årgang som ble brukt i forsøket. Pellets metoden Pelletsmetoden ga på dette forsøket og tidligere forsøk et resultat som er bra nok til innlegg av nye familier i levende genbank. Unntaket er hann nr. 5 som ga for dårlig resultat i dette forsøket. Vi teller normalt ikke spermier i prøvene slik at ulik spermietetthet kan gi store variasjoner i befruktningsevnen til frosset melke. Det er en sammenheng mellom resultatet til pelletsmetoden og tettheten av spermier i prøvene. Prøve 5 hadde lavest tetthet og prøve 2 hadde høyest tetthet av spermier, de samme prøvene ga henholdsvis dårligst og best resultat. Rognkvaliteten var variabel. Kanskje er pelletsmetoden mer følsom for variasjon i rognkvalitet. Dette kan stemme med tidligere forsøk hvor det ser ut til at det er variasjon i rogna sin evne til å bli befruktet av frosset melke. Rogna ble ikke skyldt for noen av forsøka. Dette kan ha slått ulikt ut ved forskjellig befruktingsveske. Melken til pellets- og poseforsøkene er hentet fra samme hanner til begge frysemetodene. Melken var lagret i plast beger i 3 timer. Først ble det tatt ut 10 ml fra bunnen av koppene til pose forsøket, deretter 3ml fra bunne av koppen til pelletsforsøket. Dersom tettheten til spermiene ikke er likt fordelt i melken kan denne fremgangsmåten gi utslag på resultatet. Tettheten av spermier ble kun målt på melken levert til Cryogenetics. Kan vi ved hjelp av en enkel sentrifuge gi større tetthet av spermier i den melken vi fryser ned? Dette ville gi bedre resultat ved bruk av pellets metoden. Posemetoden Melke frosset med pose metoden kan brukes som fersk melke. Hvor mange poser som trengs til en gitt rognmengde kan vi ikke slå fast etter dette forsøket. To til åtte porsjoner melke vil greie å befrukte den rognmengden som oppnås ved stryking av en hunn; 0,8-3,2 l rogn. Grovt kan vi si at 2-8 ml frosset melke av god kvalitet er nok for 100 % befruktning av normale rognmengder. Hvordan kan vi utnytte posemetoden? Fryse og lagrings kostnader er ukjent og bør avklares. Hva er tidsbruken ved frysing i storskala? Bruk av ny metode vil generelt gi økt sikkerhet, selv om pelletsmetoden nesten alltid gir greit resultat. Melke som uansett skal brukes for å skape stamfisk i levende genbank vil ikke kunne anvendes bedre ved frysing i ny metode. Nytten av metoden vil være vesentlig der vi kan bruke melken uten å gå om stamfiskhold, men bruke den som fersk melke. For utsatte stammer som Driva og Vosso med overskudd av melke kan nedfrysing av store mengder melke gi økt sikkerhet. Dersom det fryses ned melke fra 1. generasjonsfisk i levende genbank kan denne brukers til produksjon foreksempel 30 år senere. Én sesong nedfrysing kan gi nok melke til 1-2 års produksjon. Kan man tenke seg en levende genbank uten hanner? Dersom man fryser ned melke fra en fisk i 5 å, får man nok melke til 5-10 års produksjon fra denne fisken. Dette kan bli dyrt og litt risikabelt. På den annen side vil man ha 1. generasjons hanner i hele produksjonsperioden. Sædbank Ved stryking i felt og nedfrysing på Hallsteingården med ny metode, kan kateter anvendes for å oppnå en ren melke som tåler lagring og frakt. Alter nativt kan melken fryses ned med mobilt fryseutstyr. Samme nytteverdi kan kanskje oppnås ved å fryse ned større porsjoner fra hver fisk med tradisjonell metode. Dette blir en kost nytte vurdering. 19

DN-notat oversikt 2011 2011-6: Anvendelse av forbedrede frysemetoder for laksemelke i genbank for villaks 2011-5: Forvaltningstiltak for ål i Norge. Iverksatte og foreslåtte tiltak 2011-4: Kalking i laksevassdrag. Effektkontroll i 2010. 2011-3: Kalking i laksevassdrag. Effektkontroll i 2010. Sammendragsrapport 2011-2: Register over leverandørar av kalk, utstyr og tenester for kalking av vatn og vassdrag. 2011 2011-1: Reetablering av laks på Sørlandet. Årsrapport fra reetableringsprosjektet 2010 2010 2010-5: Kalking i laksevassdrag. Effektkontroll i 2010. 2010-4: Kalking i laksevassdrag. Effektkontroll i 2009. Sammendragsrapport 2010-3: Blomster og bier = sant - om økosystemtjenesten pollinering 2010-2: Handel med truete arter sjekkliste for CITES 2010 2010-1: Register over leverandørar av kalk, utstyr og tenester for kalking av vatn og vassdrag. 2009 2009 2009-3: Kalking i laksevassdrag. Effektkontroll i 2008. Sammendragsrapport 2009-2: Kalking i laksevassdrag. Effektkontroll i 2008 2009-1: Bestandsutvikling hos sjøørret og forslag til forvaltningstiltak. Notat fra arbeidsgruppe 2008 2008-3: Kalking i laksevassdrag. Effektkontroll 2007. Regionale og vassdragsvise utviklingstrekk 2008-2: Kalking i laksevassdrag. Effektkontroll av større prosjekter 2007 2008-1: Handel med truete arter sjekkliste for CITES 2007 2007 2007-3: Landskonferanse Friluftsliv Kristiansand 30.5.-1.6.2007 2007-2: Kalking i vann og vassdrag. Effektkontroll av større prosjekter 2006 2007-1: Strategi for bruk av midler til tiltak i verneområder 2006 2006-1: Kalking i vann og vassdrag. Effektkontroll av større prosjekter 2005 2005 2005-2: Kalking i vann og vassdrag. Effektkontroll av større prosjekter 2004 2005-1: Handel med truete arter sjekkliste for CITES 2005 2004 2004-3: Landskonferanse Friluftsliv Tromsø 2. 4. juni 2004 2004-2: Kalking i vann og vassdrag - Effektkontroll av større prosjekter 2003 2004-1: Traditional cultural landscapes in the Barents Region - the KNP modell - Report on the initial phase of the project 2003 2003-4: Historien om Songli 2003-3: Kalking i vann og vassdrag - Effektkontroll av større prosjekter 2002 2003-2: Terrengkalkingsprosjektet Årsrapport 2001. Terrengkalking for å avgifte surt overflatevann 2003-1: Handel med truete arter sjekkliste for CITES 2002 2002-3: Fisketrapper i Norge 2002-2: Villaksseminaret 2001. Lærdal 4.-5.september 2001. Gyrodactylus salaris kveletak på laksen? 2002-1: Kalking i vann og vassdrag. Effektkontroll av større prosjekter 2001

KONTAKTINFO Direktoratet for naturforvaltning. Besøksadresse: Tungasletta 2. Postadresse: Postboks 5672 Sluppen, 7485 Trondheim, tlf: 73 58 05 00, faks: 73 58 05 01, e-post: postmottak@dirnat.no, www.dirnat.no Direktoratet for naturforvaltning har sentrale, nasjonale oppgaver og ansvar i arbeidet med å forvalte norsk natur. Det innebærer å bevare naturmangfoldet og legge til rette for friluftsliv og bruk av naturens ressurser. Direktoratet for naturforvaltning er en rådgivende og utøvende etat, underlagt Miljøverndepartementet. Vi har myndighet til å forvalte naturressurser, gjennom ulike lover og forskrifter som Stortinget har vedtatt. Ut over lovbestemte oppgaver har vi også ansvar for å identifisere, forebygge og løse miljø problemer. Direktoratet for naturfor valtning samarbeider med andre myndigheter og gir råd og informasjon til befolkningen.